Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis

Résumé

Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.

Résumé

Le circuit de rétino têtard Xenopus , composé des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans le œil qui font synapses directement sur les neurones dans le tectum optique, est un modèle populaire pour l’étude des circuits neuronaux comment s’auto-assembler. La capacité à réaliser ensemble patch clamp enregistrements de neurones tectal record réponses évoquée par le CJR, soit in vivo de cellules ou en utilisant une préparation de tout le cerveau, a généré un grand nombre de données à haute résolution sur les mécanismes sous-jacents normaux et la formation des circuits anormal et la fonction. Nous décrivons ici comment effectuer la préparation in vivo , la préparation originale de tout le cerveau, et plus récemment développé préparation de tranches de cerveau horizontale pour obtenir des enregistrements de germes entiers patch clamp de neurones opposantes. Chaque préparation a des avantages uniques expérimentales. La préparation in vivo permet l’enregistrement de la réponse directe des neurones opposantes à des stimuli visuels projetés sur le œil. La préparation de tout le cerveau permet les axones RGC être activé de façon très contrôlée, et la préparation de tranches de cerveau horizontal permet l’enregistrement de travers toutes les couches du tectum.

Introduction

Le circuit de rétino est le composant principal du système visuel amphibiens. Il est composé des CGR dans l’oeil, qui projettent leurs axones vers le tectum optique où ils forment des connexions synaptiques avec les neurones post-synaptiques opposantes. Le circuit de rétino têtard Xenopus est un modèle de développement populaire pour étudier la fonction et la formation des circuits neuronaux. Il y a beaucoup d’attributs du circuit rétino de ce têtard qui rendre un puissant modèle expérimental^1,2,3. Un attribut important et la mise au point du présent article, est la capacité de mener des cellules entières patch clamp enregistrements de neurones opposantes, in vivo ou en utilisant une préparation de tout le cerveau. Avec une plate-forme d’électrophysiologie équipée d’un amplificateur qui prend en charge et de courant-potentiel imposé modes d’enregistrement, enregistrements de germes entiers patch clamp permettent électrophysiologie un neurone se caractériser à haute résolution. Ainsi, les cellules entières patch clamp enregistrements de neurones générés à travers les étapes clés de la formation des circuits rétino ont fourni une compréhension détaillée et complète du développement et la plasticité intrinsèque^4,,^{5 , 6 , 7} et synaptique^8,9,10,11 propriétés. Combinant des enregistrements de neurone tectal germes entiers patch clamp, la capacité d’exprimer des gènes ou des morpholinos d’intérêt dans ces neurones¹²et une méthode pour évaluer le comportement visuel de guidée par un évitement visuel établi essai¹³ favorise la identification des liens entre les molécules, fonction du circuit et le comportement.

Il est important de noter que le type de haute résolution données acquises à partir d’enregistrements de pince pour le patch à germes entiers ne sont pas possibles à l’aide de nouvelles approches d’imagerie tels que l’indicateur de calcium génétique GCaMP6, car bien qu’en utilisant des indicateurs de calcium permet l’imagerie de calcium dynamique à travers de grandes populations de neurones en même temps, il est non directe ou pince de manière évidente que les paramètres électriques spécifiques peuvent être obtenues en mesurant la fluorescence delta dans les corps cellulaires et n’a aucun moyen de tension le neurone pour mesurer relations courant-tension. Clairement, ces deux approches distinctes, d’enregistrements électrophysiologiques et imagerie calcique, possèdent des atouts sans chevauchement et générer différents types de données. Ainsi, la meilleure approche dépend de la question expérimentale spécifique abordée.

Ici, nous décrivons notre méthode d’acquisition des cellules entières patch clamp enregistrements des neurones du tectum optique tadpole à l’aide d’une préparation en vivo , préparation de tout le cerveau, et une version plus récente modification préparation de tout le cerveau qui a été mis au point dans notre laboratoire¹⁴ . Dans la section résultats de représentant, nous démontrer les avantages expérimentales de chaque préparation et les différents types de données qui peuvent être obtenues. Les limites et les points forts de les différentes préparations, ainsi que des conseils pour le dépannage, sont inclus dans la section « Discussion ».

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Wyoming. Toutes les procédures, y compris les enregistrements électrophysiologiques, sont réalisées à température ambiante, environ 23 ° C. Toutes les méthodes décrites ici sont optimisés pour l’enregistrement des neurones tectal des têtards entre le stade de développement 42 et 49 (mise en scène selon Neiuwkoop et Faber¹⁵).

1. préparation de in Vivo

1. Anesthésier le têtard.
   1. Placer le têtard dans une petite boîte de Pétri contenant une solution de Steinberg avec 0,01 % MS-222 pendant environ 5 min.
      NOTE : MS-222 aka « Tricaine » est une commune poissons et des amphibiens anesthésique. Les têtards sont déclenchés dans une solution de Steinberg en mM : 0,067 KCl, 0,034 Ca (NO₃)₂•4H₂O, 0,083 MgSO₄•7H₂O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.
   2. Assurez-vous que le têtard est profondément anesthésié (baignade non recevable et non plu) avant de passer à l’étape 2.
2. Fixez le têtard anesthésié à un bloc de silicone submergées sur le plancher du plat dissection/enregistrement.
   1. Utiliser une pipette de transfert jetable pour déplacer le têtard anesthésié pour un plat de dissection/enregistrement contenant la solution d’enregistrement externe (115 mM de NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl₂, 3 mM MgCl₂, 5 mM de HEPES, 1 mM de glucose ; ajuster le pH à 7.25 à l’aide 10 N de NaOH, osmolarité 255 mOsm).
      1. Pour minimiser le muscle spontané TICs, ajouter le bloqueur des récepteurs acétylcholine, tubocurarine (100 µM) à la solution externe. (En général, cela se fait en utilisant une pipette µL 200 pour ajouter 100 µL d’un stock de tubocurarine 10 mM pour 10 mL de solution externe).
   2. À l’aide d’épingles à insectes, sécuriser le têtard, la face dorsale vers le haut, à un bloc submergé d’élastomère de silicone (comme le Sylgard 184, voir Table des matières pour plus de détails), qui a été collé au plancher plat dissection.
      Remarque : L’emplacement des broches est crucial : Placez-les de chaque côté du cerveau, suffisamment caudale pour éviter d’empaler les axones afférents de la CJR, ce projet de le œil et de pénétrer dans le cerveau juste en avant du tectum optique (Figure 1A).
3. Filet du cerveau le long de la ligne médiane.
   1. Pour une vision claire du cerveau, enlever la peau recouvrant le cerveau en faisant une incision superficielle le long de la ligne médiane à l’aide d’une aiguille stérile de 25 G.
   2. Filet du cerveau le long du même axe de la ligne médiane en insérant l’aiguille dans le tube neural et tirer doucement vers le haut (sur le dos) telle que la partie dorsale du tube est proprement coupée (coupée) tout en laissant intacte la plaque de plancher (Figure 1B).
      Remarque : Il est important que la plaque de sol du tube neural laissée intacte parce que les entrées sensorielles afférentes dans le tectum via la plaque de sol.
4. Retirer la membrane transparente ventriculaire qui couvre les neurones opposantes.
   1. Déplacer le plat d’enregistrement au banc d’essai électrophysiologie et utiliser un embout de pipette de verre brisé pour enlever la membrane ventriculaire recouvrant les corps cellulaires de neurones tectal. Casser la pointe en le faisant glisser légèrement à travers un essuie-glace de tâche délicate.
   2. Visser la pipette dans le support de pipette et faites-la glisser vers le bas pour le tectum optique via le micromanipulateur.
   3. Utiliser la pipette cassée à éplucher la membrane ventriculaire de tectum.
      Remarque : Il n’est pas nécessaire d’enlever la membrane sur le tectum ensemble ; une petite fenêtre va suffire et donnent accès à l’abondance des neurones.
5. Obtenir la cellule entière enregistrements de patch clamp.
   Remarque : L’approche à partir de ce moment est similaire à effectuer des enregistrements de germes entiers patch clamp de coupes de cerveau de souris comme décrit dans Segev, et al. ¹⁶ (Figure 1C).
6. Enregistrer les réponses de neurone opposantes à un flash de tout le domaine de la lumière projetée sur la rétine.
   1. Pour projeter un éclair tout le champ de lumière sur la rétine, placez une fibre optique à côté de l’oeil du têtard. À l’autre extrémité de la fibre optique est une LED en ligne avec une résistance variable qui permet de la luminance lumineuse à télécommander. Déclencher la LED de la sortie numérique de l’amplificateur. De cette façon, tout le champ des flashs de différentes intensités de lumière peuvent être enregistré (Figure 4A).

2. tout le cerveau préparation

1. Effectuez les étapes 1.1 à 1.3.
   Remarque : Il est inutile pour la tubocurarine dans la solution externe pour cette préparation.
2. Isoler le cerveau.
   1. Utiliser une aiguille 25 G pour rompre le cerveau postérieur (Figure 2A).
   2. Pour isoler le cerveau entier du têtard, doucement courir l’aiguille sous le cerveau, en direction caudale-à-rostrale de rompre tous les ventral et latéral du tissu conjonctif et fibres nerveuses.
3. Fixez le cerveau à un bloc d’élastomère de silicone.
   1. Une fois complètement libéré, fixez le cerveau à un bloc d’élastomère de silicone en plaçant une broche par l’intermédiaire de l’un des bulbes olfactifs et une autre tige dans le cerveau postérieur (Figure 2B). Il s’agit de la configuration optimale pour l’enregistrement de neurones opposantes.
4. Placez le plat contenant la préparation épinglés cerveau entier de la dissection portée au banc d’essai électrophysiologie. Enlever la membrane ventriculaire à l’aide d’une pipette de verre brisé comme indiqué au point 1.4.
5. Placer une électrode de stimulation bipolaire sur le chiasma optique (où les tracts de l’axone de chaque œil traversent au mésencéphale) pour activer directement les axones RGC.
   1. Placer l’électrode de stimulation bipolaire rostral et presque près, le grand ventricule moyen. Le chiasma optique est situé immédiatement rostral au grand ventricule moyen (Figure 2B).
      1. Doucement abaissez l’électrode de stimulation sur le chiasma optique telle qu’une petite bosse se forme dans les tissus. L’électrode bipolaire est entraînée par un stimulateur d’impulsion qui permet à la force de stimulation à être contrôlée avec précision.
6. Effectuez l’enregistrement de pince de patch de germes entiers (Figure 2C) tel que décrit par Segev, et al. ¹⁶

3. préparation de tranches de cerveau horizontal

1. Effectuez les étapes 2.1 à 2.3.
2. Utilisez une lame de rasoir pour exciser la quatrième plus latérale (qui en vivo correspond à la quatrième dorsale plus) d’un côté du tectum optique un. Cette coupe est faite en parallèle au plan rostral caudal, comme illustré à la Figure 3A.
3. Re-goupille le cerveau du côté de l’élastomère de silicone avec les tranches côté vers le haut (de sorte que les corps cellulaires et la neuropile sont directement accessibles pour l’enregistrement) et la surface ventriculaire du cerveau à l’opposé du bloc élastomère de silicone (Figure 3 B) (de sorte qu’une électrode bipolaire peut être placée sur le chiasma optique).
4. Exécuter le patch clamp de la cellule entière ou enregistrement potentiel classé local (Figure 3C) qu’il décrit par Segev, et al. ¹⁶

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Résultats

Pour enregistrer les réponses évoquée par la lumière, un flash tout le champ de la lumière est projeté sur la rétine tandis que la réponse obtenue est enregistrée de différents neurones tectal (Figure 4A). Ce protocole particulier est conçu pour mesurer les deux la réponse du neurone à la lumière allumer (« On » réponse) et ensuite éteindre le 15 s plus tard pour mesurer la « réponse Off ». Neurones tectal pièce gé...

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Discussion

Toutes les méthodes décrites dans cet ouvrage sont optimisés pour l’enregistrement des neurones tectal des têtards entre le stade de développement 42 et 49 (mise en scène selon Neiuwkoop et Faber¹⁵). Par étape 42, les têtards sont suffisamment vaste et suffisamment développée pour que les insectes broches peuvent être placés sur chaque côté du cerveau in vivo enregistrements et pour mener à bien la dissection du cerveau entier. Aux premiers stades, lorsque les têtards so...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stemi Stereo 508	Zeiss	495009-0006-000	Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"	Finquel	ARF5G	Amphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-1KG	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)	Sigma-Aldrich	237124-500G	Used to prepare Stienberg's solution
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Used to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)	J.T. Baker	2444-01	Used to prepare external recording solution
D-glucose Anhydrous	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrate	Sigma	T2379	Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761028	Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm	Fisher Scientific	AS4052	Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)	BD	305122	Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe	BD	309659	Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glass	Sutter Instrument	BF150-86-10HP	Pulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipes	Kimberly-Clark	34120	Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B	Current clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller	Sutter Instrument	MP-285/T	Control for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)	Thorlabs	M530F2	Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)	FHC	30207	Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex Stimulator	A.M.P.I. (Israel)	Contact manufacturer	Flexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier	Molecular Devices	2500-0157	Amplifier for voltage- and current-clamp recording
Digidata 1322A digitizer	Molecular Devices	2500-135	Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1	Zeiss	491404-0001-000	Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab Table	TMC	63-533	Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit	Dell	D06D001	Computer running electrophysiology software
c2400 CCD camera	Hamamatsu	70826-5	Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades	Gillette	CMM01049	Platinum-coated stainless razor blades
Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-711-7M	Disposable Polyethylene transfer pipets