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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole vise à surveiller par spectrophotométrie trans-plasma membrane transport d’électrons utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire et d’analyser les interactions enzymatiques qui peuvent survenir avec ces accepteurs d’électrons extracellulaire.

Résumé

TRANS-plasma membrane transport d’électrons (tPMET) joue un rôle dans la protection des cellules du stress réductrice intracellulaire ainsi que la protection contre les dommages causés par les oxydants extracellulaires. Ce processus de transport des électrons de réducteurs intracellulaires extracellulaire oxydants n’est pas bien défini. Nous présentons des analyses spectrophotométriques de myotubes C2C12 pour surveiller tPMET utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire : tétrazolium soluble dans l’eau sel-1 WST-1 et 2, 6-dichlorophénolindophénol (DPIP ou DCIP). Grâce à la réduction de ces accepteurs d’électrons, nous sommes en mesure de contrôler ce processus dans une analyse en temps réel. Avec l’ajout d’enzymes telles que l’ascorbate oxydase (AO) et de la superoxyde dismutase (SOD) pour les essais, nous pouvons déterminer quelle partie du tPMET est due à la production de superoxyde ou de l’exportation d’ascorbate, respectivement. WST-1 a montré des résultats stables avec faible bruit de fond, DPIP a pu être ré-oxydé après l’ajout des AO et des mottes de terre, qui a été démontrée avec l’analyse spectrophotométrique. Cette méthode montre un dosage spectrophotométrique multipuit, rapide, en temps réel avec les avantages par rapport aux autres méthodes utilisées pour surveiller les tPMET, tels que ferricyanure (FeCN) et ferricytochrome c réduction.

Introduction

La capacité des membranes de plasma épurés de réduire les accepteurs d’électrons a conduit à l’idée que la membrane plasmique a une capacité inhérente redox1. Vu précédemment dans les champignons, les plantes et animaux, tPMET est un processus commun à plusieurs organismes2,3,4,5. Plus précisément, ce processus a été démontré chez Saccharomyces cerevisiae, cellules de carotte, érythrocytes, lymphocytes, ostéosarcome, mélanome, macrophages, le muscle squelettique et neutrophiles2,3, 4 , 5 , 6 , 7. dans un processus qui transporte les électrons à travers la membrane de plasma pour réduire les oxydants extracellulaires, tPMET est impliqué dans nombreuses fonctions cellulaires, y compris : cellule croissance5,8, de la viabilité cellulaire9, fer métabolisme des10,11,12,13et protection contre l’oxygène réactif espèces12,14,15de signalisation cellulaire. En raison de l’implication de tPMET dans de nombreuses fonctions cellulaires, un déséquilibre de tPMET a émis l’hypothèse pour contribuer au développement de certains troubles de santé graves, y compris le cancer16,17de maladies cardiovasculaires, métaboliques et le syndrome18.

Il y a plusieurs façons de contrôler le transfert des électrons à travers la membrane de plasma, mais la technique la plus largement utilisée est d’évaluer la réduction des accepteurs d’électrons extracellulaire par dosages colorimétriques. Accepteurs d’électrons extracellulaire couramment utilisés sont les sels de tétrazolium, DPIP, FeCN et ferricytochrome c19,20. Le sel de tetrazolium plus couramment utilisé est un deuxième génération connu sel comme WST-119. Ce composé est plus facile à utiliser dans les essais colorimétriques par rapport aux sels de tétrazolium de première génération en raison de deux groupes de sulfonate de perfluorooctane, qui augmentent sa solubilité de l’eau21. WST-1, en liaison avec l’intermédiaire électron accepteur 1-méthoxy-phénazine méthosulfate (mPMS), est réduite dans les événements de transfert d’électron deux. Cette réduction change la forme oxydée de faiblement couleur du WST-1 à une plus intense, jaune de formazan20,22. WST-1 a un coefficient d’extinction molaire élevée de 37 x 103 M-1cm-1, conduisant à un dosage haute sensibilité21,22. DPIP est également utilisé comme un accepteur d’électrons extracellulaire pour surveiller tPMET. Il a été démontré que DPIP peut être réduit extracellulaire par tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs23,24. En raison de l’absence d’accepteurs d’électrons intermédiaire, DPIP peut directement électrons pick-up de la membrane plasmique, contrairement à WST-124. Semblable à DPIP, FeCN s’est avéré extracellulaire réduit à ferrocyanure de tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs19,24. Contrairement à WST-1 et DPIP, FeCN a un coefficient d’extinction molaire bas menant à un plus faible dosage sensibilité9. Un autre accepteur d’électron d’extracellulaire couramment utilisés pour surveiller les tPMET est ferricytochrome c. semblable à WST-1, ferricytochrome c réduction augmente avec l’utilisation d’accepteur d’électrons intermédiaire, mPMS22. Contrairement à WST-1, la méthode de ferricytochrome c est moins sensible en raison d’un haut fond et une extinction molaire faible coefficient22.

Nous présentons ici une méthode d’analyse en temps réel de tPMET par le biais de dosages par spectrophotométrie. La méthode utilisée les accepteurs d’électrons extracellulaire WST-1 et DPIP, car ils ont un coefficient d’extinction molaire élevée tout en étant moins cher par rapport à l’autre couramment utilisé accepteurs d’électrons extracellulaire comme ferricytochrome c. Nous avons utilisé la phénazine méthosulfate (PMS) au lieu de MPM, ils ont une composition chimique similaire et PMS est beaucoup moins cher. mPMS photochimiquement stable qui est une caractéristique importante pour une trousse commerciale qui a besoin d’une longue durée de vie. Toutefois, nous faisons PMS frais pour chaque dosage, donc stabilité ne devrait pas être un problème. Nous présentons aussi une méthode pour évaluer les possibles interactions enzymatiques (voir Figure 1) entre l’accepteur d’électron extracellulaire et des enzymes qui peuvent être utilisés afin de caractériser le processus de tPMET. Plus précisément, les enzymes AO et SOD peuvent servir déterminent quelle partie du tPMET est due à transport ascorbate ou communiqué de superoxyde extracellulaire, deux méthodes courantes pour les électrons d’être transporté à travers la membrane plasmique.

Protocole

Remarque : Voir la Figure 1 pour un aperçu schématique des étapes clés.

1. WST-1 réduction dosage

  1. Croître et se différencier C2C12 cellules adhérentes à l’aide de procédures standard cell culture7 dans une plaque à 96 puits utilisant des lignes A-F.
    1. Utiliser un moyen de différenciation composé de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 2 % de sérum de cheval, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
    2. Participation d’ascorbate dans tPMET de l’analyse, Supplément médias de différenciation avec l’acide ascorbique 100 µM. Permettre aux cellules d’incuber dans des milieux de différenciation pour ~ 24-48 h.
  2. Préparer les solutions WST-1 et PMS.
    1. Pour faire un stock de 10 mM de WST-1, dissoudre 0,033 g de WST-1 (formule poids (FW) : 651.34 g/mol) dans 5 mL de phosphate buffered saline (PBS). Conserver à 4 ° C.
    2. Pour faire un stock de 5 mM du syndrome prémenstruel, dissoudre 0,0023 g du syndrome prémenstruel (FW : 306.34 g/mol) dans 1,5 mL désionisée H2O (diH2O). Conserver à-20 ° C et protéger de la lumière.
  3. Ajouter 0,0108 g de glucose à une concentration finale de 5 mM à 11,4 mL de PBS ou HEPES solution saline tamponnée (HBS ; sel de sodium HEPES 20 mM, 140 mM NaCl, KCl, 2,5 mM MgSO4, 5 mM 1 mM CaCl2). Ajouter 480 µL de 10 mM WST-1 pour une concentration finale de 400 µM et 48 µL de 5 mM PMS pour une concentration finale de 20 µM.
  4. Participation d’ascorbate dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 6 µL de diH2O et dans l’autre partie aliquote ajouter 6 µL de 2 kU/mL AO pour une concentration finale de 2 U/mL.
  5. Participation de superoxyde dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 55 µL de tampon de4 KPO 0,1 M et l’autre partie aliquote Ajouter 55 µL de 6,5 kU/mL SOD pour une concentration finale de 60 U/mL.
  6. Laver les cellules avec du PBS. Aspirer les médias et ajouter 150 µL PBS. Puis aspirer le PBS.
    Remarque : Le test se fait avec cellules plaqués, ci-joint. Il n’y a donc pas de centrifugation ou utilisation de trypsine dans le processus de lavage.
  7. Ajouter 100 µL de solution WST-1 (-) SOD ou (-) AO aux colonnes 1 à 6 et ajouter 100 µL de solution de WST-1 (+) SOD ou (+) AO aux colonnes 7-12 dans la plaque à 96 puits. Utiliser des lignes G et H sous forme de contrôles de fond (par exemple, pour surveiller le changement d’absorbance dans le réactif seul dans les puits sans cellules).
  8. Mesurer les valeurs d’absorption à l’aide du spectrophotomètre toutes les 10 min pendant 1 h à 438 nm.
  9. Après lecture, aspirer les médias et laver chaque fois avec 150 µL de PBS. Puis aspirer le PBS.
  10. Calculer la différence d’absorbance pour chaque puits en soustrayant l’absorbance initiale pour un puits de l’absorbance à n’importe quel point de temps pour ce puits. Corriger ce changement pour le changement d’absorbance (le cas échéant) observé dans les puits de fond (c.-à-d., puits avec solution de dosage mais aucune cellule).
  11. Pour l’analyse, normaliser les données de l’absorbance à la mesure de contrôle de 60 min ou laver les puits avec PBS ou HBS et puis effectuer une analyse de protéine (BCA) acide bicinchoninic.
  12. Ajouter étalon d’albumine sérique bovine (BSA) 2 mg/mL (allant de 0,5 à 2 µL de la courbe d’étalonnage, selon le degré de confluence des cellules) dans les puits vides (lignes G et H), puis ajouter le réactif BCA dans chaque puits.
  13. Quantifier les données via nmol de WST-1 réduction par µg de protéines. Utiliser des 37 mM-1 cm-1 22 comme le coefficient d’extinction pour réduite WST-1 438 nm.

2. test de réduction DPIP

  1. Croître et se différencier des cellules adhérentes C2C12 avec la même procédure que l’étape 1.1.
  2. Préparer la solution DPIP stock 10 mM comme suit. Dissoudre 0,029 g des DPIP (FW : 290.08 g/mol) dans 10 mL de diH2O. confirmer la concentration des DPIP en mesurant l’absorbance à 600 nm avec un spectrophotomètre. Utiliser 1 mM-1 cm-1 23 comme le coefficient d’extinction pour DPIP réduite à 600 nm. Conserver à 4 ° C.
  3. Ajouter 0,0108 g de glucose à 11,880 mL de PBS pour une concentration finale de 5 mM. Ajouter 120 µL de 10 mM DPIP pour une concentration finale de 100 µM.
  4. Participation d’ascorbate dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 6 µL de diH2O et dans l’autre partie aliquote ajouter 6 µL de 2 kU/mL AO pour une concentration finale de 2 U/mL.
  5. Participation de superoxyde dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 55 µL de tampon de4 KPO 0,1 M et l’autre partie aliquote Ajouter 55 µL de 6,5 kU/mL SOD pour une concentration finale de 60 U/mL.
  6. Aspirer les médias et laver les cellules en 150 µL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter 100 µL de solution DPIP (-) SOD ou (-) AO aux colonnes 1 à 6 et ajouter 100 µL de solution DPIP (+) SOD ou (+) AO aux colonnes 7-12 dans la plaque à 96 puits. Utiliser des lignes G et volonté de H comme contrôles de fond (par exemple, pour surveiller le changement d’absorbance dans le réactif seul dans les puits sans cellules).
  7. Mesurer l’absorbance à 600 nm en spectrophotomètre toutes les 10 min pendant 1 h. quantifier la différence d’absorption par rapport au contrôle après 60 min similaire aux étapes 1,9-1.13.

3. déterminer si les accepteurs d’électrons réduits sont des substrats pour AO ou GAZONNIÈRE

  1. Dans 5,436 mL de PBS ou HBS, ajouter 240 µL de 10 mM WST-1 pour une concentration finale de 400 µM et 24 µL de 5 mM PMS pour une concentration finale de 20 µM.
    1. Pour DPIP, ajouter 60 µL de 10 mM DPIP, pour une concentration finale de 100 µM, à 5,940 mL de PBS ou HBS.
  2. Ajouter 100 µL de solution pour chaque bien dans une plaque à 96 puits à fond plat en l’absence de cellules et de mesurer l’absorbance dans un spectrophotomètre à 438 nm, pour le WST-1, ou 600 nm, pour DPIP.
  3. Ajouter 1 µL d’ascorbate de 10 mM à la moitié des puits pour une concentration finale de 100 μM. Surveiller l’absorption jusqu'à ce qu’il se stabilise.
  4. Après stabilisation, ajouter 1 µL de 200 U/mL AO pour une concentration finale de 2 U/mL dans chaque cupule ou ajouter 1 µL de 6 kU/mL SOD pour une concentration finale de 60 U/mL à chaque bien et surveiller l’absorbance pendant 1 h.

Résultats

Statistiques ont été réalisées avec ANOVA à mesures répétées à l’aide de logiciels statistiques RStudio25. Tailles d’échantillon sont indiqués dans les légendes de la figure.

Pour surveiller les tPMET, les myotubes C2C12 étaient utilisés parallèlement accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP. AO a été utilisée pour déterminer quelle partie du WST-1 réduction DPIP r?...

Discussion

Nous avons présenté deux méthodes d’utilisation d’accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP, dans des dosages spectrophotométriques pour surveiller les tPMET dans les myotubes C2C12. Avec la croissance de lignées cellulaires dans les méthodes de culture standard et d’un lecteur de spectrophotomètre, il est possible de surveiller tPMET avec ces accepteurs d’électrons dans un essai simple microplaque. WST-1 réduction est reproductible de puits à puits dans un essai, mais il existe une varia...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino et Neej Patel pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par l’award de l’United States Public Health Service R15DK102122 de l’Institut National du diabète et l’appareil digestif et la Kidney Diseases (NIDDK) à Jonathan Fisher. Le contenu du manuscrit est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NIDDK ou le National Institutes of Health.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

Références

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