Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

Résumé

Nous présentons une méthode automatisée pour une reconstruction tridimensionnelle de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans . Notre méthode détermine le nombre et la position de chacun des noyaux dans les cellules germinales et l’analyses germline PROTÉINE distribution et la structure du cytosquelette.

Résumé

La lignée germinale Caenorhabditis elegans (c. elegans) est utilisée pour étudier plusieurs processus biologiquement importants, y compris la dynamique de développement, l’apoptose et chromosomes cellules souches. Alors que la lignée germinale est un excellent modèle, l’analyse est souvent bidimensionnelle en raison de l’heure et la main-d'oeuvre requise pour l’analyse en trois dimensions. Grands afficheurs dans de telles études sont la nombre et la position des noyaux et la distribution des protéines au sein de la lignée germinale. Nous présentons ici une méthode pour exécuter une analyse automatisée de la lignée germinale, à l’aide de la microscopie confocale et approches informatiques pour déterminer le nombre et la position des noyaux dans chaque région de la lignée germinale. Notre méthode analyse également la distribution de protéines de cellules germinales qui permet l’examen en trois dimensions de l’expression de la protéine dans différents fonds génétiques. De plus, notre étude montre des variations dans l’architecture du cytosquelette dans des régions distinctes de la lignée germinale qui peut tenir compte des exigences spécifiques de développement spatiales. Enfin, notre méthode permet un comptage automatisé du sperme dans la spermathèque de chaque lignée germinale. Pris ensemble, notre méthode permet une analyse phénotypique rapide et reproductible de la lignée germinale de c. elegans .

Introduction

La conservation des voies avec mammifères de signalisation fait c. elegans , un excellent modèle pour étudier plusieurs processus biologiques^1,2. Dans notre laboratoire, nous utilisons la lignée germinale de c. elegans pour étudier le développement de cellules souches, l’apoptose et l’expression des gènes. Alors que la lignée germinale est une structure tridimensionnelle, de nombreuses études sont deux dimensions étant donné la nature de longues et fastidieuse de l’analyse en trois dimensions. Il est fort probable que l’analyse bidimensionnelle peut fausser in vivo d’évenements dans la lignée germinale. L’hermaphrodite adulte de c. elegans a deux branches de la lignée germinale, dont chacune abrite une cellule somatique distale (DTC) qui maintient les cellules germinales distales dans l’État indifférencié^3,4. Ces cellules germinales commencent à faire la différence car ils s’éloigner de la CRN, échapper à son influence et devenir des ovocytes et du sperme qu’ils atteignent l’extrémité proximale de la lignée germinale. Au cours de ce processus, les noyaux de cellules germinales subissent une mitose, avant de passer à la méiose^5,6. La production de spermatozoïdes est complétée par le stade larvaire 4 (L4), la mise au point, après quoi les ovocytes sont produites au cours de l’âge adulte. Les spermatozoïdes sont stockés dans la spermathèque où ils féconder les ovocytes à produire des embryons.

Il y a plusieurs facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent influencer le développement des cellules germinales chez c. elegans , entraînant des changements dans le nombre de noyaux, nombre d’événements apoptotiques, dynamique des chromosomes et expression de la protéine ou localisation^{7 ,8,9,10,11}. L’analyse de ces événements nécessite l’identification de chaque étape de la différenciation basée sur la distribution et de la morphologie nucléaire. Afin d’analyser avec précision ces paramètres manuellement avec un grand échantillon est long et fastidieux. Pour contourner ces inconvénients et activez la cohérence de l’analyse, nous avons développé une méthode automatisée pour examen en trois dimensions de la lignée germinale de c. elegans pour compter les noyaux, distribution de noyaux, expression de la protéine et du cytosquelette structure. En combinant la microscopie confocale à rendu tridimensionnel, nous avons généré des paramètres de taille et de forme pour l’identification de chaque étape de la différenciation des cellules germinales. En outre, cette méthode permet de comptage des noyaux de cellules germinales et sperme plus marqué du nombre de chromosomes dans chaque ovocyte.

Une structure cruciale dans la lignée germinale est le cytosquelette, qui assure la stabilité de la lignée germinale compartiment, la cyclose sida et la protection de noyaux de cellules germinales¹². Utilisant le calcul rendu, nous avons effectué une reconstruction tridimensionnelle du cytosquelette des cellules germinales et identifié les caractéristiques du cytosquelette distinctes au sein de la lignée germinale. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour illustrer comment calcul analyse combinée d’imagerie confocale permet analyse détaillée de la lignée germinale de c. elegans .

Nous proposons une méthode rapide pour l’analyse tridimensionnelle de c. elegans lignée germinale (Figure 1). Selon l’analyse en trois dimensions, il est possible d’étudier la distribution tridimensionnelle des noyaux des cellules germinales (Figure 2 et Figure 3), automatisée comptage des cellules (Figure 2), reconstruction du cytosquelette germinale ( Figure 3), distribution des protéines (Figure 4) et ayant marqué le nombre de chromosomes dans les ovocytes (Figure 5) et de sperme dans la spermathèque. La méthode ne permet un dosage simple et précis de la lignée germinale mais identifie des phénotypes physiologiquement pertinents.

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Protocole

1. préparation et l’élevage du ver

Remarque : Consultez la Table des matières pour toutes les informations.

1. OP50 Escherichia coli culture : la culture de bactéries OP50 dans un bouillon de lysogénie (LB) (1 % de tryptone, levure 0,5 %, 0,5 % de NaCl, pH 7,0) pendant une nuit à 37 ° C, sans antibiotiques.
2. Graines de 400 µL de bactéries OP50 aux plaques de médias (NGM) croissance nématode (à 1,5 g de NaCl, 8,5 g d’agar-agar, 1,25 g de peptone, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL dans de l’éthanol, 1 mL de 1 M MgSO₄ et 25 mL de tampon de₄ M 1 KPO) et sécher à l’air les bactéries pendant 48 h.
3. Prendre vers sur les plaques NGM ensemencés et incuber à 15 ° C ou 20 ° C.
   1. Pour l’analyse de l’adulte germline hermaphrodite, choisissez bien nourris vers L4 à la pelouse bactérienne et incuber une nuit à 20 ° C.
   2. Pour marquer le nombre de spermatozoïdes dans hermaphrodites, incuber vers L4 à 20 ° C pendant 12 h jusqu'à ce que les vers atteignent la mue L4/adulte. Pour synchroniser les vers le stade L4, préparer les œufs en choisissant vers adultes avec beaucoup d’oeufs dans une solution d’eau de Javel (1 NaOH M et eau de Javel dans la proportion 1:1). Laisser les œufs éclosent et choisir L4 animaux pour l’expérience.
4. Préparer des lames de microscope de téflon en plaçant 25 µL de solution de la poly-L-lysine dans la diapositive et encollage bien, la solution en utilisant un embout de la pipette. Après avoir retiré la poly-L-lysine excédentaire avec du papier essuie-tout, laisser les lames à l’air sec et incuber les lames à 65 ° C pendant 15-20 min.

2. cellules germinales Dissection et coloration^6,13

1. Spot 10 µL de 0,01 % Tétramisole (anesthésique) sur une lamelle de 22 × 22 mm et ramasser les vers adultes âgés d’un jours dedans.
2. Disséquer le ver à la queue comme il devient sous sédation à l’aide d’une seringue (5 mL) et une aiguille (24 "x 1") et faire en sorte que les cellules germinales n’est pas endommagé.
   Remarque : La dissection doit être effectuée avant que le ver devient entièrement paralysé alors que la pression négative dans le ver et le mouvement ver aide l’éjection de la lignée germinale. Pour la notation des spermatozoïdes, les précautions doivent être prises ne pas d’endommager la spermathèque par l’aiguille au cours de la dissection. Évitez de toucher la lignée germinale avec l’aiguille à l’exception du point de dissection après la spermathèque. Si il n’y a casser dans le compartiment de cellules germinales ou tout rejet de la lignée germinale est observée, la lignée germinale ne devrait pas servir à l’analyse.
3. Placer la lamelle inversée sur une glissière enduite poly-L-lysine, gardant la lignée germinale disséquée sur la diapositive.
4. Retirer le liquide en excès sous le couvre-objet en plaçant une tour de papier à un angle de la lamelle couvre-objet, puis place la lame dans l’azote liquide pour 1 min. Retirer rapidement la lamelle à l’aide d’une aiguille avec la germlines sur la diapositive.
5. Transférer les lames dans le méthanol de-20 ° C pendant 30-60 s dans une chambre, puis incuber pendant 30 minutes dans une solution fraîchement préparée de fixation (1 x tamponné phosphate salin (PBS) contenant 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO₄, 0,8 mM ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl éther)-N, N, N', N'-tétraacétique acide (EGTA) et 3,7 % de paraformaldéhyde) à température ambiante.
6. Laver les diapositives en plaçant dans une chambre contenant 1 x PBS, pH 7,4 avec 0,1 % Tween-20 à 10 min. répéter cette étape une fois.
7. Bloquer le germlines 30 µL de la solution de blocage (30 % de sérum de chèvre préparé en ajoutant 900 µL de sérum de chèvre en 1700 µL d’eau distillée H₂O et 300 µL de PBS de x 10) dans une chambre humide préparée en plaçant une serviette en papier humide dans une boîte en plastique à température ambiante pendant 30 min.
8. Ajouter 50 µL de solution d’anticorps REC-8 préparée à 30 % de sérum de chèvre dans un rapport 1 : 300 à chaque échantillon. Incuber une nuit à 4° C.
9. Laver les diapositives en plaçant dans une chambre contenant 1 x PBS avec 0,1 % Tween-20 à 10 min. Répétez l’étape une fois et retirer l’excès de liquide en plaçant une serviette en papier à l’angle de la lame.
10. Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant vert fluorophore (488 nm émission longueur d’onde) conjugués anticorps secondaire (1 : 1000), la phalloïdine (coloration de l’actine, 1:4000) et DAPI (coloration de l’ADN, 1:4000) dans le sérum de chèvre normal de 30 %.
11. Ajouter 50 µL de solution d’anticorps secondaire à la diapositive.
12. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
13. Laver les lames deux fois en la plaçant dans une chambre contenant 1 x PBS avec 0,1 % Tween-20 à 10 min. essuyer l’excès de liquide.
14. Ajouter 30 µL de réactif sur le toboggan de fixation et poser un de 12 mm² x 1,5 µm lamelle dessus et sécher les lames à 4 ° C durant la nuit.

3. confocal Microscopy

1. Allumez le microscope confocal, lasers, résonnant scanner et logiciel de microscope confocal. Placez les glissières avec germlines tachée sur le support de diapositive au-dessus de l’objectif X 63.
2. Recherchez une lignée germinale, mise au point sur le dessus de la lignée germinale et marquez-le à l’aide de logiciels de microscope confocal. De même, se concentrer sur la partie inférieure de la lignée germinale et marquez-le pour établir l’épaisseur totale de cellules germinales.
3. Image le germline tout en définissant l’épaisseur de chaque tranche jusqu'à 0,5 µm. Marquez l’acquisition complète de la lignée germinale et démarrer. Numériser chaque tranche 8 fois et la moyenne des valeurs afin d’améliorer la qualité de l’image. Le scanner à résonant permettra une numérisation rapide pour éviter le blanchiment en imagerie. Si le microscope n’a pas un scanner à résonant, réduire le nombre d’analyses à quatre pour éviter la décoloration.

4. après analyse des noyaux d’imagerie nombre et Distribution

Remarque : Reportez-vous supplémentaire Figure 1 pour les captures d’écran des outils logiciels et boutons utilisés.

1. Importez l’image Imaris 8.4.1 ou des versions ultérieures du logiciel.
2. Définir la région mitotique, zone de transition, région méiotique, région de l’ovocyte et spermathèque de la lignée germinale en identifiant la morphologie nucléaire dans chaque région.
3. La touche de fonction surface (complémentaire de la Figure 1 a) du logiciel permet de sélectionner la région d’intérêt.
4. Annulez l’Assistant de création de surface automatique et dessiner manuellement la région d’intérêt à la première et la dernière tranche de l’image de la pile en trois dimensions.
5. Cliquez sur Create aire.
   Remarque : Le logiciel va développer automatiquement les empilements entre la première et la dernière pile.
6. Masquer toutes les chaines sauf DAPI en cliquant sur le bouton de canal masque (Figure supplémentaire 1 b-C).
7. Définissez les paramètres de la taille du noyau à l’aide de la touche de fonction spot (complémentaire de la Figure 1 a). Pour la région mitotique, définir un diamètre XY de 2 µm en laissant diamètre Z indéfini. Pour la zone de transition, définir un diamètre XY de 2 µm et Z comme 1,5 µm. (complémentaire Figure 1).
   NOTE : Dépanner les diamètres selon le grossissement et les spécifications du microscope. Pour le protocole actuel, l’objectif utilisé était de 63 X et fourni un extra de grossissement de 1,70 en imagerie. Si l’objectif change, par exemple 40 X, le diamètre doit être modifié en conséquence. Dépannage doit être réalisée avec germlines de type sauvage d’établir les paramètres corrects. La région mitotique d’un bras de lignée germinale de type sauvage a environ 250 noyaux. Le diamètre doit être modifié pour atteindre cette valeur. Au moins 15 germlines permet de déterminer la valeur optimale pour le diamètre. Une approche similaire devrait être utilisée pour l’étalonnage de la zone de transition (noyaux de 150-170) et la région méiotique (noyaux de 600-700).
8. Limiter la détection de taches en définissant le seuil minimal (1E Figure supplémentaire). Utilisation DAPI teinté germlines de type sauvage pour établir le seuil minimum en augmentant le seuil minimal de rendu tridimensionnel jusqu'à ce que le premier spot apparaît en dehors de la lignée germinale.
9. Enregistrer l’image et obtenir le nombre de noyaux de la table générée automatiquement par le logiciel. Exporter les images sous forme de fichiers TIF.

5. après l’analyse d’imagerie pour la notation des spermatozoïdes et du nombre de chromosomes

1. Exécuter le rendu tridimensionnel en sélectionnant la spermathèque comme la région d’intérêt. Pour détecter chaque spermatozoïde, définir le diamètre du spot entre 0,75 - 1,0 µm pour X et Y-axe, tandis que le diamètre de Z reste indéfini. Utilisez la touche de fonction de taches comme indiqué dans supplémentaire Figure 1.
2. Soustraire l’arrière-plan en cochant fond soustraire la boîte et en utilisant les valeurs de correction de fond calculés par le logiciel (complémentaire Figure 1).
   NOTE : Imaris logiciel pronostics points de forte intensité tout d’abord, l’effet de fond est donc minime tant qu’il y a une différence significative entre la région d’intérêt et de l’arrière-plan. Une deuxième méthode consiste à définir la correction de fond manuellement, le cas échéant des valeurs peut être donnée pour l’arrière-plan. Une correction de fond manuel sera appropriée si l’intensité des échantillons indépendants a besoin de comparaison.
3. Régler le seuil de rendu tridimensionnel pour détecter tout DAPI souillé de sperme dans la spermathèque (1E Figure supplémentaire).
4. Pour compter les chromosomes, définir le diamètre du spot < 0,75 µm pour X et Y-axe avant d’élaborer des modèles en trois dimensions.
5. Enregistrer l’image et les exporter en tant que fichier TIF.

6. après l’analyse d’imagerie pour la Reconstruction du cytosquelette de la lignée germinale

1. Identifier la zone d’intérêt dans la lignée germinale et masquer toutes les chaines sauf la phalloïdine en cliquant sur le bouton masquer des canaux .
2. Décrivez en détail un surface de 0,25 µm en utilisant la touche de fonction surface (supplémentaire Figure 1).
   Remarque : Cela signifie que chaque 0,25 µm sera rendu dans des modèles en trois dimensions. Détail de surface peut être constante pour n’importe quelle région de la lignée germinale où un modèle en trois dimensions de la surface sera créé pour chaque 0,25 µm. Toutefois, pour la région de l’ovocyte, détail de surface peut être porté à 0,35 - 0,5 µm due à la présence de fibres d’actine bien définis dans cette région.
3. Soustraire l’arrière-plan en cochant fond soustraire la boîte et en utilisant les valeurs de correction de fond calculés par le logiciel (complémentaire Figure 1).
4. Ajuster le seuil de rendu tridimensionnel selon la structure nécessitant une analyse (1E Figure supplémentaire).
5. Enregistrez l’image en trois dimensions développée et exporter dans un fichier TIF.

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Résultats

La figure 1 indique le temps requis pour l’analyse des cellules germinales en trois dimensions. L4 hermaphrodites incubées à 20 ° C ont été disséqués pour isoler germlines et colorées au DAPI, la phalloïdine et des anticorps contre les protéines de la lignée germinale. Germlines sont imagés à l’aide de la microscopie confocale. Microscopie confocale et de coloration nécessite environ 24 h. analyse de calcul pour la lignée germinale complete...

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Discussion

Ce protocole vise à améliorer la précision et réduire le temps nécessaire pour l’analyse de la lignée germinale. Après l’emballage standard germlines disséqués, un modèle tridimensionnel de noyaux de cellules germinales est préparé par calcul rendu. Tout en permettant l’observation de la distribution de noyaux de cellules germinales dans l’espace, rendu tridimensionnel calcule le nombre de noyaux à des régions spécifiques de la lignée germinale. L’aspect essentiel de notre méthode est une défi...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria	Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates	Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat	Thermofisher Scientific	A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Paraformaldehyde solution	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield fixing reagent	Sigma Aldrich	F6182
Ethanol	Millipore	1009832511
Methanol	Sigma Aldrich	34860
20°C & 25°CIncubator	Any brand
Light microscope	Any brand
Confocal microscope	Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.	Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4	Homemade
Teflon microscope slides	Tekdon	941-322-8288