Une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-PCR Amplification d’ADN monocaténaire Amplicons

Résumé

Cet ouvrage fournit une méthode pour la fabrication de plateformes microfluidiques axée sur la goutte et l’application des microsphères de polyacrylamide pour l’amplification PCR-microsphères. La méthode PCR-microsphères permet d’obtenir des amplicons ADN monocaténaire sans séparer l’ADN bicaténaire.

Résumé

Axée sur les gouttelettes microfluidics permettent la production fiable des microsphères homogènes dans le canal de la microfluidique, fournissant contrôlé de taille et de la morphologie de la microsphère obtenu. Une microsphère copolymérisé avec une sonde d’ADN-acrydite a été fabriqué avec succès. Différentes méthodes telles que la PCR asymétrique, digestion exonucléase et l’isolation sur streptavidine des billes magnétiques permet de synthétiser l’ADN simple brin (ADN simple brin). Cependant, ces méthodes ne peut pas utiliser efficacement de grandes quantités d’ADN simple brin hautement purifiée. Nous décrivons ici un protocole de PCR-microsphères détaillant comment ADNsb peut être efficacement amplifié et séparé du dsDNA simplement par pipetage à partir d’un tube de réaction PCR. L’amplification de l’ADN simple brin peut être appliquée comme réactifs possibles pour les biopuces et ADN-SELEX (évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel).

Introduction

ADN simple brin (ssDNA) a été largement considéré comme un élément de reconnaissance moléculaire (MRE) en raison de ses propriétés intrinsèques d’hybridation de l’ADN^1,2. Le développement de systèmes synthétiques ADNsb peut conduire à des applications biologiques telles que l’ADN microarrays³, oligotherapeutics, diagnostic et détection moléculaire intégrée basée sur des interactions complémentaires^4,5.

A ce jour, les particules de polymère-l’échelle du micromètre ont fait leur preuve à l’aide de dispositifs microfluidiques. Plusieurs techniques de microfluidique sont est avérés pour être puissant pour produire des microsphères très homogènes sur le flux continu du microchannel environnement^6,7.

Dans l’étude de Lee et al. ⁸, une plate-forme microfluidique axée sur les gouttelettes de synthèse microfluidique de polymérisables oligo-microsphères et ADNsb amplification a été signalé. La plate-forme microfluidique se compose de deux couches PDMS (diméthylsiloxane) : une partie supérieure avec un réseau de canaux microfluidiques pour générer des microsphères et un fond plat partie. Ceux-ci se composent de trois types de canaux fluidiques PDMS : 1) un débit en se concentrant channel pour la production de gouttelettes, 2) une chaîne serpentine pour mélanger les deux solutions et 3) un canal de polymérisation séquentiel pour la solidification de microsphères. Une fois que les deux flux non miscibles sont introduits dans un seul canal fluidique de PDMS, le flux peut être forcé à travers la structure de l’orifice étroit. Les comportements de flux tels que la géométrie du canal, débit et viscosité affectent la taille et la morphologie de la microsphère. Par conséquent, le flux de liquid principal peut être divisé en microscale monospheres^9,10.

Ici, un protocole détaillé microsphères-PCR est fourni pour l’amplification de l’ADN simple brin. Tout d’abord, un processus de conception de dispositif microfluidique axée sur la gouttelette est décrite. Ensuite, la façon dans laquelle polyacrylamide microsphères peuvent être fonctionnalisés avec matrice aléatoire d’ADN de manière complémentaire est expliquée. Enfin, un protocole de microsphères-PCR pour amplifier l’ADN simple brin est montré.

Protocole

1. fabrication d’une plate-forme de microfluidique PDMS

1. Préparer 20 mL de liquide prépolymère de PDMS en mélangeant à base de polymères et de catalyseur dans un rapport de volume de 10:1. Verser 10 mL du liquide PDMS sur un moule de SU-8 préparé sur une plaquette de silicium pour la partie supérieure du réseau microfluidique. Pour la partie inférieure plate, versez le même volume de liquide PDMS sur la plaquette de silicium sans une structure de moule.
   Note : Le réseau microfluidique est conçu dans un programme de CAO et ensuite converti en un photomasque afin de fabriquer un maître en utilisant le procédé de photolithographie typique (voir Figures supplémentaires). Ce master est composé de la résine photosensible négative SU-8 moule sur la plaquette de silicium¹¹.
2. Placez les deux plaquettes de silicium recouverts de liquide prépolymère de PDMS sur la plaque chauffante et la guérison à 75 ° C pendant 30 min.
   1. Retirez manuellement la couche durcie de PDMS du moule SU-8. Aligner un diamètre de 1,5 mm ronde trou poinçonnant outil pour le port pétrolier sur le réseau microfluidique répliqué pour interfacer avec des canaux d’écoulement à l’échelle du micron avec les échantillons de liquide macro. Poinçonner manuellement l’à travers-trou.
   2. Répétez ce processus trois fois pour la formation de ces deux solutions et l’orifice de sortie de poinçonnage.
3. Effectuer des traitements de surface hydrophile sur l’empeigne et les couches PDMS de fond à l’aide d’un traiteur de corona à main¹² pendant plusieurs secondes par exemple.
   1. Empilez les deux couches PDMS de plasma-traités et chaleur à 90 ° C pendant 30 minutes à l’aide d’une plaque chauffante pour le processus de collage de PDMS-à-PDMS. Fournir de l’eau sous pression à l’aide de la seringue dans trois ports d’entrée pour le collage structural et des essais de fuite d’un appareil fabriqué.

2. production de Polyacrylamide Oligo-microsphères

1. Préparer la perle-mélange détaillé dans le tableau 1.
2. Vortex et brièvement Centrifuger l’acrydite standard ADNsb étiqueté sonde (Ap, 100 μM) et la solution mère d’acrylamide:bis (19:1).
3. Préparer la solution j’en mélangeant 25 μL de 40 % d’acrylamide bis solution, 10 μL d’ADN simple brin (sonde d’acrydite), 10 μL de tampon de x TBE 5 (1,1 M Tris ; borate de 900 mM, 25 mM EDTA) et 5 μL d’eau. Préparer la solution II avec 50 μL de persulfate d’ammonium 20 %.
4. Préparer les deux seringues individuellement rempli d’une solution solution II et j’ai et les monter sur la pompe d’introduire la solution flux dans la plate-forme de la microfluidique. Préparer l’huile minérale mélangée avec 0,4 % TEMED pour surface solidification de la microsphère.
   Remarque : Le TEMED est bien connu comme un stabilisateur de radicaux libres. Radicaux libres peut accélérer la vitesse de formation de polymère avec le persulfate d’ammonium (APS) pour catalyser la polymérisation de l’acrylamide.
5. Remplissez une bouteille en verre avec 4 mL de l’huile minérale pour générer un flux continu.
6. Insérer les deux tubes à deux ports dans le bouchon de la bouteille en verre comme un réservoir de microfluidique : le port pneumatique pour l’application de l’air comprimé dans la bouteille en verre le compresseur d’air et du port fluid pour l’approvisionnement de l’huile sous pression à la micro Channel de la bouteille en verre. Raccorder les tubes entre la bouteille et le port pétrolier dans le dispositif microfluidique.
   1. Raccorder les tubes vers les ports de deux solution dans le dispositif microfluidique afin d’approvisionner les deux solutions de pompes à la seringue. Introduire les tubes à l’orifice de sortie afin de transférer les microsphères généré dans le bécher.
7. Régler le débit de la pompe à seringue à 0,4 - 0,7 mL/h. réglage air comprimé pression du compresseur à l’aide d’un régulateur (82-116 kPa). Régler la vitesse de rotation (500 tr/min) de la barre de l’agitateur magnétique dans le bécher en verre sur une plaque chauffante. Faire fonctionner la pompe de seringue et fournir de l’air comprimé généré par un compresseur externe dans la bouteille en verre à l’aide de la commande ON/OFF de l’électrovanne de¹³.
8. Observez la formation des microsphères dans la géométrie d’écoulement de mise au point et la solidification des microsphères générés dans la carafe en verre avec un microscope numérique.
   Remarque : La vitesse de taille et de la production de la microsphère dépendent du débit des solutions et la pression exercée pour l’écoulement de l’huile minérale (tableau 2).

3. exécution de Polyacrylamide Oligo-microsphères compte

1. Pour la quantification hémocytomètre, prendre une petite quantité (environ 100 μL) de solution aqueuse de polyacrylamide oligo-microsphères et place sur le verre hémocytomètre et remplir doucement la suspension de microsphères le bien de la chambre de comptage.
   Remarque : Pour plus de détails, voir http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Utiliser un compteur de contrôle de microscope et de la main pour compter des microsphères dans un ensemble de 16 places. Ensuite, déplacez le hémocytomètre sur le jeu suivant de la chambre et continuer comptant jusqu'à ce que tous les quatre ensembles de 16 angles sont comptés.
3. Déterminer le nombre moyen de microsphères et calculer le nombre des microsphères dans la suspension de perle originale.
4. Transfert 100 μL de microsphères à un tube de microtubes de 1,5 mL. Retirez le surnageant par centrifugation (400 x g) doux et de pipetage.

4. effectuer l’hybridation de l’ADN sur la Surface de Polyacrylamide Oligomicrosphere

Remarque : Une identique sonde d’ADN avec une 5'-NH₂-groupe au lieu de 5'-acrytide modification est ajouté dans la solution j’ai et testé pour Ap-contenant des microsphères en parallèle. Résultats d’hybridation ADN sont indiquées à la Figure 2. La solution de sondes (PAC) de Cy3 marquée des oligonucléotides complémentaires doit être placée dans une pièce sombre.

1. Resuspendre Cy3-cAp à l’aide de 100 μL de tampon de 1xTE (tampon TE : 10 mM Tris et 1µm EDTA, pH 8,0) afin d’obtenir une concentration finale de 100 μM. Par exemple, remettre en suspension 1 pmol de PAC dans 100 mL de tampon TE puis transférez dans un tube de microcentrifuge recouvert de papier d’aluminium.
   Remarque : Pour les séquences de brin, voir le tableau 3.
2. Ajouter 100 μM de Cy3-PAC dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL contenant des microsphères Ap-copolymérisé.
3. Tapoter le tube plusieurs fois pour mélanger et incuber dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante.
4. Jeter le surnageant et enlever le tampon résiduel par le biais de pipetage.
5. Rincer trois fois à 500 μL de tampon de TE.
6. Remettre en suspension les microsphères en tapotant doucement le tube de microcentrifuge. Ensuite, répétez l’étape 4.4.
7. Placez des microsphères sur la lame de verre (75 x 50 mm) et le couvercle avec du papier d’aluminium avant de l’imagerie.

5. asymétrique PCR pour amplifier l’ADN simple brin

1. Préparer un mélange de réactifs PCR asymétrique pour amplifier l’ADN simple brin à analyser. Décongeler les réactifs dans le tableau 4 sur la glace. Ne gardez pas l’enzyme polymérase de Taq (50 U/µL) sur la glace, mais plutôt conserver à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
2. Vortex doucement tous les réactifs et centrifuger brièvement tubes à 10 000 g pendant 10 s.
3. Combiner tous les réactifs comme décrit dans tableau 4.
4. Placer les échantillons dans un thermocycleur et commencer la PCR asymétrique dans les conditions suivantes : 25 cycles (95 ° C pendant 30 s, 52 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s), 85 ° C pendant 5 min, tenir à 4 ° C.

6. microsphères-PCR pour amplifier l’ADN simple brin

Remarque : Cette section décrit le protocole pour amplifier l’ADN simple brin dans un tube de réaction PCR. Réactions de microsphères-PCR ont été effectuées dans 50 μL de volume réactionnel. Les séquences détaillées utilisées pour amplifier l’ADN simple brin sont répertoriés dans le tableau 5. Dans ce cas, Ap sur la surface des microsphères peut recuire à matrices aléatoires d’ADN de manière complémentaire. Il s’agit d’une étape très importante pour la production des brins complémentaires d’ADN (brin d’ADN antisens, Figure 3). L’étendue de l’ADN est utilisé comme modèle pour l’amplification PCR-microsphères.

1. Préparer le mélange réactif de microsphères-PCR. Décongeler les réactifs dans le tableau 6 sur la glace ; Toutefois, ne gardez pas l’enzyme polymérase de Taq sur la glace. Conserver à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
2. Vortex doucement tous les réactifs et centrifuger brièvement tubes à 10 000 g pendant 10 s.
3. Obtenir environ 25 ~ microsphères par comptage microscopique.
   Remarque : Le nombre des microsphères dans le tube à une réaction est calculé à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 40 X. Environ 25 ~ microsphères sont utilisées pour l’amplification PCR-microsphères. Informations plus détaillées sont à l’étape 3.
4. Combiner tous les réactifs comme décrit dans tableau 6.
5. Placer les échantillons dans un thermocycleur et commencer la PCR asymétrique dans les conditions suivantes : 25 cycles (95 ° C pendant 30 s, 52 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s), 85 ° C pendant 5 min, tenir à 4 ° C.
6. Amplification suivante, ajouter 8 μL de 6 x chargement tampon et charger 15 μL de chaque échantillon en gel d’agarose à 2 %. Effectuez ensuite, électrophorèse à 100 V pendant 35 min dans 1 x TAE (Tris-acétate-EDTA, 40 mM Tris acétate EDTA 1 mM, pH 8,2) tampon.

7. confocal Microscopy Acquisition

Remarque : Les résultats de l’hybridation de sonde ADN-microsphères sont imagés sous un microscope confocal. Analyse des images est effectuée à l’aide de ImageJ.

1. Difficulté hybridées microsphères à l’étape du microscope dans un support.
2. Sélectionnez le laser (laser hélium/néon, 543 nm ligne) et allumez-le en contrôle de laser.
3. Sélectionnez l’objectif dans le contrôle de microscope.
4. Sélectionnez le filtre souhaité pour Cy3 et canal dans le contrôle de configuration.
5. Lancer le test et observer l’échantillon. Paramètres pour la microscopie confocale sont résumés au tableau 7.

Résultats

La plate-forme fabriqué polymériques axée sur les gouttelettes microfluidique se compose de deux couches PDMS (Figure 1 a). Trois types de réseaux de canaux microfluidiques sont utilisés pour générer des microsphères : géométrie 1) flux de mise au point comme illustré dans la Figure 1 bet 2) une chaîne serpentine pour mélanger la solution solution II et j’ai 3) un canal de polymérisation des microsphères solidif...

Discussion

Contaminants des ADN double brin sont un enjeu majeur pour l’amplification de l’ADN simple brin. Il reste difficile d’amplification ADN double brin dans les classiques de l’amplification PCR asymétrique¹⁵de minimiser. En outre, bien que des améliorations techniques pour générer des ADN simple brin nous ont permis d’accroître l’efficacité du débit de l’échantillon, isolement de l’ADN simple brin est toujours problématique en raison de ses coûts élevés et des rendements d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres