Imagerie de Ca2 + réponses au cours de l’Infection des cellules épithéliales de Shigella

Résumé

Nous présentons ici les protocoles afin de visualiser les réponses de calcium (Ca^{2 +}) induites par les cellules HeLa infectées par Shigella. En optimisant les paramètres de l’infection bactérienne et d’imagerie avec Ca^{2 +} des sondes fluorescentes, atypique globales et locales Ca^{2 +} signaux induits par des bactéries sur une gamme étendue de la cinétique de l’infection sont caractérisés.

Résumé

Ca^{2 +} est un ion ubiquitaire impliqué dans tous les processus cellulaires connus. Alors que Ca^{2 +} réponses globales peuvent affecter le sort de la cellule, les variations locales de Ca^{2 +} cytosolique des concentrations libre, liées à la libération de réserves internes ou un influx à travers les canaux de la membrane plasmique, régulent les processus de cellules corticales. Pathogènes qui respecte ou envahir l’hôte cellules déclencheur une réorganisation du cytosquelette d’actine qui sous-tendent la membrane plasmique hôte, affectant probablement Ca^{2 +} signalisation tant mondial que local. Parce que ces événements peuvent se produire dans les basses fréquences de façon Pseudo-aléatoire stochastique plus longue cinétique, l’analyse des signaux de Ca^{2 +} induite par des agents pathogènes soulève des défis techniques majeurs qui doivent être abordées.

Nous rapportons ici, protocoles pour la détection de Ca^{2 +} des signaux les et mondiaux sur une infection Shigella des cellules épithéliales. Dans ces protocoles, artefacts liés à une exposition prolongée et photovieillissement associée à l’excitation de Ca^{2 +} des sondes fluorescentes sont dépannez-effectué en contrôlant rigoureusement les paramètres d’acquisition au cours de périodes définies au cours d’une Shigella invasion. Des procédures sont mises en œuvre pour analyser rigoureusement l’amplitude et la fréquence des signaux^{2 +} Ca cytosoliques globales au cours de la cinétique d’infection étendue à l’aide de la sonde chimique Fluo-4.

Introduction

Ca^{2 +} réglemente tous les processus cellulaires connus, notamment la réorganisation du cytosquelette, les réponses inflammatoires et voies de mort cellulaire, associés à des interactions hôte-pathogène^1,2,3. Dans des conditions physiologiques, des concentrations^{2 +} Ca cytosoliques basales sont faibles, dans les centaines de gamme nM, mais peuvent être soumises à des augmentations transitoires lors de la stimulation agoniste. Ces variations montrent souvent comportement oscillatoire sous l’action des pompes et des canaux à la membrane de plasma et le réticulum endoplasmique. Le modèle de ces oscillations est caractérisé par la période, la durée et amplitude de Ca^{2 +} augmente et est déchiffré par les cellules qui, à leur tour, déclenchent des réponses spécifiques dans ce qu’on appelle le Ca^{2 +} code^4,5 . Une augmentation soutenue de la concentration de Ca^{2 +} cytosolique dans des conditions pathologiques peut-être conduire à la mort de cellule associée à la perméabilisation des membranes mitochondriales et le déblocage de pro-apoptotiques et nécrotiques facteurs^{6, 7}.

Shigella, l’agent causal de la dysenterie bacillaire, envahit les cellules épithéliales en injectant des effecteurs dans les cellules de l’hôte à l’aide d’un type III sécrétion système (T3SS)^8,9. Ca^{2 +} signaux les et mondiaux provoquées par la T3SS est associé liée une invasion de Shigella des cellules hôtes. En ce qui concerne le pore-forming toxines, le translocon T3SS qui insère dans les membranes des cellules hôtes et est nécessaire pour l’injection des effecteurs T3SS est probablement responsable de l’activation de PLC et l’inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-dépendant Ca^{2 +} Communiqué. Communique de la combinaison de la stimulation localisée de PLC et l’accumulation de l’actine polymérisée dans les endroits d’un résultat d’invasion de Shigella dans un anormalement longue durée dépendant InsP3 Ca^{2 + 10}. Le type III processeur d’effets IpgD, une phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-phosphatase, limite l’espace local de PIP2, contrôlant ainsi la quantité de substrat disponible pour PLC générer des InsP3, ce qui contribue à l’isolement des locaux Ca^{2 +} réponses à l’invasion bactérienne sites^11,12. Ces locaux Ca^{2 +} réponses susceptibles de contribuer à la polymérisation de l’actine à Shigella invasion sites¹⁰. Réponses^{2 +} Ca globales qui sont aussi provoquées par Shigella, cependant, sont indispensables pour le processus d’invasion bactérienne mais déclencher l’ouverture de connexine hémicanaux à la membrane plasmique et la libération d’ATP dans l’extracellulaire compartiment. ATP libérée, agissant de manière paracrine, stimule à son tour, Ca^{2 +} oscillatoires réponses dans des cellules à côté de la cellule infectée. IpgD est également responsable de la mise en forme Ca^{2 +} réponses globales dans des réponses isolées erratiques avec la dynamique lente. Finalement, après une infection bactérienne prolongée, IpgD conduit à l’inhibition des signaux^{2 +} Ca induite par l’InsP3. Par le biais de son interférence avec la signalisation de Ca^{2 +} , IpgD retarde un Ca^{2 +}-activation dépendante calpaïne permettant le démontage des structures d’adhérence focale et le détachement prématuré d’infecté les cellules¹³.

Alors que les signaux de Ca^{2 +} sont impliqués dans les aspects critiques de la pathogenèse, l’utilisation d’un micro-organisme soulève un certain nombre de défis techniques qui ne sont pas rencontrés dans les études classiques agoniste. Protocoles décrits ici utilisent le couramment utilisé Ca^{2 +} chimique indicateur fluorescent Fluo-4 que nous avons conçu pour caractériser les signaux locaux de Ca^{2 +} au cours d’une infection de Shigella . Étapes essentielles pour la détection de ces signaux sont discutés, ainsi que les procédures mises en place pour leur analyse quantitative qui sert à caractériser le rôle des effecteurs bactériennes dans la signalisation de Ca^{2 +} .

Protocole

1. les préparatifs

1. Préparation de bactéries
   1. Les bactéries de la plaque — souche sauvage deShigella exprimant l’adhésine aloudi (M90T-aloudi) — sur un trypticase agar de soja (TCS) plaque contenant 0,01 % du rouge Congo (CR) et les incuber pendant 18 heures à 37 ° C.
      Remarque : Pour augmenter leur reproductibilité, les plaques de Shigella , obtenus à l’étape 1.1.1 sont stockés à 4 ° C et doivent être utilisés dans une semaine, parce que toutes les colonies sur milieu CR finalement seront allume en rouges au fil du temps.
   2. Inoculer TCS bouillon pré-culture en choisissant 3 colonies rouges des plaques strie.
      Remarque : L’inoculation avec 3 colonies est effectuée afin de limiter la probabilité de choisir un seul clone dont plasmides de virulence a fait l’objet d’une recombinaison génétique.
   3. Cultiver des cultures bactériennes liquides dans un incubateur à agitation pendant 16 h à 37 ° C à 200 tr/min. Ajouter ampicilline à une concentration finale de 75 mg/mL. Concentrations d’antibiotique ne doivent pas dépasser 3 x la concentration minimale inhibitrice, car un excès d’antibiotique peut conduire à la perte du plasmide grande virulence.
      Remarque : Le maintien du plasmide Shigella virulence doit être vérifié en ensemençant les cultures bactériennes sur des plaques de CR additionnés de concentrations d’antibiotique appropriées. La présence de colonies blanches indique perte de plasmides.
   4. Ensemencer la culture TCS avec la culture bactérienne préalable à une dilution au 1/100. Il incuber à 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 2 h à 200 tr/min. Veiller à ce que la densité optique à 600 nm (OD_600nm) est de 0,2 - 0,4.
   5. Centrifuger la culture bactérienne pendant 2 min à 13 000 x g à 21 ° C et Resuspendre le culot dans un volume équivalent de EM milieu (120 mM NaCl, KCl 7 mM, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, glucose 5 mM et 25 mM HEPES pH = 7,3).
   6. Diluer la suspension bactérienne dans un tampon EM à une finale de OD_600nm de 0,1 et utiliser immédiatement ou stockez-le à 21 ° C et utiliser dans le prochaine 60 min.
2. Préparation de cellules
   1. Les cellules HeLa culture en DMEM avec 1 g/L de glucose additionné de 10 % de sérum de veau foetal (FCS) et cultivent à 37 ° C, avec 10 % de CO₂. Croître TC-7 grandi DMEM avec 4,5 g/L de glucose, contenant 10 % FCS et les acides aminés non essentiels dans un incubateur à 37 ° C contenant 10 % de CO₂.
   2. Pour l’entretien de la cellule, fractionner les cellules régulièrement afin d’éviter une inhibition de la croissance-contact liée aux États confluentes ; Cela est essentiel pour un Ca^{2 +} sonde chargement/transfection à rendement élevé.
   3. Plaque de cellules HeLa sur lamelles circulaires stériles 25 mm de diamètre en plaques 6 puits à une densité de 3 x 10⁵ cellules/puits la veille de l’expérience pour les cellules HeLa.
   4. Pour les TC-7 cellules, trypsinize et compter les cellules. Les semences à 4 x 10⁵ cellules/puits et incuber les 5-7 jours à 37 ° C dans un 10 % de CO₂-incubateur avant les expériences afin de permettre une polarisation.
      1. Actualiser le milieu de culture cellulaire de tous les jours jusqu’au jour de l’expérience.
         Remarque : Fond en verre diamètre 35 mm jetable chambres peut-être également être utilisé comme une alternative aux puits contenant des lamelles couvre-objet. Si ces derniers sont utilisés, le contrôle de la température grâce à une platine chauffante ou objectif n’est pas suffisant, et une chambre d’incubation thermostat monté sur la platine du microscope est nécessaire.
3. Le jour de l’expérience, retirez le support et laver les cellules 3 x avec 1 mL EM médium à 21 ° C.
4. Charger les cellules avec 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ un tampon EM pendant 30 minutes à 21 ° C.
   Remarque : Le chargement de cellules HeLa Sub confluentes ne soulève pas de problèmes majeurs, le chargement des cellules polarisées de TC-7 est souvent hétérogène et peu efficace. Pour ces cellules, nous avons trouvé que l’efficacité de chargement est renforcée par l’ajout de l’agent de dispersion — acide Pluronique — à une concentration finale de 0,1 % et de l’anion-transporteur inhibiteur bromosulfophtalein à une concentration finale de 20 µM à la Contenant fluo-4-AM EM. L’utilisation de produits chimique ratiométrique sondes ou codé génétiquement-FRET sondes nécessitant une double-acquisition n’est pas compatible avec la vitesse d’acquisition requise pour l’imagerie des réponses locales du Ca^{2 +} .
5. Laver les échantillons 3 x avec EM mettre en mémoire tampon et plus loin les incuber dans 1 mL de tampon EM à 21 ° C, permettant l’hydrolyse de la portion de l’AM. Utilisation Fluo-4 cellules chargées immédiatement ou dans les prochain 90 min (maintenue à 21 ° C).

2. infection et Acquisition d’images des réponses locales Ca^{2 +}

1. Placer la lamelle contenant les cellules chargées de Fluo-4 dans une chambre d’imagerie ou de la chambre de fond en verre. Laver les échantillons dans la salle d’imagerie ou jetables de fond en verre chambre 3 x avec tampon EM pour éliminer les composés potentiellement résultant de la lyse cellulaire. Ajouter 1 mL de tampon d’EM.
2. Placer la chambre sur une scène de microscope de fluorescence inversé chauffée à 33 ° C.
   Remarque : Cette température est sélectionnée comme un compromis entre les températures optimales compatibles avec le processus d’invasion de Shigella et le ralentissement des réponses du Ca^{2 +} pour visualiser les réponses locales. Nous utilisons un 63 X objectif à immersion d’huile (NA = 1,25) équipé d’anneaux de contraste de phase.
3. Sélectionnez un champ de microscopie et de définir les paramètres d’acquisition, y compris les temps d’exposition et binning si nécessaire, pour optimiser le signal fluorescent Fluo-4.
   Remarque : Les grands enjeux du local Ca^{2 +} imagerie sont la faible amplitude et la faible durée des réponses, nécessitant une acquisition au moins tous les 30 m plusieurs disponibles dans le commerce rétro-éclairé EM-CCD ou C-MOS caméras présentent le nécessaire sensibilité pour détecter Ca^{2 +} réponses locales à l’aide de Fluo-4. Sensibilité de détection est également une question importante pour limiter le photovieillissement ou objets tels que des réponses spontanées, liées à l’excitation fluorescente Fluo-4 à haute fréquence. Ici, un éclairage à base de LED de 470 nm, avec un filtre passe-bande d’excitation de 480 ± 40 nm, un filtre dichroïque 505 nm et une émission de passe-bande nm ± 30 527 utilisé à 5 % de son intensité maximale combinée avec un filtre de densité neutre 1,0 ont été utilisés afin de minimiser ces problèmes sous un courant d’acquisitions des durées limitées. Une analyse du Ca^{2 +} signaux locaux de lots de 120 s flux s’est déroulée régulièrement. Dans ces conditions de faible éclairage, fluorophore photoblanchiment n’a pas été observé au cours de l’acquisition de min-stream 2. Les acquisitions successives sur le même échantillon peuvent être effectuées, autant de domaines différents sont utilisés. En règle générale, un premier flux d’acquisition est effectué sur un champ de contrôle en l’absence de stimulation de bactéries pour s’assurer de l’absence de réponses spontanées. Si on observe des réponses spontanées, les échantillons sont lavés avec un tampon EM jusqu'à ce qu’on observe aucune réponse.
4. Pour ajouter des bactéries à l’échantillon, retirer 500 µL de tampon de l’EM de la chambre et ajouter 500 µL de la suspension bactérienne préparée à l’étape 1.1.6 pour obtenir une finale de OD_600nm de 0,05, avec les soins appropriés afin d’éviter de déplacer le champ sélectionné de la microscopie ; les volumes s’assurer un bon mélange de bactéries et une répartition homogène de la bactérie sur les échantillons de cellules.
5. Effectuer une acquisition suite à l’ajout de bactéries. Vous pouvez également effectuer une acquisition 10 min après l’ajout de bactéries, qui correspond au temps nécessaire pour que les bactéries dans les sédiments sur les cellules dans les conditions utilisées. À la fin du flux de l’acquisition, acquérir une image à contraste de phase du champ sélectionné pour visualiser les bactéries communiquant avec les cellules et les volants de membrane associées aux sites d’invasion bactérienne.
6. Répétez la procédure d’acquisition comme au point 2.5, à des intervalles qui sont prêtent à la durée de l’acquisitions d’image, fichiers d’épargne et sélection d’un nouveau champ à couvrir l’ensemble du processus.
   Remarque : Pour les Shigella, nous avons trouvé que l’acquisition diffuse toutes les 5 min pendant 20 min, après la sédimentation bactérienne de 10 min, permise de couvrir la majorité des événements invasion.
7. Ajouter à la fin de la procédure d’acquisition, une concentration finale de 2 µM de Ca^{2 +} ionophore ionomycine échantillons pour déterminer l’amplitude maximale des signaux Ca^{2 +} . Acquisition d’images toutes les 3-5 s jusqu'à stabilisation du signal, généralement pour moins de 10 min.
8. Suivre en ajoutant Ca^{2 +} chélateur EGTA à une concentration finale de 10 mM pour déterminer le signal de fluorescence en l’absence de Ca^{2 +}. Acquisition d’images toutes les 3-5 s jusqu'à stabilisation du signal, généralement pour moins de 10 min.
   Remarque : En raison de la dynamique relativement lente des Ca^{2 +} variations globales, effectuer ces acquisitions toutes les 3-5 s (pas en mode streaming), permettant de Ca^{2 +} imagerie sur le même champ microscopique durant les traitements successifs.

3. analyse

1. Exprimer des variations cytosoliques de Ca^{2 +} au fil du temps comme le pourcentage de ΔF/F₀, où ΔF représente la variation de l’intensité de fluorescence moyenne de la région d’intérêt (ROI) et F₀ la fluorescence de base dans le même ROI, auquel une région non pertinents du champ dépourvu de cellules est soustrait.
   1. Supprimer les niveaux de fluorescence basale pour chaque cellule dans différents domaines, correspondant aux niveaux de référence ; ces niveaux peut être déterminé sans ambiguïté en raison de la faible fréquence et de relativement courte durée de Ca^{2 +} réponses locales dans une acquisition de flux donné.
      Remarque : Quantifier les caractéristiques frappantes des réponses liées aux questions posées et le modèle pathogène étudiés. Classiquement, différents paramètres sont pris en compte pour analyser les signaux Ca^{2 +} , y compris la fréquence des cellules montrant locales ou globales Ca^{2 +} réponses, ainsi que la durée, amplitude et la fréquence de ces réponses. Dans le cas de Shigella et les réponses locales, un autre aspect important de l’analyse est l’association spatiale des réponses avec des sites d’invasion bactérienne.
2. Afin de quantifier le pourcentage de cellules sensibles présentant des réponses globales ou locales, attirer ROIs dans les cellules, correspondant aux variations d’intensité de Fluo-4 séries.
   1. La valeur des paramètres stricts pour identifier le Ca^{2 +} les réponses locales, telles que l’amplitude des variations de fond ci-dessus triple du niveau de référence cellule fluorescence moyenne intensité ou une durée d’au moins 200 ms, pour éviter de marquer un faux positif.
      Remarque : En règle générale, même de petites Ca^{2 +} réponses locales se distingués du bruit de fond par leur profil. La ROIs doit être suffisamment grande pour intégrer assez signaux fluorescents pour permettre la détection des variations locales. Selon l’intensité de la détection de Fluo-4, ces ROIs peuvent correspondre aux cercles d’un diamètre allant de 2 à 5 mM.
   2. Mesurer les variations de l’intensité de fluorescence Fluo-4 moyenne dans 2 régions dans une zone distincte de la même cellule, afin de déterminer si les réponses sont globales ou locales.
      Remarque : L’analyse d’un grand nombre de cellules est facilitée par l’utilisation de l’imagerie des logiciels permettant l’affichage de l’écran en direct des variations de l’intensité de la fluorescence moyenne au fil du temps pour les régions sélectionnées. Les logiciels d’imagerie disponibles dans le commerce a une telle option, mais cela peut aussi être effectuée en utilisant le logiciel gratuit Icy , en utilisant le plugin ROI intensité Evolution .
   3. Déterminer le pourcentage de cellules présentant des réponses locales.
      Remarque : Ce pourcentage est calculé à partir du nombre total de cellules analysées dans le domaine de la microscopie, qui doit être en nombre suffisant pour soutenir un statistiquement l’importance à l’aide d’un test non paramétrique.
   4. Déterminer la durée des réponses locales.
      Remarque : Réponses locales Ca^{2 +} peuvent être davantage distingués selon leurs gammes de durée (c'est-à-dire, moins de 500 ms, entre 5 et 10 s, ou supérieure à 10 s) et leur association avec des sites d’invasion de Shigella .
3. Quantifier l’amplitude des réponses. Tout d’abord, calibrer le Ca^{2 +} et cellule fond niveau maximal déterminé comme au point 2.1.7. Puisque la charge Fluo-4 peut varier pour chaque cellule, effectuer ces déterminations pour des cellules individuelles dans le domaine.
   1. Exprimer l’amplitude des réponses sous forme d’un pourcentage relatif de la réponse maximale.
   2. Effectuer des tests statistiques à l’aide d’un test de normalité, suivi d’un test paramétrique pour analyser les différences potentielles de l’amplitude des réponses entre les échantillons.
   3. Déterminer l’association entre ces réponses par rapport à des sites d’invasion bactérienne par leur localisation respective pour les volants de membrane induite par la bactérie visualisées dans les images de contraste de phase correspondants.

Résultats

Invasion de Shigella est associée à atypique durable Ca^{2 +} réponses locales :

À la suite du protocole mentionné ci-dessus, les cellules HeLa Fluo-4-chargés ont été contestées avec WT Shigella et acquisitions de flux ont été effectuées pour analyser les signaux de Ca^{2 +} . Une expérience représentative est illustrée à la Figure 1, avec une série d...

Discussion

Cet article décrit le protocole que nous avons conçu pour suivre les signaux locaux de Ca^{2 +} pendant la cinétique relativement courte d’une invasion de Shigella , en plus de Ca^{2 +} réponses globales au cours de la longue cinétique de Shigella. Ci-dessous, la clé se trouvent des questions qui doivent être abordées afin d’optimiser la détection de Ca^{2 +} signaux tout en minimisant toute ingérence dans les processus biologiques.

Chimique...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin