Protocoles pour tester la toxicité des nouvelles chimies insecticides aux moustiques

Résumé

Les protocoles sont décrits pour évaluer la toxicité des chimies de moustiques adultes et immatures pour développement en tant que de nouvelles classes de larvicides et adulticides, endectocides. Les protocoles permettent à haut débit stable des chimies multiples à la dose de monopoint et évaluation ultérieure par dosage réponse dose pour déterminer la toxicité au contact ou par ingestion.

Résumé

Nouvelles classes d’insecticides avec nouveaux modes d’action sont nécessaires pour contrôler les populations de moustiques qui transmettent des maladies comme le paludisme, la dengue et la Zika résistant aux insecticides. Dosages pour rapide, haut débit analyses des informulé chimies roman contre les larves de moustiques et des ailés sont présentés. Les auteurs décrivent des protocoles pour unique point-dose et dose réponse tests pour évaluer la toxicité des chimies de petites molécules au vecteur Aedes aegypti de Zika, la dengue et la fièvre jaune, le vecteur du paludisme, Anopheles gambiae et le Nord moustique de la maison, Culex quinquefasciatus, au contact et par ingestion. À titre d’exemple, nous avons évalué la toxicité de l’amitriptyline, un antagoniste de petites molécules de récepteurs couplés aux protéines G, par l’intermédiaire de larve, adulte topique et adulte qui se nourrissent de sang dosage. Les protocoles offrent un point de départ pour étudier le potentiel insecticide. Résultats sont discutés dans le cadre d’expériences supplémentaires à explorer des applications de produits et de mécanismes de livraison.

Introduction

Les moustiques transmettent les agents responsables des maladies infectieuses qui influent sur la santé humaine dans le monde¹. Les trois genres de moustiques plus importants affectant la santé humaine sont Aedes, Anopheles et Culex. Les espèces de moustiques du genre Aedes vecteur l’arbovirus qui causent Zika, dengue, fièvre jaune et chikungunya. Anophèle vecteur de parasites du paludisme et l’espèce Culex transmettre le virus du Nil occidental et les nématodes filarienne². L’organisation mondiale de la santé (OMS) a appelé à l’élimination de dix Neglected Tropical maladies (NTD) par 2020³ et identifié la lutte contre les moustiques comme la stratégie plus viable. Les insecticides sont des outils puissants pour combattre les moustiques et réduire la maladie transmission^4,5. Cependant, l’émergence des populations de moustiques résistant aux insecticides menace le contrôle continu de nombreuses maladies^6,7,8. Le Consortium novateur de contrôle vectoriel (IVCC) a lancé le premier effort consacré à développer des insecticides de remplacement pour mosquito control⁹. Nouveaux insecticides avec nouveaux modes d’action (PA) sont nécessaires pour atteindre les objectifs qui et maîtriser la maladie. La découverte et le développement de nouvelles classes d’insecticide avec roman MoAs nécessitent des essais de tout l’organisme pour l’analyse rapide et à haut débit des chimies et par rapport aux normes de l’industrie¹⁰.

Plusieurs tests sont disponibles pour évaluer la répulsion et la toxicité des insecticides pour les larves et les moustiques adultes, et certains sont appropriés pour l’évaluation des nouvelles chimies formulés ou non formulées. Le protocole OMS¹¹ est un dosage de contact utilisé pour tester des produits contre le quatrième stade larvaire. Études publiées décrivent également une variété de larves essais utilisés pour tester la toxicité des chimies de petites molécules pour les larves d’Aedes aegypti, Anopheles gambiae et Culex quinquefasciatus^{10,12, 13,14,15,16}. Les Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bouteille bioessai sert à évaluer la résistance aux insecticides dans les populations de moustiques adultes via l’évaluation de la concentration létale (LC) et temps létal (LT) par rapport à une norme diagnostique champ pris dose d’un insecticide commercial¹⁷. Le test de sensibilité WHO propose une autre approche pour évaluer la résistance aux insecticides dans les moustiques adultes par laquelle les moustiques sont exposés à papier imprégnée d’insecticide à l’intérieur de flacons en verre pendant 1 h et la mortalité est évaluée à 24 h¹⁸. Autres épreuves pulvériser des formulations à l’intérieur des cages scellées et de mort et de choc de moustique record à désirée h¹⁹. L’application topique au thorax moustique a été utilisée pour évaluer la puissance des différents pesticides²⁰. La mise en place d’essais d’insecte Liverpool (LITE)²¹ emploie des modes opératoires normaliséspour évaluer la bioactivité des chimies de moustiques adultes. Le dosage d’actualité adult LITE s’applique une petite quantité de produit à l’essai sur le thorax de moustiques adultes avec mortalité a marqué 48 h. Le dosage permet la quantification de la dose reçue par chaque moustique²¹. Le test de Tarse LITE évalue la toxicité du produit à l’essai aux moustiques adultes reposant sur une surface traitée chimiquement et sert à identifier les chimies avec potentiel de développement sous forme de pulvérisations résiduelles d’intérieur (IRS) ou utilisation de moustiquaires traitées-insecticide (MII) pour contrôler les moustiques anophèles .

L’OMS et dosages de CDC ont des limites pour tester les chimies de roman, informulées, et l’objectif de l’essai biologique bouteille de CDC est l’évaluation de la sensibilité sur une période d’essai court (deux heures) au lieu de toxicité^22,23. En outre, des essais pour l’évaluation de la toxicité des chimies envoyées dans le repas de sang et potentiels pour le développement de produits à action systémique (c.-à-d. les endectocides) font défaut. Nous décrivons ici les essais pour tester l’activité tuant des moustiques des chimies nouvelles qui sont solubles dans l’eau ou l’un de plusieurs solvants organiques contre les larves et les adultes de Aedes, Anopheles et Culex. Tout d’abord, nous démontrons un dosage larvaire précédemment décrite par notre groupe de^13,12,10,16et représenté ici comme (1) un écran pour évaluer rapidement plusieurs chimies à point unique dose, et (2) un essai de réponse dose pour déterminer la concentration létale (p. ex., LC_50, LC₇₅ ou LC_90,) d’une composition chimique unique. Ensuite, nous décrivons deux adultes essais pour la détermination de la dose létale (DL). Le premier d'entre eux est une adaptation du protocole LITE pour tester des chimies appliqués topiquement, roman contre les moustiques adultes par rapport à un contrôle positif. Le second est une analyse alimentaire pour l’évaluation des chimies livré systématiquement par le repas de sang.

Protocole

NOTE : Toutes les souches et les réactifs nécessaires pour le travail décrit dans les protocoles suivants, et les fournisseurs sont énumérés dans la Table des matières.

1. culture de moustique larves et adultes

Remarque : Les souches sensibles des moustiques Insecticide sont disponibles de la recherche sur le paludisme et le référentiel de référence réactif. Recommandés par les souches sont comme suit : souche Liverpool (LVP) aegypti d’Aedes , Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) souche et Culex quinquefasciatus souche de Johannesburg (JHB).

1. Cycle de larves de moustiques de la culture des oeufs le soir 12 h jour/12 h à 28 ° C et 75-85 % d’humidité relative (HR) dans les bacs en plastique de 25 cm x 40 cm (~ 400 larves par plateau) tel que décrit par Nuss²⁹. Nourrir les larves au sol gerbille (a. aegypti et a. gambiae) ou la nourriture de poissons flocon (c. quinquefasciatus). Pour les tests de larves, percevoir les larves au troisième stade larvaire de stade larvaire (L3).
2. Moustiques adultes arrière de nymphes qui ont été transférés aux gobelets en plastique et placez à l’intérieur des cages en plastique de 20 L dans un Insectarium dans les conditions décrites ci-dessus. Maintenir les moustiques sur la solution de sucre de 20 % comme décrit ailleurs²⁹. Recueillir des adultes à l’émergence de poste 3-5 jours.

2. larve dosage Contact (Point monodose ou Dose réponse Assay)

Remarque : Le dosage peut être réalisé avec des propriétés chimiques qui sont solubles dans l’eau ou diméthyl sulfoxyde (DMSO), sous réserve que la concentration finale de DMSO dans puits d’essai ne dépasse pas 1 %. Solvants de rechange peuvent être une option, mais il est essentiel de d’abord s’assurer que la concentration finale ne provoque pas plus de 10 % de mortalité à l’exposition de post de 72 h. Le test peut être réalisé comme point unique dose ou test de dose réponse. Si vous effectuez ce dernier, il est recommandé de tester une gamme de concentrations (moins de cinq), couvrant les attendus cl₅₀.

1. Étiqueter les puits d’une plaque de tissu clair 24 puits comme illustré à la Figure 1.
2. Préparer une solution de la chimie de l’essai dans un tube de 1,5 mL.
   1. Peser chaque chimie à l’aide d’une balance analytique et selon les caractéristiques de solubilité, une nouvelle suspension stérile ddH₂O, DMSO ou autre solvant organique convenable de choix (voir Figure 2).
      Remarque : Les calculs devraient tenir compte de la pureté de la chimie. Par exemple, pour un mélange chimique qui est pur à 99 %, se dissolvent 10,1 mg pour 1 000 µL d’acétone pour obtenir une solution à 1 %. Sceller avec film de paraffine et conserver à-20 ° C.
3. Déterminer la concentration finale de la chimie de test qui sera évaluée et prépare des dilutions de la solution mère en conséquence, à l’aide du solvant approprié.
   Remarque : La concentration et le volume de la chimie et de solvant peuvent être calculées à l’aide de la formule C₁* V₁= C₂* V₂ où C₁= concentration de l’échantillon 1, C₂= concentration de l’échantillon 2, V₁= volume de échantillon 1 et V₂= volume de l’échantillon 2. Voir les calculs de l’exemple illustrés à la Figure 2 et tableau 1.
   1. Préparer une solution mère à 10 mM et les dilutions en série comme requis pour obtenir des concentrations d’essai désiré (tableau 1 b).
4. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique large calibre, transférer cinq larves L3 vers le puits d’une plaque d’essai de culture de tissu ; Les larves L3 se distingues par la longueur (~ 2,5 à 3,5 mm) et tête capsule largeur de ~ 0.025 mm²⁴. Délicatement enlever l’eau avec une pipette 1 mL et le remplacer par le volume souhaité de ddH₂O (voir ci-dessous). Répéter les étapes pour obtenir n = 4 répétitions techniques par traitement (c.-à-d. 20 larves totales par traitement).
5. Ajouter le volume approprié de la chimie de l’essai pour chacun des quatre puits répétées dans la coupelle de 24 puits et agiter doucement la plaque afin d’obtenir un mélange homogène de la chimie. Placer la plaque dans une chambre de test ou de la croissance dans des conditions constantes (par exemple, 25 ° C et ~ 75-85 % RH est recommandé et un h de lumière/12 12 h obscurité cycle si possible).
   Remarque : S’assurer pour la reproductibilité entre les expériences, analyses subséquentes dans les mêmes conditions environnementales.
6. Noter le nombre de larves mortes/irrecevable dans chaque puits à 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 et 72 h après l’exposition (ou autres moments) sur la feuille de match (tableau 2). Tapotez doucement le côté de la plaque. Si aucun mouvement n’est observé, touchez légèrement la larve avec un cure-dent stérile. Marquer des larves qui ne répondent pas pour taraudage/touch comme « morte ».
   Remarque : Les autres phénotypes morphologiques et comportementales peuvent être observés et peuvent être enregistrées.
7. Corriger la mortalité des témoins à l’aide de la formule d’Abbott le mis à jour le si vous le souhaitez, comme suit :
   Mortalité (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
   où X = le pourcentage de la mortalité dans l’échantillon traité et Y = le pourcentage de mortalité dans le contrôle.
8. Graphique des résultats en un histogramme ou courbe logarithmique en utilisant le logiciel de choix tels que Prism graphique-pad 6 ou similaire et calculer les valeurs de Concentration létale (LC) par rapport au contrôle.
9. Répéter l’essai en utilisant un lot séparé des moustiques pour obtenir n = 3 ou plus biologiques répétitions.

3. adult dosage topique (Dose unique de Point ou Dose réponse test)

NOTE : Le test adult topique est effectué à l’acétone comme solvant. Solvants de rechange peuvent être une option, mais il est essentiel de d’abord s’assurer que la concentration finale ne provoque pas plus de 10 % de mortalité au poste 48 h d’exposition. Le test peut être réalisé qu’un seul point de dose ou dose réponse dosage et sert à déterminer la dose létale (DL). Si vous effectuez ce dernier, il est recommandé de tester une gamme de concentrations (moins de cinq), couvrant les attendus DL₅₀.

1. Déterminer le nombre de moustiques femelles adultes requis pour compléter le test.
   NOTE : Un test de dose de point avec une composition chimique unique exigera un minimum de 90 moustiques (30 pour le contrôle positif, 30 pour le contrôle négatif de l’acétone uniquement et 30 pour la chimie de test).
2. 3 aux moustiques femelles adultes âgés de 5 jours de culture et de passer à un seau en plastique séparés de 20 mL à l’aide d’un aspirateur (Figure 3).
3. L’étiquette de 9 oz gobelets en papier avec le nom et la concentration de la chimie de l’épreuve. Mettre de côté carrés de maille 10 x 10 cm et des bandes de caoutchouc pour chaque tasse (voir Figure 4).
4. Sélectionnez un insecticide existant comme témoin positif (par exemple, les pyréthrinoïdes synthétiques, bifenthrine) et préparer une solution 1 % (10 µg/µL) dans de l’acétone.
   Remarque : Les calculs devraient tenir compte de la pureté de la chimie. Par exemple, pour un mélange chimique qui est pur à 99 %, se dissolvent 10,1 mg pour 1 000 µL d’acétone pour obtenir une solution à 1 %. Sceller avec film de paraffine et conserver à-20 ° C.
5. En utilisant la même procédure que ci-dessus, préparer une solution de la chimie de l’épreuve.
   Remarque : Plusieurs chimies de test sont très labiles et solutions sont réalisées de préférence frais chaque fois que l’essai biologique est effectué.
6. Préparer des dilutions successives du contrôle positif et de tester des chimies de solutions mères tel qu’illustré à la Figure 5 utilisation de flacons de verre de 20 mL préalablement rincées avec de l’acétone.
7. Purger une seringue 1 mL en verre avec de l’acétone, remplir avec de l’acétone et fixer dans le micro-applicateur ajustée pour offrir un volume de 0,25 µL.
8. Travail par lots de dix, enlever les 3 - 5 - jours vieux moustiques femelles adultes de cages à l’aide d’un aspirateur et anesthésier jusqu'à cinq min à 4 ° C dans un réfrigérateur ou sur la glace. Ensuite, transférer les moustiques à une boîte de Pétri et la place sur la glace jusqu'à 10 min.
9. Travailler rapidement, retirer une seule femelle avec des pinces fines et appliquer 0,25 µL de solution d’essai au thorax dorsal à l’aide de la seringue micro-applicateur. Confirmer la livraison de la chimie par l’observation à l’aide d’un microscope à dissection pour assurer chaque moustique reçoit le volume approprié de la chimie de l’épreuve.
10. Transférer le moustique dans une tasse de papier marqué reposant sur glace et répéter neuf fois pour obtenir n = 10 moustiques traitées. Sceller les moustiques dans la coupe avec un maillage carré fixés avec un élastique et le transfert vers une chambre en plastique de baignoire ou de la croissance dans des conditions constantes de 28 ° C et 75-85 % HR (sur un 12 h cycle jour/12 h nuit est préférable).
11. Répéter l’expérience ci-dessus deux fois pour obtenir n = 3 répétitions techniques (p. ex., 30 moustiques total) par groupe de traitement ou de contrôle.
12. Répétez les étapes 3,7-3.10 tout d’abord avec la chimie de test, puis le contrôle positif.
    Remarque : Un autre contrôle utile d’inscrire si les moustiques suffisantes sont disponibles est un « blanc » de 30 moustiques anesthésiés qui ne reçoivent pas de test de chimie ou solvant.
13. Noter le nombre de moustiques « morts/ne répond pas » à 30 min, 60 min, 2, 24 et 48 h après l’exposition (ou autres moments) à l’aide de la feuille de match (tableau 3). Marquer des moustiques comme « morts/irrecevable » si elles montrent le manque de mouvement, défini comme portant sur un côté ou sur le dos et à l’incapacité de voler.
14. Si vous le souhaitez, corriger pour la mortalité de contrôle en utilisant la formule de l’Abbott mis à jour le comme suit :
    Mortalité (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
    où X = le pourcentage de la mortalité dans l’échantillon traité et Y = le pourcentage de mortalité dans le contrôle.
15. Afficher les résultats comme un histogramme ou une courbe exponentielle. Pour un essai de réponse dose, calculer la DL₅₀, la LD₇₅ ou la valeur₉₀ LD pour la chimie de test par rapport au contrôle.
16. Répétez le test au moins deux fois l’utilisation des lots distincts de moustiques pour obtenir n = 3 ou plus biologiques répétitions.

4. adult dosage sang-alimentation (Point monodose ou Dose réponse test)

1. Recueillir environ 150 4-5 jours vieux adultes les moustiques femelles et transfert dans une cage séparée. Répétez l’opération pour obtenir 6 cages si vous effectuez un test de réponse de dose. Supprimer la source avant le sucre 1-24 h à l’analyse de l’alimentation.
2. Préparer une solution de la chimie comme décrit ci-dessus, représente la pureté de la chimie (une solution typique est de 80 mM dans l’eau ou tampon salin) et ensuite préparer des dilutions successives dans l’eau/tampon selon les besoins.
3. Ajouter 40 µL de chacune des dilutions à 960 µL de sang de lapin défibriné pour obtenir la concentration désirée. Appliquez membrane sur une unité d’alimentation et sceller avec un anneau en caoutchouc. Transférer 1 mL de sang par l’intermédiaire de pipette et attachez l’alimentation d’un appareil de chauffage.
4. Doucement, écouvillon de la membrane de surface avec fraîchement faite solution 10 % d’acide lactique et placer le filtre d’alimentation dans la cage de moustiques adultes. Couvrir la cage d’un tissu sombre ou un sac poubelle noir et laisser les moustiques nourrir pendant une heure.
5. Répétez les étapes 4.2-4.4 pour le reste des solutions de test et de contrôle négatif (sang uniquement).
6. Au terme de l’alimentation, placer des seaux à 4 ° C au réfrigérateur pendant 5 min anesthésier les moustiques. Enlever les moustiques mâles et les moustiques femelles non nourris et compter et noter le nombre total de nourris et partiellement alimenté les moustiques par examen de l’abdomen.
7. Conserver les moustiques femelles partiellement et entièrement nourris, visant pour un minimum de 50 moustiques nourries de sang par dose.
8. Transfert des seaux dans une chambre en plastique de baignoire ou de la croissance dans des conditions constantes de 28 ° C et 75-85 % HR (sur un 12 h cycle jour/12 h nuit est préférable).
9. Enregistrer le nombre total de moustiques morts/irrecevable à 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 et 72 h (ou alternatives-points dans le temps comme vous le souhaitez) en utilisant le score feuille (tableau 4).
10. Sur le troisième jour post sang alimentation, introduire un coquetier dans la cage et ramasser les œufs sur une période de 72 h. Compter le nombre total de œufs produits par traitement sous un microscope à dissection.
11. Calculer le pourcentage de mortalité et de fécondité en fonction du nombre de moustiques gorgés de chaque groupe de traitement et de contrôle. Corriger la mortalité des témoins en utilisant la formule de l’Abbott mis à jour le si vous le souhaitez.
12. Afficher les données de toxicité et de la fécondité comme un complot de l’histogramme ou courbe exponentielle (si vous effectuez un test de réponse dose) en utilisant le logiciel de choix. Si vous effectuez un test de réponse de dose, calculer la DL₅₀, la LD₇₅ ou la valeur₉₀ LD pour la chimie de test par rapport au contrôle.
13. Répétez le test au moins deux fois l’utilisation des lots distincts de moustiques pour obtenir n = 3 ou plus biologiques répétitions.

Résultats

La figure 6 illustre le pourcentage de mortalité de L3 Ae. aegypti après une exposition à cinq doses d’antagoniste des récepteurs de la dopamine, amitriptyline par rapport à l’eau seulement (négatif) contrôle à 24, 48 et 72 h. Dans cet exemple, les données recueillies à chacun des points-temps affichent une courbe logarithmique typique et révèlent un effet dose-dépendant de l’amitriptyline sur la mortalité larvaire. La valeur de₅₀ LC diminue au cours de la durée de l’expérience et peut être calculée en utilisant les données de 72 h (i.e., le point médian de la courbe logarithmique).

La figure 7 montre le pourcentage de mortalité de 3 - femelles adultes âgés de 5 jours Ae. aegypti après exposition à une dose de 400 µM (10 µg/µL) de l’antagoniste des récepteurs de dopamine, amitriptyline et en comparaison avec les pyréthrinoïdes synthétiques, contrôle positif bifenthrine (qualité technique ; 500 pg/µL), acétone uniquement contrôle négatif et moustiques non traitées (vide). Dans cet exemple, amitriptyline et la bifenthrine causent une mortalité adulte significative par rapport au contrôle négatif. Notez que la mortalité des adultes diminue au fil du temps, probablement en raison de détoxification métabolique des chimies de test.

La figure 8 montre le pourcentage de mortalité (axe gauche) de la femelle adulte de 3 à 5 jours vieux Ae. aegypti nourris avec un repas de sang traité par l’un des quatre doses d’antagoniste des récepteurs de la dopamine, amitriptyline et la fécondité (axe droite ; moyenne d’oeufs comte / femelle) pour la première exposition de post cycle gonadotrophique comparativement aux moustiques de contrôle (uniquement nourries de sang ; contrôle négatif). Les données révèlent qu’il n’y a aucun effet significatif sur la mortalité des adultes par rapport au contrôle amitriptyline mais ne démontrer qu’amitriptyline accroît significativement la fécondité à la dose la plus élevée (400 µM).

Figure 1 . Mise en place de l’essai de réponse dose larvaire. Image montrant la mise en place de l’essai de réponse dose larvaire effectuée à l’aide de larves d’Aedes aegypti L3 en plaque 24 puits.

Figure 2 . Schéma montrant la procédure pour l’ensemble du point (A) unique dose ou dosage larvaire de (B) dose réponse dans plaque 24 puits. Après le transfert de cinq larves L3 à Herbert George wells, l’excès d’eau est doucement enlevé par la pipette et remplacé par ddH fraîches, stérile₂O. Ensuite, stock des dilutions successives de la chimie de test sont apprêtées et ajoutées à un volume final de 1 mL/puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 . Culture des moustiques adultes. Seau en plastique de 20 L affichage de image utilisée pour la culture de moustiques adultes et utilisation d’un aspirateur pour enlever les moustiques.

Figure 4 . Adult dosage topique effectuée à l’aide de femelle de 4 à 5 jours de vieux Aedes aegypti. Après un traitement avec la chimie ou solvants, adultes moustiques sont placés dans des gobelets en papier et transférés dans une chambre de test pour la durée de l’essai.

Figure 5 . Stock et des dilutions sériées. Schéma montrant la procédure pour la préparation du stock (A) et (B) des solutions d’essai de série pour le dosage d’actualité adulte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 . Des données représentatives d’un essai de réponse dose contact larvaire. Données représentatives d’un essai de réponse dose contact larvaire montrant le pourcentage de mortalité des larves d’Aedes aegypti L3 après une exposition à l’antagoniste des récepteurs de dopamine, amitriptyline à 24, 48 et 72 h. Chaque point de données représente la moyenne en µM ± SEM. données représentent n = 3 réplicats biologiques.

Figure 7 . Des données représentatives d’un essai de réponse dose topique adulte. Des données représentatives d’un essai de réponse dose topique adulte montrant la toxicité de l’antagoniste des récepteurs de dopamine, amitriptyline (10 µg/µL) de 3 à 5 jours vieille femelle Aedes aegypti par rapport à la pyréthroïde synthétique, bifenthrine (500 pg/µL) positive contrôle) et négatif de contrôle (véhicule de l’acétone uniquement) à 2, 24 et 48 h. Les données représentent n = 3 réplicats biologiques. Barres d’erreur indiquent sem

Figure 8 . Des données représentatives d’un dosage adulte ingestion. Des données représentatives d’un dosage d’ingestion adultes montrant la toxicité de l’antagoniste des récepteurs de la dopamine, l’amitriptyline à 100 µM et 200 µM à 400 µM de dose de 3 à 5 jours vieux adulte femelle Aedes aegypti et impact sur la fécondité (exprimée comme la moyenne totale d’oeufs compte par la femelle durant le premier cycle gonadotrophique). Les données représentent n = 3 réplicats biologiques ± sem

A. tests de dose monopoint avec trois compositions chimiques
Chimie	Concentration (400 uM)
Amitriptyline	80 mM Stock : 2 mg d’amitriptyline X 98 % (pureté de poudre) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol de 313,86 g X 1 L/0,08 mol6 X 10 µL/L = 78,06 µL d’eau.
	Des Dilutions successives : Diluer le stock 1 / 2 avec les ddH2O et puis 1:4 pour atteindre 10 mM. Ajouter 40 µL de stock de 10 mM à cupule contenant 960 µL de ddH20 pour obtenir une concentration finale de 400 µM/puits.  Préparer des dilutions de stock 10 mM 1:2, 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM et stocks de 0,625 mM.
CIS-(z)-flupenthixol	80 mM Stock : 2 mg de cis (z) flupenthixol X 98 % (pureté de poudre) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol mol 10 X6 X 1 L/0.08 µL/L = 48,28 µL d’eau.
	Des Dilutions successives : Comme ci-dessus.
Amitraz	80 mM Stock : 2 mg d’Amitraz X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/293,4 g d’amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL de DMSO (Remarque : l’Amitraz est seulement soluble dans DMSO).
	Des Dilutions successives : Comme ci-dessus.
Essai de réponse Dose B.
Chimie	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5
	400 ΜM	200 ΜM	100 ΜM	50 ΜM	25 ΜM
p. ex. Amitriptyline, cis-(Z)-flupenthixol ou amitraze	40 ΜL	40 ΜL	40 ΜL	40 ΜL	40 ΜL
	stock de 10 mM	stock de 5 mM	stock de 2,5 mM	stock de 1,25 mM	0,625 mM Stock

Tableau 1. Exemple de calcul pour Aedes aegypti larves L3 (A) seul point test de dose et (B) dose réponse test.

Le tableau 2. Feuille de pointage exemple utilisé pour enregistrer des données à partir de l’analyse de réponse dose larves moustique. Contrôle, l’eau seule ou avec 1 % DMSO ou d’autres solvants seulement l’eau. Les doses typiques utilisés pour tester les chimies de petite molécule antagoniste tels que l’amitriptyline sont 25 µM, de 50 µM et 100 µM, 200 µM 400 µM.

Dosage d’actualité moustique adulte (âgé de 3 à 5 jours)
Date initié :
Chercheur :
Espèce/variété :
Type d’analyse : Point unique dose/dose réponse
A. la mortalité (No. moustiques morts)
Temps (en heures)	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5	Contrôle
0,5
1
1.5
2
2.5
B. % mortalité
Temps (en heures)	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5	Contrôle
0,5
1
1.5
2
2.5

Tableau 3. Feuille de match exemple utilisé pour enregistrer des données à partir de l’analyse de réponse dose topique adulte.

Essai d’Ingestion moustique adulte (âgé de 3 à 5 jours)
Date initié :
Chercheur :
Espèce/variété :
Type d’analyse : Point unique dose/dose réponse
A. nombre nourris les moustiques
	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5	Contrôle
Nourris
Pas de Fed
Total
% Fed
% Pas Fed
B. la mortalité (No. moustiques morts)
Temps (en heures)	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5	Contrôle
2
24
48
72
C. mortalité
Temps (en heures)	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5	Contrôle
2
24
48
72

Tableau 4. Feuille de pointage exemple utilisé pour enregistrer des données à partir de l’analyse de sang-alimentation adulte. Les doses typiques utilisés pour tester les chimies de petite molécule antagoniste tels que l’amitriptyline sont 50 µM, 100 µM, 200 µM et 400 µM.

Discussion

Les insecticides sont des outils puissants pour lutter contre les maladies transmises par les moustiques telles que Zika²⁶, la dengue et le paludisme,²⁵. L’utilisation des insecticides vaste a produit les populations de moustiques que sont résistants à la lutte chimique, conduisant au développement de la résistance aux insecticides, ce qui est considéré comme la plus grande menace pour continue contre la maladie. La dernière décennie a connu une augmentation dramatique des populations d' anophèles SPP. résistance aux pyréthrinoïdes synthétiques (SPs) utilisés dans des moustiquaires en Afrique,⁷. Populations d' Aedes albopictus, vecteur de la dengue et Zika, ont été signalés en Floride et du New Jersey qui résistent aux organophosphorés⁶. De même, la résistance au DDT et pyréthrinoïdes a été documentée dans les populations d’anophèles et Aedes SPP Colombie^27,28. Il est urgent de développer de nouveaux larvicides et adulticides qui se lient aux divers orthosteric ou sites allostériques sur des cibles moléculaires connus ou qui perturbent les nouvelles cibles (p. ex., roman chimies de MoA)^29,30 et avoir un impact environnemental minime. Il augmente également la reconnaissance du potentiel autour d’endectocides pour mosquito control^31,32,33.

Afin de faciliter le développement rapide de ces produits, les auteurs décrivent une série de protocoles visant à évaluer la toxicité des chimies de petite molécule aux larves de moustiques et aux adultes par l’intermédiaire de deux itinéraires de livraison - contact et ingestion. Protocoles, tels que le test de sensibilité des WHO et le test en flacon CDC sont utilisées pour l’évaluation de la toxicité et la répulsion des existants des formulations insecticides^1,2. Toutefois, ces tests ont des limites pour les analyses des entités chimiques nouvelles informulées (RCE) et ne se prêtent pas à l’expérimentation d’un grand nombre de produits chimiques à débit modéré ou élevé.

Nous décrivons ici un essai normalisé de larve afin d’évaluer rapidement les RCE en dose unique qui s’adapte à des analyses à haut débit. Nous décrivons également une adaptation d’un test mis au point par la LITE²¹ pour évaluer la toxicité par contact des chimies de petites molécules de moustiques adultes. Enfin, nous décrire un test ingestion afin d’évaluer la toxicité des RCE envoyées par l’intermédiaire de la farine de sang aux moustiques femelles adultes et explorer endectocide potentiel. Ces tests de larves et les adultes peuvent être effectués sur un éventail de doses afin de déterminer les valeurs LC et LD, respectivement, et essais de contacter les larves et les adultes peuvent être effectuées par rapport à une ou plusieurs formulations chimiques existantes. Le dosage d’actualité adult permet également le calcul des valeurs LD par moustique individuel. Les protocoles peuvent être effectuées à l’aide d’espèces d’Aedes, Anopheles et Culex^16,29 et pourraient être modifiées pour tenir compte de la spécificité biologique d’une espèce, si vous le souhaitez. Dans notre expérience, tuant des moustiques chimies présentent généralement large activité dans ces trois genres^16,29, mais il y a valeur d’évaluation de la sélectivité de l’espèce.

Les dosages sont un point de départ pour dépister rapidement plusieurs chimies pour activité insecticide. Ces produits chimiques qui présentent une toxicité dans un ou plusieurs essais pourraient choisir pour approfondir les analyses via des analyses secondaires et tertiaires. Citons le dosage du tarse LITE et sucre alimentation dosages^34,35. La sélection des essais supplémentaires est normalement déterminée par considérations autour de marché prévue et application, avec résultats offrant aperçu des modes de prestation de produits possibles. Dans les résultats représentatifs présentés ici, nous explorons la toxicité de l’amitriptyline, un antagoniste des récepteurs de dopamine chez les mammifères et les invertébrés qui a été évalué pour le potentiel comme un roman MoA insecticide^{10,12, 13 , 16}. amitriptyline présentait une toxicité pour les larves et les adultes de Ae. aegytpi dans la gamme μg suggérant larvicides et adulticidal activité et fournissant la justification pour une exploration d’une série de produits chimique axée sur l’amitriptyline pour identifier analogues à haute puissance. Aucun effet significatif sur la mortalité ou la fécondité a été observée chez Ae. aegypti exposés à l’amitriptyline dans le repas de sang. Alors qu’on ne connaît pas la stabilité de la chimie dans le sang défibriné et la dose efficace reçue par les moustiques, limites notables de l’essai, les données suggèrent qu’amitriptyline et autres composés de GPCR actifs peuvent avoir peu de potentiel comme endectocides, à moins dans l’état non formulée.

Précautions afin de limiter la variation biologique entre dosages sont essentielles. Tous les essais doivent être effectuées dans des conditions normales de température et d’humidité, de préférence dans une chambre de croissance des insectes, afin de garantir la reproductibilité. Il est impératif de normaliser les procédures pour la notation des critères phénotypiques comme ceux-ci peuvent être très subjectives, conduisant à une variation importante dans les données enregistrées par le personnel des laboratoires différents. L’essai de larve est mieux adapté à l’évaluation des produits chimiques qui sont solubles dans l’eau, bien que l’analyse peut être effectuée à l’aide de solvants organiques comme le DMSO, pourvu que la concentration finale est inférieure à 1 % / puits. Nous reconnaissons plusieurs limites à l’analyse de l’actualité adulte. Tout d’abord, il faut travailler rapidement lors de la préparation des dilutions sériées et livrant des doses que le transporteur (acétone) est très volatil et évaporation peut produire des variations d’un montant de chimie livré. En second lieu, il faut limiter la période de l’anesthésie car cela peut contribuer à la mortalité. Il est à noter aussi que les solvants comme l’acétone peuvent produire un effet « knock-down » rapide dans les premières heures plusieurs de l’essai d’actualité, qui ne doit pas être confondu avec les effets dus à la chimie de l’épreuve. Nous notons que le volume de la farine de sang du moustique varie entre les individus, ce qui complique l’évaluation de la dose reçue par adulte dans l’essai d’ingestion adultes. Enfin, données du test n’est pas dans les cas où la mortalité des témoins négatifs dépasse 10 %.

Les produits qui agissent en synergie sont plus en plus reconnues pour leur potentiel d’étendre l’utilité des produits existants et fournir un contrôle des parasites résistants insecticide populations^15,16,36. Tests de larves ont été utilisés pour examiner la synergie entre le pesticide formamidine, amitraz et une variété de produits chimiques qui perturbent l’octopamine invertébrés récepteurs^14,15. Le dosage larvaire et adulte analyse topique décrit sont appropriés pour évaluer les effets synergiques ou additifs entre les combinaisons des chimies de test. Nous notons que synergistes comme pipéronyl butoxyde (PBO) peuvent être incorporés dans chacun des trois essais décrits ici.

Les essais décrits ci-dessus fournissent une série expérimentale standardisée pour l’évaluation des médicaments informulée, petite molécule contre les stades aquatiques et terrestres de moustique. Ces tests sont conçus pour évaluer la toxicité et offrent plusieurs avantages par rapport aux existants des analyses en commun usage. Ce qui est important, les dosages peuvent faire l’objet d’automatisation et peuvent être effectuées à l’échelle industrielle pour permettre l’évaluation de milliers de composés d’essai. Enfin, comme le champ considère le développement de produits qui agissent par l’intermédiaire de nouveaux protocoles d’accord, y compris par l’intermédiaire de perturbation des nouvelles cibles moléculaires et les voies biochimiques, il sera essentiel de marquer plusieurs points de terminaison phénotypiques en sus de ceux tels que la mortalité et paralysie. Les essais ci-dessus permettent de telles enquêtes, fournissant ainsi une étape vers les technologies insecticide très innovantes de demain.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insecticide susceptible mosquito strains	Malaria Research and Reagent Reference Repository	https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain
Acetone	Mallinckrodt Chemical	CAS 67-64-1	Use for dilutions and control
Amitraz	Sigma-Aldrich	CAS 33089-61-1	Requires dilution in DMSO
Amitriptyline	Sigma-Aldrich	CAS: 549-18-8	Can be diluted in acetone
Bifenthrin	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Synthetic pyrethorid used as positive control
Cis-(Z)-flupenthixol	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors
Defibrinated rabbit blood	Hemostat	DRB0100	Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	MKBF2985	Organic solvent used to disolve amitraz
Hemotek membrane feeding system	Hemotek Ltd	Serial no. 1303	Used for feeding mosquitoes
Micro-applicator	Burkard Manufacturing Co.	-	Tool needed for topical application experiments
24-well cell culture plate with lid	Corning Incorporated	3526	-
Advantage rubber bands	Alliance Rubber Co.	-	Used to seal the paper cups
Glass syringe (1 ml)	Becton Dickinson and Co.	512004	Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic
Disposable scintillation vials (20 ml)	Fisher Scientific	74505-20	Glass vials prevent evaporation
Tulle fabric, white	Walmart	-	-
Paper cups	Dixie Consumer Products LLC.	PF15675/13D	Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays
Petri dishes (150 mm)	Corning Life Sciences	-	Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	Used to sort larvae
Stereo microscope	Olympus	SZ6045	Used to score larval assays and perform micro-applications
Tweezers (fine)	Fontax	-	Used to handle adult mosquitoes