Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Résumé

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV⁺ T cellules isolées de macaques rhésus.

Résumé

Analyse de cellules individuelles est un important outil de dissection des populations hétérogènes de cellules. L’identification et l’isolement de cellules rares peuvent être difficiles. Pour relever ce défi, une combinaison de méthodologie indexé de cytométrie en flux et haut débit multiplex quantitative PCR (qPCR) a été développé. L’objectif était d’identifier et de caractériser le virus de l’immunodéficience simienne (vis)-infecté les cellules présentes au sein de macaques rhésus. Par dosage de la protéine de surface par un tri de cellule activée par fluorescence (FACS) et de l’ARNm par qPCR, cellules infectées par le virus sont identifiés par l’expression des gènes viraux, qui est combinée avec les mesures de gènes et des protéines hôte pour créer un profil multidimensionnel . Nous appelons l’approche, évaluation unicellulaires Proteo-transcriptional ciblée ou tSCEPTRE. Pour exécuter la méthode, des cellules viables sont colorées avec des anticorps fluorescents spécifiques de marqueurs de surface utilisés pour isoler les FACS d’un sous-ensemble de cellules et/ou d’analyse phénotypique en aval. Cellules individuelles sont triés suivis par lyse immédiate, multiplexe transcription inverse (RT), les pré amplification par PCR et haut débit qPCR de jusqu'à 96 transcrits. Les mesures de FACS sont enregistrées au moment du tri et liés ultérieurement pour les données d’expression de gène en position bien à créer une protéine combinée et le profil transcriptionnel. Pour étudier les infectés par le SIV cellules directement ex vivo, les cellules ont été identifiés par la détection de qPCR de multiples espèces d’ARN virales. La combinaison des transcriptions virales et la quantité de chaque fournissent un cadre pour la classification des cellules en étapes distinctes du cycle de vie viral (p. ex., productives et non productives). En outre, tSCEPTRE des cellules SIV⁺ ont été par rapport à des cellules isolées du même spécimen pour évaluer des protéines et gènes différentiellement exprimés hôtes. L’analyse a révélé précédemment incomprises hétérogénéité d’expression de RNA virale chez les cellules infectées comme in vivo la régulation des gènes post-transcriptionnels induite par le SIV avec résolution unicellulaire. La méthode tSCEPTRE est pertinente pour l’analyse d’une population cellulaire se prête à l’identification par l’expression du marqueur de la protéine de surface, ou des gènes pathogène ou d’un hôte ou une combinaison.

Introduction

De nombreux pathogènes intracellulaires dépendent de machinerie cellulaire hôte à répliquer, souvent modifier la biologie cellulaire hôte ou ciblage très certaines sous-populations de cellules de l’hôte pour maximiser leurs chances de propagation. Ainsi, les processus biologiques de cellule sont communément perturbés, avec des conséquences délétères sur la santé globale de l’hôte. Compréhension des interactions entre les virus et les cellules de l’hôte dans lequel ils répliquent élucidera les mécanismes de la maladie qui pourraient contribuer à l’élaboration de stratégies et d’amélioration des traitements pour prévenir l’infection. Les outils d’analyse directes qui permettent l’étude des interactions hôte-pathogène sont essentiels à cette fin. Analyse de cellule unique fournit le seul moyen d’attribuer sans ambiguïté un phénotype cellulaire à un génotype particulier, ou infection état¹. Par exemple, les infections pathogènes induisent fréquemment des changements tant directes qu’indirectes dans les cellules de l’hôte. Par conséquent, distinguer les cellules infectées de leurs homologues non infectés est nécessaire à l’attribut change de cellule hôte à une infection directe ou des effets secondaires, tels que généralisé l’inflammation. En outre, de nombreux agents pathogènes, tels que SIV et des virus de l’immunodéficience (VIH), infection de cellule hôte procède par étapes multiples, tels que dès le début, fin, ou latente, dont chacun peut être caractérisée par gènes distincts et protein expression profils^{2 , 3 , 4 , 5}. analyses en vrac des mélanges de cellules vont échouer à capturer cette hétérogénéité⁶. En revanche, fortement multiplexés analyses unicellulaires capables de quantifier l’expression des deux virale et gènes hôtes offrent un moyen de résoudre les perturbations cellulaires spécifiques à l’infection, y compris les variations à travers des stades de l’infection. En outre, analyse des interactions hôte-pathogène chez physiologiquement paramètres pertinents est essentiel pour l’identification des événements qui se produisent dans les organismes infectés. Ainsi, les méthodes pouvant être appliquées directement ex vivo sont susceptibles de la meilleure capture en vivo traite.

SIV et VIH cible CD4⁺ T des cellules, dans lesquelles ils lutter contre les facteurs antiviraux « restriction » de l’hôte et atténuent présentatrices d’antigènes molécules afin d’établir une infection productive et éviter la surveillance immunitaire^{7,8, 9,10,11}. Sans traitement, l’infection se traduit par une perte massive de CD4⁺ T cells, finalement sanctionnée par acquis d’immunodéficience (sida)¹². Dans le cadre d’une thérapie antirétrovirale, réservoirs de cellules infectées de façon latente persistent depuis des décennies, posant un obstacle redoutable à stratégies curatives. Comprendre les propriétés de in vivo des cellules infectées par le VIH/SIV a le potentiel pour révéler les caractéristiques des cellules hôte joué un rôle dans la pathogénie et la persistance. Toutefois, cela a été très difficile, en raison surtout de la low frequency des cellules infectées et manque de réactifs capables de les identifier facilement. Les cellules qui transcrivent l’ARN viral, sont estimés à présent à 0,01 – 1 % de CD4 des cellules dans le sang et les tissus lymphoïdes^13,14,15+ T. Sous un traitement suppressif, cellules infectées de façon latente sont encore moins fréquentes à 10^-3-10^{-7 16,17,18}. Coloration de la protéine virale dosages que bien pour l’étude des infections in vitro , par exemple pour des Gag intracellulaire, sont sous-optimaux en raison de la coloration de fond de 0,01 à 0,1 %, similaire ou supérieure à la fréquence des cellules infectées^{13, 14}. Surface de coloration pour protéine Env en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques au SIV/VIH Env bien caractérisés aussi a été prouvée que sera difficile, probablement pour des raisons similaires. Récemment, les nouveaux outils visent à améliorer la détection des cellules exprimant le Gag soit par intégrant des analyses spécifiques pour gag RNA ou à l’aide de moyens d’imagerie technologies^14,15,19. Cependant, ces approches restent limités dans le nombre de mesures quantitatives effectuées sur chaque cellule.

Nous décrivons ici la méthodologie qui (1) identifie les cellules infectées par le virus directement ex vivo de qPCR quantitative sensible et spécifique des gènes viraux et (2) quantifie l’expression des protéines de surface jusqu'à 18 et 96 gènes pour chaque infecté (et cellules non infectées). Cette méthode combine la mesure de la protéine de surface monocellulaire de FACS, suivie de la lyse cellulaire immédiate et à l’aide de gene expression analyse multiplexés qPCR ciblée sur le système Biomark. La technologie intégrée circuit fluidique (IFC) permet multiplexé dosage des 96 gènes 96 échantillons simultanément, accompli par une matrice de 9 216 chambres dans lesquelles sont effectuées les réactions individuelles qPCR. Le tri des cellules vivantes FACS enregistre les mesures d’abondance haute teneur protéique tout en préservant le transcriptome de tout analyse effectuée immédiatement en aval. Pour identifier les cellules infectées par le virus, dosages spécifiques pour l’ARN viral alternativement épissé et unspliced (vRNA) sont inclus dans l’analyse de qPCR, avec un panel de tests définis par l’utilisateur totalisant jusqu'à 96 gènes, le nombre maximal d’essais actuellement logés dans la SFI. Les l’expression des gènes et les protéines informations collectées pour chaque cellule sont reliées par une position bien. Nous avons déjà indiqué les résultats de cette analyse ailleurs²⁰. Ici, nous fournissons plus d’orientations méthodologiques, mais aussi plus descriptive phénotypage des CD4 infectés par le SIV⁺ T des cellules.

Cette approche, que nous appelons tSCEPTRE, peut être appliquée à des suspensions d’une population de cellules viables réactive anticorps fluorescent étiquetés et exprimant un transcriptome compatible avec des essais de qPCR disponible. Par exemple, il peut être utilisé pour caractériser les gènes différentiel et expression de la protéine dans les cellules rares ou pas facilement distingués par des marqueurs de la protéine de surface des cellules. La préparation de l’échantillon se fonde sur une norme souillant le protocole utilisant des anticorps disponibles dans le commerce. Cytomètres de flux avec capacité de tri unicellulaires sont également disponibles dans le commerce, mais des précautions biosécurité supplémentaires sont nécessaires pour le traitement des cellules vivantes infectieuses. Enregistrer le profil d’expression de protéines monocellulaires pour chaque cellule de position bien, mentionné aux présentes comme indexée tri, est une caractéristique commune des FACS disponibles dans le commerce, logiciel de tri. Analyse computationnelle de gènes différentiellement exprimés hôte parmi les populations de cellules d’intérêt n’est pas décrit ici, mais les références sont fournies aux méthodes publiées antérieurement.

Protocole

Remarque : Un schéma du flux de protocole est illustré à la Figure 1. Il se compose de trois étapes principales : FACS, RT et préamplification ADNc et qPCR jusqu'à 96 gènes simultanément. Deux versions du protocole, tri des cellules en limitant les dilutions et le tri des cellules individuelles, sont décrites en détail dans les étapes 5 et 6, respectivement. Ces stratégies aborder des questions de recherche différents mais suivent des procédures similaires.

1. prérequis ou préalables des Analyses

1. Valider tous les épreuves d’expression de gène pour être utilisé comme précédemment décrit⁶.
   Remarque : Cette étape est faite bien avant la date de l’expérience. Valider tous les essais, commerciale et personnalisé, est nécessaire pour assurer l’amplification linéaire et efficace de l’ARN pertinente jusqu’au niveau de single-cell. Nombreux essais commercialement disponibles et personnalisés ne satisfont pas à ces spécifications. Traitement et ajustement de courbe automatisé pour la qualification simultanée des tests d’expression des gènes jusqu'à 96 sont fournis dans Les fichiers de codage supplémentaires 1 – 5, mais les essais individuels peuvent être qualifiés à l’aide de R² et la pente de l’ajustement linéaire. Parcelles de qualification test représentatif de réussite ou un échec sont indiquées à la Figure 2.
2. Développer un panel de cytométrie en flux d’anticorps pour colorer les marqueurs de surface de cellules d’intérêt.
   1. Titrer les anticorps par coloration un exemple pertinent, par exemple, rhésus mononucléaires cellules du sang périphérique (PBMC), avec chacun des anticorps. Commencez par 20 µL d’anticorps par test dans 100 µL de réaction de coloration et de créer huit double série de dilutions. Identifier la concentration optimale qui présente le maximum d’intensité de la coloration tout en conservant une séparation claire entre les populations négatives et positives.
   2. Évaluer la coloration combinées sur les échantillons de cellules supplémentaires en utilisant le mélange de tous les anticorps à la concentration optimale déterminée à l’étape 1.2.1. Veiller à ce que la coloration est similaire à celle observée pour les taches de différents anticorps. Si la coloration est inférieur à ce qui est observé quand n’importe quel anticorps a été utilisé dans l’isolement, envisager autre fluorochrome conjugués pour remplacer ces anticorps.

2. Gene Expression MODE OPERATOIRE Préparation

1. 96 de combiner l’expression des gènes dosages dans une RNase/DNase-free tube 1 – 15 mL (taille peut varier selon le nombre de plateaux de tri). Le panneau des essais utilisés dans cette étude est spécifié dans le tableau 1 et tableau 2. Le produit est dénommé le Mix de « test ». Ajouter chaque série de tests à une concentration finale de 180 nM, des amorces et inverses. Ajouter le tampon de Suspension d’ADN pour réaliser la dilution appropriée de la combinaison de test.
   Remarque : Pour des raisons pratiques, les stocks personnalisés (généré par l’utilisateur) dosage peuvent être réalisés à 18 µM soit compatible avec la concentration de disponible dans le commerce « x 20 » gene expression qPCR dosages (Table des matières). 18 mélanges µM d’amorce de marche avant et arrière personnalisé pour chaque gène sont fabriqués à partir de solutions mères dans le tampon de Suspension d’ADN. Tests disponibles dans le commerce (Table des matières) incluent également les sondes, mais les sondes ne sont pas obligatoires pour RT ou cDNA de pré-amplification et peut donc être omis pour les analyses personnalisées. Il est recommandé d’inclure un ou plusieurs gènes domestiques pour les utilisent dans le contrôle de la qualité pour évaluer l’efficacité du tri, récupération de la cellule et synthèse de cDNA. Utilisation des amorces aléatoires pour générer des ADNc n’a pas été déterminée, mais devrait être moins efficaces que les amorces gène-spécifiques.
2. Préparer le 2 x plaque d’essai à utiliser dans l’étape 7.1 (qPCR multiplex). Pour chaque tableau de 96 x 96 puce prévu, Pipetter 6 µL de chaque série de tests dans chacun désigné bien d’une plaque PCR 96 puits. Par exemple, pour 5 jetons, 30 µL de chaque essai occupera un puits unique dans la plaque à 96 puits. Si vous utilisez 96 essais, chaque puits de la plaque à 96 puits contiendra un dosage. Sceller la plaque avec sceau adhésif.
   Remarque : Dans l’idéal, étapes 2.1 et 2.2 sont effectuées simultanément, afin d’éviter de multiples cycles de gel-dégel pour essais d’expression de gène. Tous les gènes au sein de la plaque de test doivent avoir été aussi présents dans le mélange d’essai (étape 2.1). Tant le mélange d’essai et la plaque de test peuvent être stockés à-20 ° C ou 4 ° C pour une utilisation à court ou à long terme, respectivement.

3. surface tache cellules viables

NOTE : Intracellulaire coloration perméabilisation et fixation ne sont pas compatibles avec cette méthode car ils compromettent RNA.

1. Préparer les échantillons de compensation en ajoutant chaque anticorps énumérés dans la Table des matières à 40 µL de perles de compensation à 2,5 concentration plus élevée que celle utilisée pour la coloration de la cellule. Incuber pendant 20 min à 25 ° C, abri de la lumière. Ajouter 3 mL de PBS aux perles et centrifuger à 500 x g pendant 3 min à 25 ° C. Aspirer le PBS et remettre en suspension les perles à ~ 300 µL de PBS.
2. Préparer le trieur de cellules de cytométrie en flux pour le traitement des échantillons : acquérir des tubes d’indemnisation, créer la matrice de compensation et appliquer la matrice aux fichiers d’acquisition pour les spécimens expérimentales.
3. Préparer le mélange maître d’immunofluorescence cocktail en combinant le volume approprié de chaque anticorps comme spécifié dans la Table des matières, dans un tube de verre ambré de 1,5 mL pour tous les échantillons à colorer. Vortex et centrifuger le cocktail à 21 000 x g pendant 2 min à 25 ° C à l’anticorps de granule agrégats.
   Remarque : Les anticorps utilisés ici sont répertoriés dans la Table des matières.
4. Décongeler les cellules cryoconservés dans un bain-marie à 37 ° C pendant 2 min. Ajouter 0,5 à 2 mL de la suspension cellulaire à 12 mL de PBS dans un tube de 15 mL, centrifuger à 500 x g pendant 3 min à 25 ° C et aspirer le PBS. Resuspendre dans 3 mL de PBS et transférez dans un tube de polystyrène de 5 mL. Centrifuger comme ci-dessus et aspirer le PBS, laissant environ 20 µL résiduelle PBS.
   Remarque : La température de coloration peut-être être adaptée à des températures plus chaudes ou plus froides au besoin pour des applications spécifiques en modifiant le titrage d’anticorps coloration des conditions en conséquence (Voir l’étape 1.2).
5. Remettre en suspension jusqu'à 2 x 10⁷ lavé les cellules dans 80 µL d’anticorps cocktail et incuber pendant 20 min à 25 ° C, abri de la lumière. Pour les échantillons dépassant 2 x 10⁷ cellules, augmenter le volume de réaction coloration en conséquence pour maintenir < 2 x 10⁷ cellules/100 µL.
6. Laver les cellules en ajoutant 3 mL de PBS, centrifugation à 500 g pendant 3 min et aspirer le surnageant.
7. Bien remettre en suspension les cellules de 300 à 500 µL de PBS et filtre en pipettant également, en établissant un plafond tamis cellulaire de 35 µm en nylon. Garder les cellules sur la glace et l’abri de la lumière jusqu'à ce que le tri.

4. préparer les plaques Collection cellulaires, exécuter un tri FACS et Generate cDNA

1. Combiner les composants du mélange réactionnel RT-préampli (tableau 3) en pipettant également, dans un seul tube stérile RNAse/DNAse-libre.
   Remarque : Cette étape peut être réalisée avant ou pendant la coloration à l’étape 3. L’enzyme RT peut-être être omise ici pour déterminer la contribution de la matrice d’ADN au signal de qPCR.
2. Utiliser une pipette multicanaux pour distribuer 10 µL du mélange réactionnel RT-préampli dans le nombre de plaques de 96 puits PCR tri collection désiré. Sceller les plaques avec du film adhésif et placer les plaques sur des blocs d’aluminium préalablement réfrigérées de 96 puits.
3. Mettre en place la cellule Tri schéma de blocage sur le cytomètre en flux par l’acquisition de données d’environ 20 000 cellules de l’échantillon coloré. Veiller à ce que la matrice de rémunération s’applique aux données collectées. Dessiner les portes et définir l’arborescence gating qui identifie la population dans la cellule de l’intérêt à isoler pour l’analyse de l’expression génique.
   Remarque : L’arborescence gating utilisé pour le prélèvement de cellules de vRNA⁺ SIV potentiels est illustré Figure 3.
4. Entrez les paramètres de l’instrument approprié pour spécifier le nombre et le sous-ensemble de cellules à trier dans chaque puits. Des instructions détaillées supplémentaires pour le tri soit une série de dilution limite cellule ou des cellules individuelles sont fournis aux étapes 5 et 6, respectivement.
5. FACS trier les cellules en prêts plaques collectrices de PCR 96 puits. Enlever le joint adhésif avant tri et remplacer par un joint frais après le tri.
   NOTE : Gardez les plaques sur les blocs d’aluminium pré réfrigéré en tout temps, même pendant le tri.
6. Immédiatement après le tri, le vortex et la centrifugeuse sur la collection plaque à 2 000 x g pendant 1 min à 4 ° C.
7. Thermocycle la plaque dans une machine PCR avec un couvercle préchauffé en utilisant les conditions suivantes : 50 ° C pendant 15 min (RT), 95 ° C pendant 2 min, suivie de 18 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 4 min (pré amplification).
8. Diluer le cDNA 1:5 en transférant 5 μL d’ADNc dans 20 µL de tampon de suspension de l’ADN dans une nouvelle plaque PCR 96 puits. ADNc dilué peut-être être conservé à 4 ° C ou -20 ° C indéfiniment à ce stade. L’ADNc est maintenant prêt à être utilisé comme modèle pour qPCR (étapes 5.2, 7.4).
   Remarque : Cette dilution s’assure que les amorces présents dans la réaction de RT-préampli ne contribuent pas à qPCR en aval.

5. variation A: FACS trier des cellules dans une série de Dilution limite pour déterminer la fréquence des vRNA⁺ cellules ou effectuer le contrôle de la qualité expérimentale

Remarque : Avant d’effectuer une sorte de cellule unique, il peut être d’utilité pour déterminer la fréquence des cellules d’intérêt, en triant les cellules dans des dilutions à répliquer. Cette étape prévoit aussi précieux contrôle qualité Tri efficacité, lyse cellulaire, la récupération de RNA et synthèse de cDNA, comme indiqué au point 5.3. Permet de déterminer au préalable fréquence cellulaire vRNA⁺ pour une estimation plus précise du nombre de cellules individuelles doivent être triés pour atteindre suffisamment taille de l’échantillon pour analyse l’expression génique cellulaire vRNA convenablement alimenté⁺ .

1. FACS trier les cellules dans les plaques de 96 puits préparés tout comme aux étapes 4.1, 4.2 et collectez 1 – 1 000 cellules par puits dans des répétitions multiples.
   Remarque : Le nombre de puits répétées à chaque dilution cellulaire est généralement inversement associé à la concentration en cellules par puits. Lorsque la fréquence de la cellule infectée est nettement inférieur à 1 %, les dilutions de cellule devraient se concentrer sur 100 – 1 000 cellules par puits. Une carte de plaque de tri exemple est présentée à la Figure 1, en haut à gauche. Supérieure à 1 000 cellules / puits doit être évitée en raison de l’augmentation qui en résulte dans le volume réactionnel et d’ingérence dans la synthèse de cDNA en aval et de la quantification.
2. Mélanger les réactifs de qPCR dans une solution de mélange principal au tableau 4. Pour un volume de réaction 25 µL, 22,5 µL du mélange maître est combiné avec 2,5 µL de matrice d’ADNc dilués à l’étape 3.9. Effectuer le qPCR en utilisant les conditions de vélo standards (p. ex., 94 ° C pendant 5 min, suivi de 40 cycles de 94 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min).
   Remarque : Singleplex qPCR réactions à l’aide d’un instrument conventionnel qPCR en temps réel sont recommandées comme une analyse économique préliminaire d’un ou plusieurs essais pour démontrer efficace cellule Tri, récupération de RNA et synthèse de cDNA. Il peut également être utilisé pour calculer la fréquence des cellules vRNA⁺ . Réactions de qPCR multiplex à l’aide de la Biomark sont généralement plus appropriées pour des analyses à grande échelle de cellule unique.
3. Pour le contrôle de la qualité, tracer Et valeurs (Et = −_max Ct Ct) par rapport à un nombre de cellules triées par puits sur une échelle de₁₀ logarithmique et procéder à une analyse de régression linéaire.
   NOTE : Compatibles réplicats, pente de la régression linéaire de 3,3 (± 0,3) et R² > 0,9 témoignent d’une expérience efficace. Exemples de tri optimal et sous-optimal, expériences RT-préampli sont indiquées à la Figure 4.
4. Pour déterminer la fréquence des cellules vRNA⁺ , tracer le nombre de cellules trié par puits sur l’axe des x (log₁₀ échelle) et la fraction de puits positif pour vRNA à chaque dilution de cellule sur l’axe y. Pour obtenir un exemple, voir la Figure 1 (inférieure gauche, distribution de Poisson). Appliquer un modèle de régression linéaire aux données afin de déterminer le nombre de cellules qui hébergent une cellule positive en moyenne, correspondant à 63,2 % des puits positif (0,632 sur l’axe des ordonnées)²¹. Convertir ce nombre de dilution de cellule (intersection de l’axe des abscisses) en fréquence, exprimée en pourcentage. Par exemple, une cellule de vRNA⁺ par 48 cellules équivaut à une fréquence de 2.1 %.

6. variation B: FACS trier des cellules pour l’analyse des cellules individuelles

1. Suivez les étapes 4.1 – 4,8 et spécifier une cellule triée par bien en utilisant la nouvelle fonctionnalité de tri du cytomètre pour créer des fichiers individuels de FCS pour chaque cellule triés, mappé par poste bien.
   Remarque : Si le nombre d’assiettes de collection sorte dépasse le nombre des thermocycleurs disponible, vélo peut être arrêté après l’étape d’inactivation de la transcriptase inverse (95 ° C pendant 2 min) et ARNC peut être stocké à 4 ° C jusqu'à ce qu’il existe des thermocycleurs. Dans ce cas, commencer pré-amplification au premier cycle de 95 ° C pendant 15 s.
2. En option : Créer cDNA « pools » consistant en ADNc provenant de lots définis par l’utilisateur des cellules individuelles pour dépister les cellules rares d’intérêt using cDNA non dilué résiduelle. Transférer 2 µL de non dilué unicellulaires pré amplifié ADNc par pipette multicanaux dans une nouvelle plaque de 96 puits. Répéter en pipettant : 2 l du cDNA de toutes les autres cellules individuelles d’un groupe désigné dans le même bien. Pools d’ADNc pour un ou des gènes d’intérêt (p. ex., vRNA) afin de déterminer celles qui contiennent des cellules positives à l’aide de qPCR classique de l’écran. Depuis la mise en commun nécessite seulement une petite partie aliquote du cDNA de chaque cellule, le µL de ~ 8 restants de l’ADNc est toujours disponible pour analyses unicellulaires.
   NOTE : Les stratégies de mise en commun sont recommandées avant d’effectuer des analyses d’expression génique de la cellule unique dans le but de réduire le nombre de cellules individuelles, interrogé par qPCR multiplex gourmandes en ressources. Il convient pour les situations dans lesquelles les cellules d’intérêt (p. ex., SIV mRNA +) peuvent être identifiés par un dosage de qPCR préliminaire single-plex. Les stratégies de haut débit simples pour créer des pools de cDNA comprennent combinant 2 µL du cDNA non dilué de lignes (c'est-à-dire 12 toutes les cellules dans la ligne A) ou des colonnes (c.-à-d. 8 toutes les cellules dans la colonne 1), de la plaque sort une collection dans un puits unique dans une nouvelle plaque. Pour déterminer la meilleure stratégie de mutualisation, examiner la fréquence prévue des cellules d’intérêt de l’étape 5.4. Par exemple, si 10 % des cellules sont susceptibles d’être positif, piscines composés de six échantillons de cellule unique cDNA sera souvent négatifs et peuvent donc d’exclure les cellules représentées dans ce pool du aval analyses unicellulaires.

7. multiplex qPCR sur la plate-forme Biomark

Remarque : Cette section peut suivre le version A ou B ci-dessus. Dans l’étude décrite dans les présentes, il a été appliqué exclusivement à l’analyse de cellules individuelles.

1. Préparer la plaque de test de qPCR en pipettant : 4 l de chaque série de tests de 2 x plaque de test (préparé à l’étape 2.2) dans une nouvelle plaque PCR 96 puits contenant 4 µL de réactif dans chaque puits de chargement de dosage. Maintenir la plaque d’essai à 4 ° C.
   Remarque : La plaque de test est stable à 4 ° C pendant une semaine et à-20 ° C pendant un mois. Ainsi, il peut être utile de préparer suffisamment de matière pour plusieurs jetons et stocker de manière appropriée.
2. Distribuer les fluides de ligne de commande de seringues d’amorçage dans les soupapes de deux admission de la puce. Retirez la pellicule protectrice en plastique sous la plaque. Placez le jeton sur un contrôleur de l’IFC avec le côté échancré postées sur la A1. Dans le menu principal, sélectionnez le script de « Prime ». Exécutez le script.
3. Préparer le mélange de réaction en temps réel en mélangeant 50 µL de réactif avec 500 µL de PCR Master Mix (Table des matières) pour chaque puce microfluidique de chargement. Pipetter 4,4 µL dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR 96 puits, désormais désignée comme la « plaque d’échantillon ».
4. Pipetter 3,6 µL du cDNA dilué 1:5 de l’étape 4,8 dans la plaque d’échantillon contenant le mélange de réaction en temps réel.
   Remarque : Si une sélection PCR a été réalisée afin de dépister les rares (p. ex., vRNA⁺) cellules pour analyse en aval comme indiqué dans l’étape 6.2, inclure seulement les cellules représentées dans les pools positifs.
5. Après l’achèvement de l’amorçage de la puce, charger des entrées de la puce de distribution 5 µL de la plaque de test dans la correspond bien du côté de la puce cranté (essai) et 5 µL de la plaque d’échantillon dans la correspond bien sur l’autre côté (échantillon) de la puce. Insérez la puce dans le contrôleur de la SFI et exécutez le script de « Mélange de charger ».
6. Transférer la puce sur la plate-forme Biomark pour effectuer le qPCR multiplexé. Aller de l’avant avec le réglage de l’instrument et la programmation de qPCR suite d’instructions détaillées fournies par le logiciel d’analyse de PCR en temps réel et utilise le protocole de Gene Expression (GE) 96,96 V.1 Standard avec 40 cycles de PCR. Enregistrez le fichier ChipRun dans un dossier désigné.
   Remarque : Plusieurs puces peuvent être exécutées par jour et Pendant plusieurs jours.
7. Analyser les données de qPCR.
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse PCR en temps réel. Ouvrez le fichier « ChipRun.bml » de la « fichier | Menu Open ».
   2. Localisez « Chip Explorer » et « Résumé de Run de puce » dans le coin supérieur gauche de la fenêtre du logiciel. Identifier les trois composantes de la puce Run Résumé : vues d’analyse, échantillon d’installation et installation de détecteur.
   3. Cliquez sur « Détecteur Setup ». En vertu de la « Tâche », cliquez sur « Nouveau » et sélectionnez le type de conteneur « Plaque de SBS » et le format de conteneur « SBS96 ». À côté de « Cartographie », cliquez sur le... et sélectionnez « M96-dosage-SBS96.dsp ».
      1. Facultatif : Assigner chaque détecteur (dosage) un nombre ou un nom dans la section « nom » de chaque puits en double-cliquant sur le 1^st bien. Passer à la suivante en appuyant sur « F2 ».
   4. Cliquez sur « Setup de l’échantillon ». Sous « Tâche » à côté de « Cartographie », cliquez sur le... et sélectionnez « M96-échantillon-SBS96.dsp ».
   5. Cliquez sur « Vues d’analyse ». Sous « Tâche » dans l’onglet « qPCR », sélectionnez « Baseline Correction Linear (dérivé) » et « Ct seuil Method for User (détecteurs) ». Dans l’onglet « Ct seuils », vérifiez la « Initialize avec boîte automatique ». Cliquez sur le bouton « Analyser » ci-dessus.
   6. Dans le quadrant supérieur droit de « Vues d’analyse », cliquez sur le deuxième onglet « Tableau des résultats ». Dans le menu déroulant, sélectionnez « Affichage de carte de chaleur ». La carte thermique avec des données s’affiche.
      1. Facultatif : Pour garantir la puce uniforme fluorescence ROX, sélectionnez « Image View » au lieu de « Chaleur carte View » dans le même menu. Dans le second de la fenêtre de droite au-dessus de la carte de chaleur, sélectionnez « ROX ». Dans la première de la fenêtre de droite, sélectionnez un des cycles de 1 à 40. Cliquez sur la quatrième de la fenêtre de droite pour passer à un affichage en noir et blanc de la fluorescence de ROX. Une image s’affiche qui informe des éclaboussures, des particules, ou les défauts sur la puce. Si l’uniformité ROX est grossièrement obscurcie, ré-exécuter la puce.
   7. Sous la carte thermique, cliquez sur « Seuil » et « Journal graphique ». Ajuster les seuils de Ct manuellement pour chaque détecteur en faisant glisser le seuil nécessaire au point d’intersection des courbes d’amplification dans la phase exponentielle sur les dosages (colonnes de la feuille de chaleur). Une fois terminé, cliquez sur « Analyser ».
8. Exportez les données de qPCR comme un fichier .csv. Importer les données dans un tableur ou un logiciel d’analyse statistique (p. ex., JMP) et cartographier les résultats par échantillon et analyse des positions sur la puce. Organiser les cellules en groupes basés sur l’expression des gènes viraux, en créant une nouvelle colonne et en utilisant une formule conditionnelle. Sous « Analyze », sélectionnez « Fit Y par X » et tracer l’expression des gènes contre le groupe. Appliquer l’analyse statistique.
   NOTE : Représentante unicellulaires l’expression quantitative de quatre espèces d’ARN de SIV est représentée dans les graphiques à deux variables dans la Figure 5 a. L’expression des gènes dans les cellules de SIV RNA⁺ hôte quantitative est montrée dans la Figure 5 b.
9. Extraire valeurs d’expression de protéine quantitative des données de FACS unicellulaires.
   1. Ouvrez le .fcs fichiers à partir de la FACS Trier (étape 6.1) correspondant à la plaque à 96 puits à l’aide de FlowJo version 9. Avec le nom du fichier en surbrillance, sélectionnez « plate-forme | Porte numéro événement | Créer tri indexée gates ». Les cellules individuelles apparaîtra affichées par rangée.
   2. Sélectionnez toutes les 96 cellules (pas de lignes), puis sélectionnez « espace de travail | Export | Sélectionnez des fluors tout compensés ». Sous « Type de données », sélectionnez « Fichier FCS », cliquez sur « Exporter » et sélectionnez un dossier désigné.
   3. Faites glisser les nouveaux fichiers .fcs pour les cellules individuelles dans un nouvel espace de travail FlowJo. Mettre en évidence toutes les cellules, cliquez sur « Ajouter des statistiques » (le bouton « Σ » dans le coin supérieur gauche) » | Veux dire | Tous les paramètres de fluor ».
   4. Ouvrez « Table Editor » en cliquant sur la quatrième case de gauche à droite dans le coin supérieur gauche. Sélectionnez tous les fluores de la première cellule, puis faites-les glisser dans la fenêtre de l’éditeur de table. Dans la fenêtre de l’éditeur de table, cliquez sur le bouton même au sommet « Table de créer et de vue ». Cela créera un tableau de 96 cellules et un paramètre numérique pour chaque fluor.
   5. Copiez la sortie dans un logiciel de base de données (p. ex., MS Excel, JMP), soit copier/coller ou en cliquant sur « Enregistrer et lancer des Application » ((quatrième de la touche gauche au-dessus de la table).
      Remarque : Cette procédure est spécifique pour FlowJo version 9. FlowJo version 10 utilise une procédure différente pour importer les données indexées. Données sur le débit indexée peuvent également être copié/collé dans JMP directement à partir de fichiers .csv créé par le trieur de cellules.
10. Fusionner les données de FACS unicellulaires et qPCR données par le numéro de plaque et bien positionner. Effectuer des analyses graphiques et statistiques sur le gène de la cellule unique combiné (qPCR) et données d’expression (FACS) de protéines.
    Remarque : Exemples de cellule unique combiné qPCR et FACS données sont indiquées à la Figure 6 (accueillir les profils d’expression de la protéine de surface de cellules de macaques rhésus infectés par le SIV, épissé vRNA⁺ ), Figure 7 (expression du gèneCD4 par rapport à la surface CD4 expression de la protéine dans les cellules de macaques rhésus épissés vRNA⁺ ) et précédemment publié²⁰. Pour identifier différentiellement exprimés gènes dans les cellules ou les populations d’intérêt, seule cellule analyse les méthodes décrites précédemment sont recommandée^20,22,23,24, qui représentent la proportion de cellules positives pour un gène ainsi que la valeur de l’expression du gène continue.

Résultats

Le flux de travail pour l’ensemble du protocole est représenté dans la Figure 1. Il se compose de deux variations définies par le nombre de cellules triées : chaque dilution limitante ou en tant que simple de cellules, comme décrit dans le texte. Exemples d’apprêt-sonde analyse de qualification sur 2 fois des dilutions sériées de RNA sont indiquées à la Figure 2. La stratégie de blocage pour identifier les éventu...

Discussion

Le protocole décrit ici, appelé tSCEPTRE, intègre le dosage de la protéine de surface monocellulaire par cytométrie multiparamétrique avec l’expression de l’ARNm unicellulaires quantitative par RT-qPCR hautement multiplexé. L’union de ces deux technologies permet à haute teneur instantanés du combiné transcriptionnelles et profil protéique des cellules individuelles dans un format haut débit. Nous utilisons la méthode pour identifier les cellules jusqu’ici insaisissables infectés par le SIV en v...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD