Imagerie de cellules vivantes de fluorescence de Cell Cycle végétatif complet de la lente croissance sociale bactérie Myxococcus xanthus

Résumé

Les cellules bactériennes sont spatialement organisées. Pour suivre cet organisme au fil du temps dans des cellules de Myxococcus xanthus croissantes lentes, un set-up pour l’imagerie de cellules vivantes de fluorescence à haute résolution spatio-temporelle sur plusieurs générations a été développé. En utilisant cette méthode, la dynamique spatio-temporelle des protéines importantes pour la ségrégation des chromosomes et division cellulaire peut être déterminée.

Résumé

Imagerie de cellules vivantes de fluorescence des cellules bactériennes est une méthode clé dans l’analyse de la dynamique spatiale et temporelle des protéines et des chromosomes qui sous-tendent les événements de cycle de la cellule centrale. Cependant, imagerie de ces molécules à croissance lente bactéries représente un défi en raison de photoblanchiment de fluorophores et phototoxicité lors de l’acquisition de l’image. Nous décrivons ici un protocole simple pour contourner ces limites dans le cas de Myxococcus xanthus (qui a un temps de génération de 4-6 h). À cette fin, M. xanthus cellules croissent sur un épais tapis de gélose contenant des nutriments dans une atmosphère humide à température contrôlée. Dans ces conditions, nous déterminons le temps de doublement des cellules individuelles en suivant la croissance des cellules individuelles. De plus, les cellulaires clés processus tels que la ségrégation des chromosomes et division cellulaire peuvent être photographiées par imagerie de cellules vivantes de fluorescence des cellules contenant des protéines de marqueur fluorescent étiquetés pertinentes telles que service-YFP FtsZ-GFP et mCherry-PomX sur plusieurs cycles cellulaires. Par la suite, les images reçues sont traitées pour générer des montages et des films.

Introduction

Les cellules bactériennes sont spatialement organisées avec plusieurs protéines localisation asymétriquement dans les compartiments cellulaires^1,2,3,4. Cette localisation est souvent très dynamique et change au fil du temps en réponse aux signaux du cycle cellulaire ou signaux externes. De même, le chromosome bactérien est spatialement hautement organisé chaque locus étant positionnés à des emplacements spécifiques subcellulaires avant et Pendant le processus de ségrégation⁵. Cette organisation spatiale dynamique est importante pour la croissance, la division, régulation du cycle cellulaire, différenciation, motilité, transduction du signal ainsi qu’organisation chromosomique et ségrégation ; ainsi, elle touche essentiellement tous les aspects de la fonction bactérienne.

La dynamique spatio-temporelle de ces processus cellulaires est analysée dans une variété de différentes espèces de bactéries avec Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio choleraeet Caulobacter crescentus desservant aussi important organismes modèles. Toutefois, ces quatre espèces couvrent seulement une petite de l’énorme diversité bactérienne et, peut-être sans surprise étant donné la grande distance phylogénétique entre les espèces, les mécanismes cellulaires de l’organisme et la polarisation sont différents dans ces bactéries. Cela déclenche la nécessité d’étudier des espèces bactériennes supplémentaires pour pouvoir éventuellement extraire des principes généraux qui sous-tendent la dynamique spatio-temporelle des cellules bactériennes.

Le delta-protéobactérie Gram- M. xanthus est un organisme modèle dans l’étude des comportements sociaux et la coopération en bactéries⁶. M. xanthus est un aérobie strict et en présence de nutriments, il forme des colonies où les cellules propagent vers l’extérieur dans un très coordonnée, essaimage de mode et de proies sur les autres micro-organismes⁷. En réponse à la famine en nutriments, les cellules initier un programme de perfectionnement qui conduit à la formation des organes de fructification qui se compose de milliers de cellules et à l’intérieur duquel, les cellules mobiles en forme de bâtonnet différencient à sphérique diploïde spores⁸. Les deux types de comportements, c'est-à-dire, essaimage et formation de l’organe de fructification, sont exécutées uniquement par les cellules qui sont placés sur une surface solide. En outre, sous les deux conditions de nutrition, les cellules s’engager dans les processus qui impliquent des contacts directs cellule-cellule, notamment par l’échange des lipoprotéines de membrane externe qui peut stimuler la motilité ou servir de toxines dans le destinataire^9,10 , l’échange de LPS¹¹, stimulation de la motilité par exopolysaccharides sur les voisins des cellules¹²et surface-ancré par une cellule de signalisation intercellulaire signalisation protéines^13,14.

Récemment, M. xanthus est également devenu un organisme modèle pour étudier les mécanismes qui sous-tendent la motilité et son règlement¹⁵, la division cellulaire^16,17,18et organisation chromosomique^{19 ,20,21}. Les étapes critiques de la M. xanthus cycle cellulaire ont été analysés en détail par microscopie de fluorescence à l’aide d’images instantané ou courts enregistrements Time-lapse sur souches porteuses des protéines fluorescent étiquetés^{16, 17,18,19,20}. Idéalement, plusieurs cellules devraient être suivis avec une cellule unique résolution de cellules vivantes fluorescence imaging pour au moins un cycle cellulaire complet obtenir des données quantitatives robustes sur les paramètres du cycle cellulaire. Cependant, c’est un défi de M. xanthus en raison de son relativement longue durée de génération de 4 à 6 h dans des conditions standard de laboratoire et photoblanchiment des fluorophores et phototoxicité lors de l’acquisition de l’image.

Nous décrivons ici un protocole à suivre M. xanthus cellules avec résolution unicellulaire par fluorescence vivre-cellule d’imagerie pendant au moins 24 h et couvrant plusieurs cycles cellulaires. Important, au cours de l’ensemble du protocole, les cellules sont maintenues sur un bloc de gélose et dans close contact permettant l’activité dépendante de contact essentiels pour le style de vie social de M. xanthus. Le protocole permet également aux utilisateurs de moniteur forme, taille, divisions et sondes fluorescentes à une haute résolution temporelle et à la résolution unicellulaire et ainsi, permet la quantification de la variabilité de la cellule-cellule et corrélations des événements de cycle de cellules.

Protocole

1. la préparation et la croissance des M. xanthus souches

Remarque : Voir tableau 1 et tableau 2.

1. Préparer 1 % casitone bouillon (CTT) croissance moyenne 1 % (p/v) Hydrolysât de caséine (p. ex., Bacto casitone), 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KH₂PO₄ pH 7, 6, 8 mM MgSO₄²², additionné de kanamycine (50 µg/mL) ou oxytétracycline (10 µg/mL). Ajouter gentamycine (10 µg/mL) à tous les médias pour réduire le risque de contamination par d’autres bactéries, depuis M. xanthus cellules résistent naturellement à elle.
2. Inoculer 5 mL 1 % CTT contenant les contient avec une seule colonie fraîchement cultivée de wild type (WT) DK1622 ²³, SA4420 (ΔmglA)²⁴, SA4797 (ΔmglA, ΔpomX/P_pomZ mCherry-pomX )¹⁶, SA8241 (ΔmglA, ftsZ⁺/p_natftsZ-gfp), ou SA4749 (ΔmglA, service⁺/p_natservice-yfp) dans le matin du jour 1.
   1. Remettre en suspension une seule M. xanthus colonie de 500 µL de 1 % CTT additionné d’antibiotiques dans un tube stérile et transférer la suspension ensemble dans un erlenmeyer contenant 5 mL de 1 % de 50 mL CTT.
      Remarque : Utilisez une fiole d’Erlenmeyer de 10 fois le volume de la culture pour garantir le déplacement suffisant et une croissance optimale.
3. Cultiver les cellules huit générations (environ 40-48 h avec un temps de génération de 4 à 6 h) à 32 ° C, agitation à 220 tr/mn, dans l’obscurité. Maintenir les cellules en phase de croissance exponentielle (OD₅₅₀ < 1.2) et de l’empêcher d’atteindre la phase stationnaire. Si nécessaire, diluer les cellules dans un milieu CTT 1 % frais contenant l’antibiotique pertinents à une OD₅₅₀ de 0,1 - 0,2.
   Remarque : Une optimale de l’OD₅₅₀ pour la microscopie d’une seule cellule est de 0,5 - 0,7. Cette OD₅₅₀, un nombre suffisant de cellules se présent par image pour permettre la quantification ainsi que l’analyse statistique des paramètres cellulaires.

2. préparation des échantillons de microscopie

Remarque : Pour être vu au microscope, les cellules sont placées sur une lamelle de microscope et puis recouvert d’un coussin de gel d’agarose contenant des éléments nutritifs. La lamelle est collée à un plastique ou métal frame fournisse mécanique de soutien. En préparation pour la microscopie, un gros bloc de 1 % agarose/TPM/0.2% CTT doit être préparé à l’avance comme décrit aux points 2.1 à 2.3. Veuillez également consulter la Table des matières pour des produits spécifiques utilisés ici.

1. Préparer 500 mL de tampon (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM KH₂PO₄ pH 7, 6, 8 mM MgSO₄) de la TPM et autoclave ou filtre stériliser à l’aide d’un filtre supérieur de la bouteille.
   Remarque : Le tampon stérile peut être stocké pendant plusieurs mois à température ambiante.
2. Préparer la solution à 1 % d’agarose microscopie contenant 0,2 % CTT (mélange 1 g d’agarose avec 80 mL de tampon de TPM et 20 mL de milieu de CTT de 1 %). Faire chauffer dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose est fondu.
   Remarque : Le 0,2 % CTT est suffisante pour permettre aux cellules de croître et de prévenir la famine. Des concentrations plus élevées de CTT dans le milieu de la microscopie seront traduira par la fluorescence de fond élevé.
3. Remplir une boîte de Pétri avec l’agarose fondu jusqu'à une épaisseur de 0,5 cm (pour une place de 11,5 x 11,5 cm boîte de Pétri, environ 60 mL d’agarose fondu est nécessaire) et laisser refroidir à température ambiante.
   Remarque : Le coussin de gel d’agarose peut être stocké à 4 ° C en milieu humide pendant 2 jours.
   1. Réchauffez le pad CTT 1 % agarose/TPM/0.2% à 32 ° C pendant au moins de 15 min avant de les utiliser.
      Remarque : Pour préparer les cellules pour la microscopie, suivez les étapes 2.4-2.8.
4. Placez une lamelle de verre stériles (60 mm x 22 mm, épaisseur : 0. 7 mm) sur un châssis en plastique ou en métal qui a un trou au milieu (Figure 1A) ; ce cadre sert de support mécanique pour la mince lamelle et contribue à réduire la dérive au cours de la microscopie. Fixer la lamelle sur le cadre avec du ruban.
   1. Pour préparer le cadre, découper une trame de 75 × 25 mm d’une plaque de métal épaisse de 1 mm, puis découpez un trou de taille appropriée (20 × 30 mm dans cette expérience) au milieu.
5. Ajouter 10 à 20 µL de façon exponentielle cultivés M. xanthus cellules sur la lamelle couvre-objet.
6. Ajouter fluorescent 0,5 µm microsphères comme marqueurs fiducial aux cellules pour simplifier le suivi des cellules et les protéines en Time-lapse enregistrements.
   1. Diluer au 1/100 de microsphères dans la mémoire tampon de module de plateforme sécurisée et conserver à 4 ° C pendant plusieurs mois. Bien agiter avant utilisation et ajouter 5 à 10 µL des microsphères dilués dans les cellules.
      NOTE : Ici microsphères qui sont fluorescents dans tous les Argus bleu, vert, jaune et rouge fluorescent canaux ont été utilisés.
7. Découper un petit coussinet environ la taille de la lamelle de la grande électrode préchauffée 1 % agarose/TPM/0.2% CTT et placez-le sur le dessus des cellules (Figure 1B). Placez un lamelle couvre-objet sur le dessus de la touche 1 % agarose/TPM/0.2% CTT d’agarose pour éviter l’évaporation et de maintenir les cellules en milieu humide.
   Remarque : La lamelle seule empêchera importante évaporation pendant au moins 2 h. Pour plus de Time-lapse recordings, le sandwich de pad et lamelle CTT agarose/TPM/0.2% 1 % doit être collé avec film de paraffine pour éviter l’évaporation.
8. Incuber l’échantillon de microscopie à 32 ° C pendant 15-20 min à laisser les cellules à attacher au fond de la touche de gel d’agarose. Puis commencer les enregistrements de Time-lapse de la microscopie.

3. microscope mise en place et Acquisition de Time-lapse

Remarque : Le protocole décrit ici a été développé pour un microscope widefield inversé avec autofocus, un 100 X / NA 1,30 huile PH3 objectif, un X, Y motorisé scène, une caméra sCMOS, une source lumineuse, filtres pour vert fluorescent, fluorescente rouge ou jaune fluorescent protéines et à une température contrôlée chambre d’incubation. Cette chambre maintient les cellules protégées de la lumière et à température constante.

1. Préchauffer la chambre d’incubation et le microscope à 32 ° C pendant environ 1-2 h avant de commencer la microscopie.
   Remarque : Selon la configuration de microscope, chauffage peut prendre plus longtemps. Préchauffage est essentielle pour réduire la dérive et stabilise le système de contrôle de mise au point automatique.
2. Mettre le microscope et démarrer le logiciel de contrôle de microscope. Sélectionner l’objectif correct et les miroirs correctes et les filtres d’acquérir la phase images contrastées ainsi que des images des protéines vert fluorescent, fluorescent rouge ou jaune fluorescent.
   NOTE : Un microscope est généralement fourni avec un logiciel préféré pour l’acquisition de contrôle et de l’image microscope. Ici un logiciel disponible dans le commerce (voir la Table des matières) a été utilisé pour contrôler l’acquisition microscope et image.
3. Ajouter une goutte d’huile à immersion haute qualité sur la lentille de l’objectif et à la partie inférieure de l’échantillon préalablement incubée à 32 ° C. Placer l’objectif à la Z-position la plus basse pour éviter d’endommager la lentille de l’objectif lorsque l’échantillon est placé sur la platine du microscope. Placer l’armature en métal avec l’échantillon sur la platine du microscope et du « trou-côté » vers l’objectif. Fixer solidement l’échantillon dans le support de la scène.
4. Mettre l’accent sur les cellules en déplaçant la scène dans la direction Z plus près de l’objectif. Déplacer la scène plus lente lorsque l’huile descend du côté inférieur d’échantillon et la lentille d’objectif faire contact. Déplacer la scène de X / Y direction jusqu'à plusieurs cellules individuelles sont visibles dans la région de vue, lorsque les cellules sont dans le plan focal. Assurez-vous qu’au moins un microsphères fluorescentes est dans la région de vue afin de le pour aligner plus tard les images acquises.
   NOTE : Dans des conditions optimales, une densité cellulaire des cellules de 15-30 par région d’affichage (2 048 x 2 048 pixels ou 133,1 x 133,1 µm) devrait être atteint.
5. Ouvrez l’Assistant Acquisition Multi-Dimensional le microscope de logiciels de contrôle à mettre en place une expérience de laps de temps qui permet au microscope acquérir des images à plusieurs longueurs d’onde et les postes de stage si nécessaire.
   1. Dans l’onglet principal activer Timelapse et Plusieurs longueurs d’onde. Des onglets supplémentaires apparaîtront sur le côté gauche de la fenêtre.
   2. Cliquez sur l’onglet enregistrement , puis Sélectionner un répertoire pour sélectionner un dossier vide sur le disque dur de l’ordinateur pour enregistrer les images acquises. Activer le nom d’augmentation d’échelon de base si le fichier existe pour s’assurer que des ensembles de données consécutifs n’écrasent pas les précédents. Donnez à l’expérience un nom avec la date et le nom de souche ou le titre de l’expérience.
   3. Cliquez sur l’onglet Timelapse d’ajuster les paramètres Time-lapse. La valeur durée 24h et définissez l’Intervalle de temps de 20 min. Le Nombre de Points dans le temps changera automatiquement.
      Remarque : L’intervalle de temps optimal dépend de l’expérience et la fonction cellulaire à analyser. Acquisitions d’image fréquents peuvent causer photoblanchiment. Ainsi, un compromis entre la résolution temporelle et photoblanchiment il faut trouver empiriquement. À un temps de doublement de 4 à 6 h, les images peuvent être facilement acquises à un intervalle de 5 min (ou des intervalles encore plus faible si vous le souhaitez) pour microscopie à contraste de phase. Si la microscopie de fluorescence au cours d’un temps de 24 h est souhaitée images doivent être enregistrées à un intervalle d’environ 15 à 30 min.
   4. Cliquez sur l’onglet de longueurs d’onde . Sélectionnez le nombre de longueurs d’onde à acquérir pour chaque image à chaque instant en changeant le nombre.
      Remarque : pour chaque longueur d’onde, un nouvel onglet s’affiche sur le côté gauche de la Multi-Dimensional Acquisition » Assistant et longueurs d’ondes seront acquis dans l’ordre de haut en bas. Pour chaque longueur d’onde, les paramètres d’acquisition peuvent être modifiés séparément.
   5. Cliquez sur le premier onglet de la longueur d’onde du haut. Dans la liste déroulante Illumination , sélectionnez contraste de Phase . Sélectionnez 100 ms pour l’exposition , puis Chaque fois Point dans la liste déroulante Acquire . Désactiver l’Auto exposer en sélectionnant jamais dans la liste déroulante.
   6. Répétez l’étape 3.5.5 pour chaque longueur d’onde qui doit être acquis à chaque instant. Pour le montage expérimental et protéines fluorescent étiquetés décrits ici, utilisez les paramètres suivants pour exposition : 250 ms pour les protéines de fusion mCherry, 200 ms pour les protéines de fusion YFP et 1 000 ms pour les protéines de fusion de GFP.
      Remarque : Les paramètres d’éclairage optimal pour chaque souche et de la protéine fluorescente doivent être déterminées à l’avance en changeant l’intensité de la lampe et la durée d’acquisition d’image pour chaque longueur d’onde. Délais d’acquisition image trop longue augmentera l’effet phototoxique et finalement conduire à croissance arrestation et la mort cellulaire. Donc, un compromis entre la viabilité cellulaire et de la qualité d’image doivent être réalisé.
   7. Acquisition d’images à partir de multiples positions étape pour augmenter le nombre de cellules a enregistré dans la même expérience.
      1. Pour acquérir des images à partir de plusieurs positions de stade, activer Plusieurs postes de Stage dans l’onglet principal . Cliquez sur l’onglet étapes , puis cliquez sur le bouton Live à regarder le champ de vision.
      2. Déplacer la scène sur l’axe X/Y, jusqu'à ce qu’une région d’intérêt (ROI) est dans le champ de vision. Enregistrer les coordonnées X et Y en cliquant sur le «+» de l’onglet scène redéplacer la scène encore une fois sur l’axe X/Y jusqu'à ce qu’un nouveau ROI est trouvé et enregistrer les coordonnées en cliquant sur le «+». Continuer jusqu'à ce que le nombre désiré de régions est enregistré.
         Remarque : En cas d’acquisition d’images de fluorescence, s’assurer que les régions d’intérêt (ROIs) ne sont pas trop près de l’autre afin de minimiser la phototoxicité.
6. Vérifier une fois de plus que les cellules sont en discussion en cliquant sur les différents sauvé X - et Y-positions et démarrer l’autofocus de matériel en cliquant sur AFC hold pour garder la position Z sauvée constant au cours de l’expérience.
7. Lancez l’enregistrement Time-lapse dans le logiciel de commande de microscope en cliquant acquérir dans l’Assistant d’Acquisition Multi-Dimensional .
   NOTE : Une fenêtre s’affiche pour chaque longueur d’onde qui est acquis et une fenêtre supplémentaire s’affiche qui indique le nombre de points dans le temps acquis et le temps jusqu'à la prochaine acquisition de photo.
8. Vérifiez que les cellules sont toujours en discussion après les quelques premiers temps-points dans les enregistrements de Time-lapse pour maximiser la qualité des images et réorienter si nécessaire.

4. génération de films Time-lapse et alignement de l’Image

Remarque : Plusieurs logiciels commerciaux et gratuits sont disponibles pour l’acquisition d’images et analyse d’images. Nous utilisons un logiciel disponible dans le commerce (voir la Table des matières) avec plusieurs plugins pré-installée et des outils supplémentaires.

1. Sauver les images individuelles de Time-lapse enregistrements sur un ordinateur équipé du logiciel d’analyse/traitement image installé.
2. Lancez le logiciel et ouvrir des images comme une pile en cliquant sur données Multi-Dimensional Review | Sélectionnez fichier de Base | Sélectionnez le répertoire. Ouvrez le dossier contenant les données multidimensionnelles. Vérifier le jeu de données, cliquez sur View; le dataset s’afficheront comme des images simples de temps point un jusqu'à la fin. Activer la longueur d’onde (pour la création d’une pile), sélectionnez toutes les images qui devraient être dans la pile et cliquez sur Load image (s). Répétez cette étape pour toutes les longueurs d’onde et enregistrer dûment rempli.
3. (Facultatif) Ouvrez toutes les images nécessaires pour le film à l’aide de fichier | Ouvert.
   Remarque : Il est recommandé d’ouvrir des images par une longueur d’onde acquise à la fois pour ne pas ralentir l’ordinateur si la puissance de calcul est limitée. Si certaines parties de l’enregistrement Time-lapse, par exemple, au début, la fin ou plusieurs points dans le temps doivent être ignorées, puis peut être ajustée par le film terminé.
4. Activer la pile d’images qui doit être corrigée de la dérive. Ouvrez l’outil d’alignement en Apps | Auto Align... cocher pile comme source pour les images et le premier avion/heure point comme plan de référence. Sélectionnez la pile avec le bouton pile Source , puis cliquez sur appliquer.
   Remarque : L’alignement automatique prendra du temps et la puissance de calcul mais est un bon moyen pour corriger les grandes cheminées de la dérive de la mise en place de microscope. Cet alignement automatique fonctionne bien si les microsphères sont inclus, mais peuvent aussi fonctionner sans eux.
5. Économiser la pile alignée.
6. Utilisez des ROIs.
   Remarque : La microscopie fluorescente Time-lapse crée facilement des ensembles de fichiers de données qui prennent beaucoup de puissance de calcul et de ralentissent le traitement en aval de ces films. Nous recommandons donc vivement pour identifier des ROIs et isoler les cellules de travailler avec des fichiers plus petits.
   1. Sélectionnez l’outil Zone rectangulaire . Créer un retour sur investissement autour des cellules d’intérêt en traçant manuellement un retour sur investissement sur l’image de contraste de phase. Assurez-vous que les cellules d’intérêt sont visibles et mise au point tout au long du film ensemble Time-lapse.
   2. Ouvrir le film Time-lapse de la seconde longueur d’onde du même dataset. Pour transférer le retour sur investissement sur les photos de contraste de phase à la fluorescence des images de la seconde longueur d’onde utilisent l’outil de Transfert régions avec régions | Transfert des régions. Sélectionnez le dataset de contraste de phase comme Image Source et le deuxième ensemble de données de longueur d’onde comme Image de Destination. Toutes les régions et cliquez sur OK.
   3. Répétez l’étape 4.6.2 pour chaque longueur d’onde acquise pour le même groupe de données.
   4. Sélectionnez le ROI et les reproduire comme une pile avec Edit | Dupliquer | Pile... ou appuyez sur les touches Maj + Ctrl + D . Puis enregistrez la pile dupliquée avec fichier | Enregistrer dans le même dossier que les données d’origine.
   5. Répétez l’étape 4.6.4 pour chaque ROI de chaque longueur d’onde acquise pour le même groupe de données
7. Pour produire un film en format MOV ou AVI, ouvrez la fonction de Créer un film via pile | Faire film. Sélectionnez les enregistrements que les Time-lapse avec la touche Source pile . Sélectionnez le format de sortie, le frame rate, le nombre d’images, puis cliquez sur Enregistrer.

Résultats

M. xanthus est une bactérie à croissance lente qui se déplace sur des surfaces solides. Pour tester notre système expérimental, nous avons réalisé une expérience en Time-lapse avec cellules WT DK1622 mobiles. Images de contraste de phase ont été acquises à intervalles de 5 min pendant 24 h (Figure 2A, B). La majorité des cellules alignées dans les groupes. Comme prévu, cellules affichent la motilité et s’installe surtout dans les groupes. Plus loin, nous avons observé que les cellules inversée occasionnellement direction du mouvement. Ces résultats suggèrent que les cellules WT dans les conditions testées se comportent normalement sur le plan de la motilité cellulaire. Toutefois, même lorsque les cellules sont enregistrées toutes les 5 min, l’identification de cellules individuelles est difficile. En outre, parce que les cellules sont motiles, nombreuses cellules échappent ou entrer dans le champ de vision, rendant difficile de suivre les cellules pendant des périodes prolongées.

Afin de retrouver le même M. xanthus cellules pour plusieurs séances du cycle cellulaire par imagerie de cellules vivantes, les souches individuelles peuvent être supprimés pour le gène mglA , qui est essentiel pour la motilité²⁵. Cela empêche les cellules de se déplacer hors du champ de vision pendant le protocole d’imagerie. Destructions dans leur cadre sont générées tel que décrit par Shi et al. ²⁶

Comme prévu, en phase contraste vivre-cellule imagerie avec cellules demglA Δ non motiles (Figure 3), les cellules ne manifestaient pas de mouvement actif. Nous avons été en mesure de suivre la croissance et la division des cellules individuelles au cours de la formation de microcolonies. Basée sur les enregistrements de Time-lapse dans lequel les images ont été acquises à intervalles de 5 min pendant 24 h, il a été possible de quantifier le temps interdivision (le temps entre deux événements de la division cellulaire) avec résolution de cellule unique. Cellules du mutantmglA Δ a traversé une période inter-division 235 ± 50 min (n = 97 cellules). Avec environ 4 h, le temps interdivision est semblable à du temps de doublement mesuré dans les cultures de suspension de cellules WT. Ceci fournit la preuve que M. xanthus cellules se développent de façon optimale dans ces conditions expérimentales.

Afin de vérifier si notre système permet aux cellules de se développer normalement tout en suivant les protéines marquées YFP sur de longues périodes, nous avons effectué le Time-lapse avec l’imagerie de fluorescence M. xanthus cellules qui expriment une protéine YFP-étiquetée. À cette fin, nous avons suivi service-YFP comme marqueur pour l’origine de réplication (ori). Service est comme composante du système PerraultS dans M. xanthus et se lie aux sites parS proximales de l' ori; par conséquent, la ségrégation de duplication et le chromosome d’origine peut être suivi^19,20,21. Avec image acquisition (contraste de phase et la fluorescence, 200 ms temps d’acquisition dans le canal de la YFP) toutes les 20 min, cellules a augmenté, divisé et affichent la croissance même après 24 h (Figure 4A). Au début des enregistrements, service-YFP a formé deux groupes dans les régions sub-polaires dans la majorité des cellules (Figure 4A). Peu de temps avant ou après la division cellulaire, le service-YFP subpolaire cluster au pôle ancienne cellule dupliqué. L’un des deux amas est resté au vieux pôle cellulaire tandis que la deuxième copie transloqué au pôle cellulaire nouveau, atteignant sa position finale subpolaire après environ 40-60 min (Figure 4A, B). Ces observations sont en accord avec les données précédentes produites de courts enregistrements Time-lapse utilisant agar minces plaquettes¹⁹. Nous concluons que ce montage expérimental permet de fluorecence Time-lapse suivre la ségrégation des chromosomes au cours de plusieurs cycles de cellules à croissance lente M. xanthus cellules, sans perturbant la croissance cellulaire ou les mécanismes de ségrégation chromosomique.

Dans une expérience similaire, nous avons cherché à suivre les marqueurs à la division cellulaire par microscopie de fluorescence Time-lapse. Semblable à presque toutes les autres bactéries, M. xanthus nécessite FtsZ, une GTPase bactérienne de tubuline-comme, pour la division cellulaire^16,17,18. FtsZ forme une structure d’anneau comme à midcell, le Z-ring ce qu’on appelle, qui vous aide à recruter toutes les autres protéines nécessaires à la division cellulaire^27,28. Dans M. xanthus, la formation de la "Z-ring" et son positionnement à midcell est stimulée par les trois PomXYZ protéines^16,17. Ces trois protéines forment un complexe associée à chromosome qui transfère à travers le nucléoïde du site de la division cellulaire dans les cellules « mère » au milieu du nucléoïde dans les deux cellules filles. Au milieu du nucléoïde coïncide avec midcell, avant la ségrégation des chromosomes et ici les recrues complexes PomXYZ FtsZ et stimule la formation de "Z-ring".

Ici, nous avons tout d’abord suivi non motiles cellules exprimant ftsZ-gfp. Parce que FtsZ-GFP global montre une fluorescence plus faible signal que service-YFP, nous avons augmenté le temps de pose 5 fois à 1 s dans le chenal GFP. Comme prévu, forte accumulation de FtsZ-GFP n’était observée à midcell et cette localisation dicté la position de constriction de la division cellulaire (Figure 5A). FtsZ-GFP principalement forme un groupe à midcell dans la cellule plus longtemps. Il était également évident que ce groupe a augmenté en intensité au fil du temps. Après la division cellulaire, nous avons observé que FtsZ-GFP nouveau accumulé à midcell dans la fille de deux cellules environ 2 h plus tard (Figure 5B). Ceci est conforme à la conclusion qu’environ 50 % des cellules dans une population afficher FtsZ localisation à midcell basé sur l’analyse instantané^16,17.

Dans une seconde expérience, nous avons suivi Δ non motilesmglA cellules pendant 24 h exprimant mCherry-pomX. Dans le cadre du système PomXYZ, PomX contribue à guider la formation "Z-ring" et le positionnement, stimulant ainsi la division cellulaire à midcell¹⁶. Le signal de fluorescence de mCherry-PomX est fort et permet un temps de pose dans le chenal de la fluorescence de Mme 250 ce qui est important, toutes les cellules ont augmenté en taille et affichent un événement de la division cellulaire au cours de l’expérience, formant des microcolonies après 24h ( Figure 6A). Comme indiqué précédemment¹⁶, presque toutes les cellules contiennent un cluster mCherry-PomX. La majorité d'entre eux localisée à midcell et regroupements de midcell transloqué à midcell au cours de l’expérience. Au cours des divisions cellulaires, mCherry-PomX grappes étaient divisés, avec chaque cellule-fille reçoit un cluster. Par opposition à FtsZ-GFP, mCherry-PomX localisée à midcell 80-90 % du cycle cellulaire et atteint cette position peu après division cellulaire (Figure 6B).

Figure 1 : Schématique du montage expérimental utilisé tout au long de cette étude. (A) A métal ou plastique cadre sert de support pour l’échantillon. Un lamelle couvre-objet est fixé à l’armature en métal avec du ruban adhésif pour réduire le mouvement de l’échantillon. Côté (B) vue de la mise en place expérimentale d’échantillon. Les cellules sont montées sur la lamelle couvre-objet montré en (A). Le coussin de gel d’agarose qui fournit les nutriments et l’humidité pour les cellules est placé au-dessus des cellules. Le coussin de gel d’agarose est couvert par une lamelle couvre-objet supplémentaire pour réduire l’évaporation. Pour des images de haute qualité, un objectif de contraste en phase 100 X huile d’immersion est utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Phase contraste microscopie Time-lapse de WT M. xanthus cellules. Les cellules ont été suivis pendant 24h et images ont été acquises chaque 5 min. (A) apparaissent des images représentatives du champ de vision même toutes les 5 min. Flèches de couleur indiquent la directionnalité de la circulation des cellules individuelles. La même couleur marque la même cellule au fil du temps. Les nombres indiquent la durée en minutes. Barre d’échelle : 5 µm. (B) image du même champ de vision après toutes les heures sont affichées. Notez que le même champ de vision est montré mais parce que les cellules sont déplacent, les cellules sont constamment entrant et quittant le champ de vision. Les nombres indiquent la durée en heures. Barre d’échelle : 5 µm. PH : contraste de phase. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Phase contraste microscopie Time-lapse de non motiles M. xanthus cellules. Les cellulesmglA Δ ont été suivies pour 24 h. Images ont été acquises toutes les 5 min et images représentatives après toutes les heures sont indiquées. Sélectionné la division cellulaire des constrictions sont marquées par des flèches orange. Les nombres indiquent la durée en heures. PH : contraste de phase. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Time-lapse microscopie de fluorescence de service-YFP dans non motiles M. xanthus cellules. Cellules d’un ΔmglA mutantservice-yfp exprimant en présence de native service (SA4749 ; ΔmglA; service ⁺/P_natservice-yfp) ont été suivies de microscopie par fluorescence et de contraste de phase pendant 24 h. (A) des Images ont été acquises toutes les 20 min et représentant des images toutes les heures jusqu'à 10 h sont présentés, avec les mêmes cellules après 24 h. Images sont affichées en contraste de phase (PH) et le recouvrement du contraste de phase et la YFP signalent. Certaines divisions cellulaires sont marquées par des flèches orange. Les flèches blanches et vertes indiquent YFP-service cluster duplication évènements, avec les flèches vertes marquant le cluster translocating. Les nombres indiquent la durée en heures. Barre d’échelle : 5 µm. (B) les Images ont été acquises comme dans (A) mais sont affichés à plus haute résolution temporelle. Les nombres indiquent la durée en minutes. Les flèches sont comme dans (A). Barre d’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Time-lapse microscopie de fluorescence de FtsZ-GFP dans non motiles M. xanthus cellules. Cellules d’un mutant demglA Δ exprimant ftsZ-gfp en présence de native ftsZ (SA8241 ; ΔmglA; ftsZ ⁺/P_natftsZ-gfp) ont été suivis pendant 24 h par microscopie de fluorescence et de contraste de phase. (A) des Images ont été acquises toutes les 20 min et images représentant toutes les heures jusqu'à 10 h sont affichés, ainsi que les mêmes cellules après 24 h. les Images sont affichées en contraste de phase (PH) et comme superposition de contraste de phase et le signal de la GFP. Certaines divisions cellulaires sont marquées par des flèches orange. Flèches blanches indiquent les clusters FtsZ-GFP à midcell. Les nombres indiquent la durée en heures. Barre d’échelle : 5 µm. (B) les Images ont été acquises comme dans (A) mais sont affichés à plus haute résolution temporelle. Les nombres indiquent la durée en minutes. Les flèches vertes et blanches marquent les grappes FtsZ-GFP dans les cellules de droite et de gauche, respectivement. Les flèches orange indiquent des divisions cellulaires. Barre d’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Time-lapse fluorecence du mCherry-PomX dans non motiles M. xanthus cellules. Les cellules Δ non motilespomX accumulant mCherry-PomX (SA4797 ; ΔmglA; ΔpomX/P_pomZ mCherry-pomX) ont été suivis pendant 24 h par microscopie de fluorescence et de contraste phase chaque 20 min. (A) représentant images toutes les heures jusqu'à 10 h sont affichées, ainsi que les mêmes cellules après 24 h. les Images sont affichées en contraste de phase (PH) et comme superposition de contraste de phase et mCherry signal. Certaines divisions cellulaires sont marquées par des flèches orange. Les flèches blanches et vertes indiquent mCherry-PomX grappes avant et après le fractionnement des événements, respectivement. Les nombres indiquent la durée en heures. Barre d’échelle : 5 µm. (B) les Images ont été acquises comme dans (A) et sont affichés à plus haute résolution temporelle. Les flèches sont comme dans (A). Barre d’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Souche bactérienne	Pertinents de génotype1	Référence
DK1622	Type sauvage	23
SA4420	ΔmglA	24
SA4749	ΔmglA ; service+/attB:: Pnatservice-yfp (pAH7)	Cette étude
SA4797	ΔmglA; ΔpomX / attB ::PpomZ mCherry-pomX (pAH53)	16
SA8241	ΔmglA ; ftsZ+/ mxan18-19 ::PnatftsZ-gfp (pDS150)	Cette étude
Plasmides parenthèses contiennent des fusions de gènes indiquée et étaient intergated sur les sites indiqués sur le génome. Plasmides intégrés sur le site attB ou la région intergénique mxan18-19 ont été exprimées de leur promoteur natif P (nat) ou le promoteur natif de pomZ (PpomZ).

Tableau 1 : Liste des souches bactériennes utilisées dans cette étude.

Plasmides	Caractéristiques pertinentes	Référence
pAH7	Pnatservice-yfp; Mx8 attP; TETR	19
pAH53	PpomZ mCherry-pomX; Mx8 attP ; KmR	16
pDS150 1	PnatftsZ-gfp ; mxan18-19 ; TETR	Cette étude
pMR3691	Plasmides pour l’expression des gènes inductibles par le vanillate	18
pKA51	PnatftsZ-gfp ; Mx8 attP ; TETR	17
1 pDS150 : pDS150 est un dérivé de pKA51, dans lequel le site attP Mx8 a été remplacé par la région intergénique mxan18-19 . Pour cela la région intergénique mxan18-19 a été amplifiée à partir de pMR3691 avec des amorces Mxan18-19 fwd BsdRI (GCGATCATTGCGCGCCAGACGATAACAGGC) et Mxan18 19 rev BlpI (GCGGCTGAGCCCGCGCCGACAACCGCAACC) et cloné en pKA51.

Tableau 2 : Liste des plasmides utilisés dans cette étude.

Discussion

Imagerie de cellules vivantes de fluorescence est devenu un outil puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle des cellules bactériennes. La microscopie de fluorescence Time-lapse de bactéries croissants motiles et lentes comme M. xanthus, cependant, a été difficile et a été réalisée uniquement pour courtes durées. Nous présentons ici une méthode robuste et facile à utiliser pour l’imagerie de cellules vivantes de M. xanthus par microscopie de fluorescence Time-lapse. Cette méthode permet à l’utilisateur de suivre les cellules et protéines fluorescent étiquetés pour plusieurs séances du cycle cellulaire avec une résolution de cellule unique.

Il y a plusieurs conditions qui influent sur le succès de l’imagerie de cellules vivantes de croissance lente M. xanthus cellules y compris : 1) une surface solide pour la fixation des cellules ; 2) la disponibilité des nutriments et l’oxygène ; 3) constante humidité et température ; et 4) l’optimisation des conditions expérimentales comme la fréquence d’exposition temps et image d’acquisition.

Dans notre contexte expérimental, nous utilisons pads épais d’agarose additionnés d’éléments nutritifs. À l’aide de tampons épais d’agarose par opposition aux dispositifs microfluidiques suivre monocellules a certains avantages fondamentaux mais aussi quelques inconvénients. Tout d’abord, le coussinet de gel d’agarose fournit non seulement une surface pour M. xanthus cellule d’attachement et de mouvement mais aussi de nutriments suffisants pour la croissance pendant au moins 24 h. Deuxièmement, snap shot analyses couramment utilisées pour étudier la localisation intracellulaire des protéines fluorescent étiquetés se faisait auparavant sur le même type d’agarose tampons^16,17,29. Par conséquent, données de snap shot analyses peuvent être directement comparées aux résultats obtenus avec la méthode décrite ici. Troisièmement, d’agarose tampons peuvent être facilement modifiés et additionnés d’antibiotiques ou d’autres suppléments tels que CuSO₄ et le vanillate qui sont couramment utilisés pour gene expression induction^18,30. Enfin, parce que les cellules sont autorisés à des microcolonies de forme au cours d’une expérience, cette configuration permet également étudier l’effet des interactions cellule-cellule directe sur le paramètre particulier cours d’analyse. Cet aspect est particulièrement important dans le cas de M. xanthus car cette bactérie affiche plusieurs interactions de contact-dépendante. Le principal inconvénient de cette méthode est que les conditions expérimentales sont préréglées pour la durée de l’expérience. En revanche, Dispositifs microfluidiques permettent généralement changer les conditions expérimentales au cours d’une expérience en ajoutant par exemple des antibiotiques³¹.

Les paquetages de logiciels libres (p. ex., MicrobeJ, Oufti) sont disponibles pour l’analyse automatiquement la croissance des cellules individuelles et la localisation des protéines dans des cellules individuelles. Toutefois, ces logiciels ne sont bien adaptés pour l’analyse des cellules isolées ou de petits groupes de cellules. Ainsi, il reste un défi pour analyser automatiquement les données générées pour les enregistrements de 24h décrites ici.

En résumé, nous avons décrit un protocole facile à utiliser et reproductible pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes avec une croissance lente M. xanthus bactéries. Nous montrons que les tampons simple élément nutritif enrichi d’agarose sont suffisantes pour soutenir la croissance pendant au moins 24 heures et permettent d’observer et d’analyser la localisation des protéines et la croissance avec une résolution de cellule unique sur plusieurs générations.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMI6000B with AFC	Leica microsystems	11888945	Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control
Universal mounting frame	Leica microsystems	11532338	Stage holder for different sample sizes
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3	Leica microsystems	11506197	Phase contrast objective
Orca Flash 4.0 camera	Hamamatsu	11532952	4.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition
Filter set TXR ET, k	Leica microsystems	11504170	Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75
Filter set L5 ET, k	Leica microsystems	11504166	Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30
Filter set YFP ET, k	Leica microsystems	11504165	Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Prior	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Microscope automation controller with interactive control center
EL 6000 light source	Leica microsystems	11504115	External fluorescence light source
Incubator BLX Black	Pecon	11532830	Black incubation chamber surrounding the microscope
Tempcontrol 37-2 digital	Leica microsystems	11521719	Automated temperature control for incubation chamber
Gentmycin sulphate	Carl Roth	0233.4	Gentamycin
Oxytetracylin dihydrate	Sigma Aldrich	201-212-8	Oxytetracyclin
Kanamycin sulphate	Carl Roth	T832.3	Kanamycin
Filtropur BT25 0.2 bottle top filter	Sarstedt	831,822,101	Bottle top filter for sterilization of buffers
Deckgläser	VWR	630-1592	Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Agarose for microscopy slides
Leica Metamorph AF	Leica microsystems	11640901	Microscope control software and software for picture analysis
Tetraspeck Microsperes, 0.5 µm	ThermoFisher	T7281	Fluorescent microspheres
petri dish	Greiner Bio-one	688102	120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carl Roth	AE15.2	Tris
Magnesium sulphate heptahydrate	Carl Roth	P027.2	Magnesium sulphate
Potassium dihydrogen phosphate p.a.	Carl Roth	3904.1	Potassium dihydrogen phosphate
1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4			Cultivation medium for M.xanthus
TPM buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4			Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus