Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

Résumé

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Résumé

Un groupe de travail initié au sein de l’Association Français de cytométrie en flux (AFC) a été développé afin d’harmoniser l’application de la cytométrie multiparamétrique (MFC) pour le diagnostic myéloïde en France. Le protocole présenté ici a été convenue et appliquée entre septembre 2013 et 2015 de novembre dans six laboratoires diagnostiques Français (centres hospitaliers universitaires de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice et Lille et Institut Paoli-Calmettes dans Marseille) et a permis la normalisation de la moelle osseuse échantillon préparation et acquisition de données. Trois bases de données de maturation ont été développées pour les neutrophiles, monocytes et lignées érythroïde avec la moelle osseuse d’individus donateurs « sain » (individus sans aucune preuve d’une maladie hématopoïétique). Une solide méthode d’analyse pour chaque lignée myéloïde devrait être applicable pour le diagnostic systématique. De nouveaux cas peuvent être analysés de la même façon et comparés à des bases de données habituelles. Ainsi, des anomalies quantitatives et qualitatives phénotypiques peuvent être identifiés et ceux au-dessus de 2SD comparés aux données des échantillons de moelle osseuse normale devraient considérer comme révélateur de la pathologie. La limitation majeure est la variabilité plus élevée entre les données obtenues en utilisant les anticorps monoclonaux obtenus avec les méthodes basées sur les technologies d’hybridomes et actuellement utilisés dans le diagnostic clinique. Établissant des critères de validation technique des données acquises peut contribuer à améliorer l’utilité de MFC pour les diagnostics MDS. La mise en place de ces critères exige l’analyse contre une base de données. La réduction de la subjectivité du chercheur en analyse de données est un important avantage de cette méthode.

Introduction

En l’absence de marqueurs phénotypiques spécifiques aux changements dysplasiques se produisant dans les cellules myéloïdes pendant l’initiation MDS et la progression, une nouvelle approche a été proposée ces dernières années, basée sur l’évaluation des voies de maturation (expression altérée de les antigènes myéloïdes durant la production de cellules myéloïdes matures) ou de la distribution anormale des différents types de cellules dans la moelle osseuse (BM) cellule compartiments^1,2.

Cet article présente une nouvelle méthode d’application normalisée des MFC afin de détecter les changements dysplasiques dans les compartiments de la cellule myéloïde BM associés à des syndromes myélodysplasiques (SMD) ou d’autres maladies hématologiques myéloïdes. Cette étude montre également l’utilité d’utiliser des bases de données de maturation pour l’analyse de données MFC.

Normalisation de la procédure de préparation d’échantillon, d’acquisition de données et analyse en utilisant les bases de données permettrait l’identification des anomalies phénotypiques plus pertinentes liées aux changements dysplasiques dans les cellules myéloïdes BM. Par conséquent, les sous-ensembles statistiquement sélectionnés selon des formats bien étiquetés et reconnus (séparateur de Population automatique (APS) diagrammes, histogrammes et parcelles de dot) sont requis pour développer une stratégie d’analyse qui peut être utilisée dans une analyse ultérieure arrondit. La découverte d’anomalies phénotypiques robustes MDS faciliterait le diagnostic dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et sans aberrancies cytogénétiques. Identification des paramètres discriminatoires permettant la réduction des panneaux immunophénotypiques peut simplifier l’actuel scores², permettant leur applicabilité dans les laboratoires de pathologie clinique.

Cette méthode limite les interprétations subjectives de cytométrie de flux de données, comme ont été signalé en MDS diagnostic³. Cette étape est un préalable à l’élaboration d’outils automatisés pour le traitement et l’analyse des flux de données⁴.

MDS comprend un groupe hétérogène d’affections clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dont les mutations du splicéosome coopèrent avec des modificateurs spécifiques épigénétiques de céder le phénotype MDS. On sait maintenant que, ainsi que des mutations de HSC, autres mécanismes sont impliqués dans la physiopathologie MDS, telles que l’inflammation d’origine immunitaire aberrante et interactions entre autorenouveler maligne et le micro-environnement stromal de la BM. Toutefois, ces mécanismes restent mal compris. L’hétérogénéité large clinique et biologique de MDS rend le diagnostic et le choix de la pharmacothérapie optimale par un défi. Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont montré que les MFC est souvent plus sensible dans la détection de la dysplasie² que la morphologie, mais les contraintes techniques et économiques rendent cette technique difficile à normaliser, avec des résultats souvent selon le le expérience de l' interprète³. En outre, on ne sait pas comment MFC peut faire pencher la balance vers MDS dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et en l’absence d’anomalies cytogénétiques ou dans des cas limites telles que hypocellular MDS, avec un nombre faible souffle, d’autre non clonale BM des troubles tels que l’insuffisance médullaire (i.e., anémie aplasique). Aussi, il reste difficile de différencier les cas limites de MDS avec un excès de blastes de leucémie myéloïde aiguë (LMA). Pour toutes ces raisons, le Guide de pratique clinique ne s’intègrent pas MFC testing dans le diagnostic final de MDS. En 2011, l’US National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recommandé MFC permettant d’estimer le pourcentage de cellules CD34 +, détection des clones de l’hémoglobinurie paroxystique nocturne et la présence de clones de lymphocytes T cytotoxiques dans hypocellular MDS⁵. Ces deux derniers cas impliquent également un objectif thérapeutique parce que les données cliniques ont montré une bonne réponse de ces patients à un traitement immunosuppresseur⁶. Les lignes directrices NCCN 2017, citant les recommandations du groupe de travail International (GTI), énumérés immunophénotypage aberrant de détection par MFC parmi les critères Co pour MDS diagnostic, mais sans faire aucune fiche⁶. En outre, la classification de l’OMS publiée récemment stipule que les constatations MFC seules ne suffisent pas établir un diagnostic primaire de MDS en l’absence de données morphologiques et/ou cytogénétique concluantes⁷. Toutefois, les MFC peut servir comme un essai supplémentaire montrant le dérèglement des cellules myéloïdes patrons de maturation et de quantifier la « distance de la normale » pour un patient à un moment précis de l’évolution de la maladie.

Cette méthode est applicable aux laboratoires cliniques intéressés par l’évaluation de dysplasie dans les cellules myéloïdes BM à l’aide de MFC immunophénotypage, afin d’affiner le diagnostic en MDS ou d’autres troubles myéloïdes avec anomalies dysplasiques.

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Protocole

Le protocole ci-dessous a été approuvé par le « Comité de Protection des Personnes » (Comité d’éthique indépendant) 1 sud-est de University Hospital de Saint-Etienne, France.

1. paramètres du cytomètre en

Remarque : Les paramètres cytomètre ont été réalisés selon les recommandations découlent de la France, conformément à la EuroFlow procédure « protocole d’exploitation EuroFlow Standard (SOP) pour le réglage de l’Instrument et l’indemnisation (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Réglage de l’instrument mensuel
   1. Allumez le cytomètre. S’assurer que tous les niveaux de fluide sont appropriée et ouverte Diva 6.1.3. Exécutez fluidique démarrage : dans la barre de menu, sélectionnez ' cytomètre | Fluidique Startup'. Cliquez sur « OK » lorsque vous êtes invité. Permettre le cytomètre à réchauffer pendant au moins 30 min.
   2. Vérification de la performance - perles CST
      Remarque : Pour cette étape, préparer 12 tube 75 mm en polystyrène, billes CST et le liquide de gaine (voir Table des matières).
      1. Étiqueter un tube en polystyrène de 12 x 75 mm² 'CST'. Mélanger le flacon perle fournie par inversion douce ou très doux mélangé au vortex. Ajouter dans le tube marqué : 0,35 mL de liquide de gaine et 1 goutte de perles de la CST. Vortex le tube doucement et procéder à l’acquisition. Stocker le tube pendant plus de 8 h à 2-25 ° C dans l’obscurité se n'acquiert pas immédiatement.
      2. Effectuer la vérification de la performance : dans la barre de menu, sélectionnez ' cytomètre | CST'.
      3. Dans l’onglet « Setup » du module CST : confirmer le II Canto comme dans la configuration par défaut du 4-2 H-2V et aussi confirmer qu’une ligne de base créé à l’aide du lot de perles de CST existe pour cette configuration. Si une base de référence n’existe pas, reportez-vous à la CST perles IFU. Confirmer que cette référence n’est pas dépassée : sous « configuration Control », sélectionnez « Vérifier la Performance » dans le menu déroulant.
      4. Cochez « Charger manuellement le tube » et cliquez sur « Exécuter ». Vérifiez le numéro de lot affiché. Doucement vortex les perles dilués préparé ci-dessus et lorsque vous y êtes invité, chargez les perles dilués et cliquez sur « OK ».
      5. Lorsque la vérification de la performance est terminée, vérifiez que les performances cytomètre passé. Cliquez sur « Afficher le rapport ». Ré-exécuter la vérification de la performance, si les résultats n’ont pas réussi. Enregistrez le rapport au format PDF avec la Date du rapport de suivi Performance.
   3. Régler « PMT Fluorescent tensions » avec des perles de l’arc-en-ciel (Table des matières).
      Remarque : Les valeurs cibles sont définies dans le Standard Operating Procedure Euroflow (POS), intitulé « 20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads ». Ce SOP est disponible sur le site Euroflow (www.euroflow.org; dans le domaine public ; Onglet Protocoles).
      1. Créer une nouvelle expérience via ' mensuel Instrument installation Date | Spécimen '.
      2. ', choisissez les paramètres optiques et les fluorochromes correspondant aux tubes concernés (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) et vérifiez que les paramètres d’acquisition souhaitée (Journal, A, H et / ou W). Appliquer les paramètres actuels de CST (clic droit sur « paramètres du cytomètre » de l’expérience). Définissez le seuil pour le paramètre FSC à 10 000.
      3. Sur le cytomètre, éteignez la compensation lors de la définition de fluorescence des tensions PMT pour fixer des IMF cible ; pour cela, allez dans l' « Inspecteur », accédez à l’onglet « Compensation » Disable compensation de décocher « activer la Compensation » option.
      4. Créer une feuille de calcul « cible IFM » avec toutes les parcelles de la dot nécessaire (n = 2 ; FSC versus SSC, FITC et PE), histogrammes (n = 8 ; un histogramme pour chaque détecteur de fluorescence) et statistiques indiquant la référence de valeurs de crête (MFI et CV) pour chaque canal de fluorescence.
      5. Diluer 1 goutte de particules d’étalonnage de perles 8-crête arc-en-ciel dans 1 mL d’eau distillée et agiter avant utilisation. Acquérir sans la solution de perles 8-crête arc-en-ciel à « LOW » débit d’enregistrement. Stocker le tube pendant plus de 8 h à 2-25 ° c dans l’obscurité se n'acquiert pas immédiatement.
      6. Singulet porte perle « Population P1 » dans FCS versus intrigue dot bivariée SSC et le pic 8ème ou 7e dans le FITC versus intrigue dot bivariée PE (le pic plus brillants ou celle qui suit vers le bas, comme il est stipulé dans le document Euroflow intitulé « 20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads ») et nommez cette porte Population P2.
      7. Poursuivre l’acquisition de la suspension de perle 8-pics arc-en-ciel et régler les tensions PMT dans tous les canaux de fluorescence pour atteindre les valeurs cibles IFM selon le document Euroflow « 20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads ».
      8. Une fois que les valeurs cible IFM pour le pic de 8 ou 7 sont atteintes, enregistrer l’IMF cible atteint et les valeurs correspondantes de la PMT finales. Acquisition de 5 000 événements et enregistrer les données.
         NOTE : Que PMT valeurs doit être utilisée ci-dessous à l’étape 1.2.3 (vérifier la Performance - Confirmation des valeurs PMT avec des perles de l’arc-en-ciel).
      9. Enregistrez ces valeurs faisant une impression d’écran avec les paramètres de feuille de calcul « IFM cible » et l’instrument et l’enregistrer comme image .jpg.
         Remarque : Lorsqu’un « Nouveau » tube est créé, les valeurs PMT varient parfois inattendue. Pour ce faire, une double vérification de PMT est essentielle. Comparez chaque fois que les valeurs PMT à vos notes, vérifiez que les valeurs « cible IFM » et PMT sont corrects !
      10. Enregistrer les « Paramètres de l’Application ». Dans le navigateur, cliquez sur « paramètres du cytomètre ». Dans le menu déroulant, sélectionnez « paramètres de l’Application »et enregistrez. Cliquez sur « OK ». Si vous y êtes invité, cliquez sur Oui pour conserver les valeurs de seuil.
          Remarque : Enregistrer les paramètres de l’Application en utilisant le nom par défaut. Ne renommez pas les paramètres.
   4. Ajuster le « FCS » et « Tensions SSC » avec sang lavé lysé (LWB).
      Remarque : Pour cette étape, 50 µL d’un échantillon de sang périphérique (PB) d’une solution saine de bénévole, lyse (Table des matières) et le tampon de lavage sont nécessaires.
      1. Pipettes 50 µL de PB dans un tube. Ajouter 2 mL de solution de lyse fraîchement diluée. Mélanger doucement et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante.
      2. Centrifuger 5 min à 540 x g.
      3. Aspirer le surnageant sans déranger le culot, ce qui laisse environ 50 µL volume résiduel dans le tube. Mélanger doucement et ajouter 2 mL de solution de lavage filtrée.
      4. Centrifuger 5 min à 540 x g.
      5. Répéter une fois de plus les étapes 1.1.4.3–1.1.4.4.
      6. Ajouter 250 µL de tampon de lavage filtrée et mélanger doucement.
      7. Dans l’expérience créée pour l’acquisition de perles arc-en-ciel, créer une nouvelle ' échantillon | Nouvelle feuille de calcul ': dessiner un graphique SSC-A / FSC-a bi-paramétrique.
      8. Acquérir les cellules, porte les lymphocytes dans une FSC versus intrigue dot bivariée SSC et régler les tensions FSC et SSC pour atteindre les valeurs cibles moyennes suivantes pour la population de lymphocytes fermée : FSC : 55 000 (gamme 50 000 – 60 000) et SSC : 13 000 (plage de 11 000 –15,000).
      9. Acquérir et enregistrer les données avec environ 10 000 événements. Vérifiez les valeurs moyennes des cibles FSC et SSC pour les lymphocytes fermées. Réajuster la tension FSC et SSC si nécessaire.
      10. Impr écran et stocker l’empreinte des valeurs cibles canal qui sont obtenus.
   5. Paramètres de compensation de fluorescence.
      Remarque : Les commandes de compensation unique teinté doivent être définis après les paramètres cibles MFI et paramètres FSC/SSC ont été établis. Pour cette étape, un PB de volontaire sain, particules de Compensation (Table des matières), solution de lyse et tampon de lavage sont nécessaires. La liste des réactifs d’anticorps conjugué fluorochrome utilisé pour régler les matrices de compensation de fluorescence et de leurs populations de référence sont répertoriés dans le tableau 1.
      1. Étiqueter un tube par réactif servira à mettre en place la compensation de fluorescence (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 et APC-H7 - CD71) et un tube « blanc/non souillées enregistré ».
      2. Pipetter 50 µL de PB dans chaque tube ou 1 goutte de particules « négatif » de Compensation + 1 goutte de « positif » particules de Compensation dans les tubes de contrôle de rémunération indiqué ci-dessus dans le tableau 1.
      3. Ajouter la quantité appropriée de réactif anticorps dans le tube. Ajouter le tampon de lavage filtrée pour atteindre un volume final de 100 µL par tube et mélanger doucement. Incuber pendant 15 min à ta, abri de la lumière.
      4. Ajouter 2 mL de solution de lyse fraîchement diluée que dans les tubes avec les cellules et mélanger doucement. Incuber pendant 10 min à RT, abri de la lumière.
      5. Centrifuger 5 min à 540 x g.
      6. Aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire laisse environ 50 µL volume résiduel dans chaque tube. Mélanger doucement. Ajouter 2 mL de tampon de lavage filtrée.
      7. Centrifuger 5 min à 540 x g.
      8. Aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire laisse environ 50 µL volume résiduel dans chaque tube. Ajouter le tampon de lavage filtrée pour atteindre un volume final de 250 µL par tube et mélanger doucement.
      9. Créer des contrôles de Compensation.
         1. Dans la barre de menu, sélectionnez expérience créé pour l’acquisition de perles arc-en-ciel. Créer un nouveau ' échantillon | Installation de compensation | Créer des contrôles de Compensation.
         2. Dans la boîte de dialogue, cochez l’option « Include distinctes non-colorées contrôle tube/puits » . Créer des contrôles de compensation (pas spécifique au label) générique pour HV500, APC, FITC, PE, HV450, PerCPCy5.5. Créer des contrôles label spécifique compensation pour PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 et APC-H7 - CD71. Cliquez sur « OK ».
         3. Dans une nouvelle feuille de calcul, créer un graphique de SSC-A / FSC-a bi-paramétrique et tracez une porte sur les lymphocytes (P1) et l’histogramme correspondant au fluorochrome qui est détecté dans chaque tube et dessinez une porte P2 pour la crête positive. Afficher la hiérarchie (clic droit sur un graphique et sélectionnez « Afficher Population hiérarchie ») afin de visualiser le nombre d’événements en P2, à l’exception du tube de contrôle non colorés.
         4. Dans l’Explorateur, développez le spécimen de contrôles de Compensation.
         5. Vortex les cellules colorées ou non, préparé ci-dessus, pour 3 à 5 s. installer les cellules non colorées préparées sur le cytomètre. Régler le débit à 'support ' et cliquez sur « acquérir les données ». Dans l’intrigue de SSC-A point FSC-A vs, ajuster la porte P1 pour couvrir entièrement la population lymphocytaire. Faites un clic droit sur la barrière de P1. Sélectionnez « Appliquer à toutes les commandes de compensation ».
         6. Dans le tableau de bord « Acquisition » , cliquez sur 'données d’enregistrement " d’acquérir 5 000 événements. Pour toutes les cellules de contrôle tachées de simple-couleur, vérifiez que la porte d’intervalle P2 englobe la population positive.
         7. Pour le PE-Cy7 et APCH7 tubes, ajouter une porte d’intervalle de P3 à l’histogramme et faire en sorte qu’elle englobe la population négative, et que la P2 englobe la population positive.
         8. Calculer les compensations. Dans la barre de menu, sélectionnez ' expérience | Installation de compensation | Calculer les compensations '. Nom de la matrice de compensation : « Date de Compensations ». Sélectionnez « Lier et enregistrer ».
         9. Sauver la matrice de compensation dans les paramètres de demande de catalogue : cliquez sur 'cytomètre paramètres | Paramètres d’application | Enregistrer ', nom de la matrice de compensation « Date de Compensation » et cliquez sur « OK ».
         10. Dans le navigateur, cliquez sur « paramètres du cytomètre ». Dans l’inspecteur, accédez à l’onglet « Compensation » cliquez sur Imprimer dans le coin inférieur droit.
             Remarque : Ces informations peuvent également être récupérées depuis le catalogue.
         11. Contrôle de la matrice de compensation.
             1. Mélanger dans un tube tous les le seul tube teinté (APCH7 de choix).
             2. Créer une nouvelle expérience appelée « Date de vérification d’indemnisation », ajoute le nouveau spécimen, cliquez droit sur les « paramètres cytomètre » de cette expérience et choisissez ' lien | Supprimer le lien | Paramètre d’application ' enregistré à l’étape 1.1.3.10. Acquisition de 50 000 événements de ce tube avec les nouveaux paramètres.
             3. Appliquer une feuille de calcul Global. Créez 1 terrain dot FSC-A/SSC-A et dessinez une porte pour visualiser les lymphocytes et n x (n-1) / 2 autres parcelles axé sur la porte de lymphocytes de visualiser deux par deux paramètres.
2. Réglage de l’Instrument tous les jours
   1. Allumez le cytomètre. S’assurer que tous les niveaux de fluide sont appropriée et ouverte Diva 6.1.3. Exécutez fluidique démarrage : dans la barre de menu, sélectionnez ' cytomètre | Fluidique Startup'. Cliquez sur « OK » lorsque vous êtes invité. Permettre le cytomètre à réchauffer pendant au moins 30 min.
   2. Vérification de la performance - CST perles : répéter les étapes 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. Vérification de la performance - Confirmation des valeurs PMT avec des perles de l’arc-en-ciel.
      1. Étiqueter un tube polystyrène comme « Rainbow perles » et vérifiez que le numéro de lot est celui en cours d’utilisation. Mélanger soigneusement le flacon perle d’arc-en-ciel. Préparer les perles de l’arc-en-ciel, verser 1 goutte de perles arc-en-ciel dans 1 mL d’eau distillée ou désionisée. Protéger de la lumière.
         NOTE : Procéder à l’acquisition ou conserver le tube à 2-8 ° c jusqu'à l’acquisition.
      2. Créer une nouvelle expérience : « Rainbow Date de perles ».
      3. Lier les compensations : faites un clic droit sur « cytomètre paramètres », sélectionnez « lien Setup », sélectionnez la matrice une compensation appropriée, créée à l’étape 1.1.5.9.9 et sélectionnez « Remplacer ».
      4. Dissocier la compensation : faites un clic droit sur « paramètres du cytomètre », sélectionnez « Supprimer la liaison de la configuration précédemment liée » et cliquez sur « OK ».
      5. Appliquer les « paramètres de l’Application »: faites un clic droit sur « cytomètre paramètres », sélectionnez « paramètres de l’Application », appliquez le paramètre créé à l’étape 1.1.3.10 lors de la configuration mensuel et sélectionnez 'garder la valeur de compensation'.
      6. Désélectionnez l’option « Activer l’indemnisation ».
      7. Créez un nouveau spécimen dans l’expérience du modèle de feuille de calcul pour les perles de l’arc-en-ciel. Acquérir le tube dans l’acquisition de « Faible » .
      8. Lors de l’acquisition de perles, ajuster la porte P1 pour inclure uniquement la population de billes singulet. Ajuster la porte P2 sur l’intrigue FITC-A / PE-A point d’inclure seulement la population de billes singulet. Enregistre les 10 000 événements.
      9. Vérifiez que l’IFM et les valeurs de CV obtenues pour la population de P2 sont dans les cibles prédéfinies du protocole. Sinon, laver le cytomètre et commencer l’opération. Enregistrer le rapport sous format PDF.

2. préparation de l’échantillon BM

Remarque : Effectuez la cellule protocole juste avant la procédure de marquage de lavage.

1. Pipeter 600 µL de l’échantillon élémentaire dans un tube à centrifuger 15 mL.
2. Ajouter 10 mL de tampon de lavage (PBS + 0,5 % de BSA [> 98 % pur BSA] + 0,09 % NaN₃ filtré solution, pH 7,4). Mélanger la suspension cellulaire bien à l’aide d’une pipette.
3. Centrifuger pendant 5 min à 540 x g (lavage 1). Éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot cellulaire.
4. Répétez les étapes 2.2 – 2,3 (laver 2).
5. Suspendre le culot cellulaire 400 µL de tampon de lavage.
6. La coloration des marqueurs de la colonne vertébrale. Transférer la totalité du volume de l’anticorps de l’épine dorsale d’un tube en polypropylène pour l’analyse des FACS, identifié avec les données du patient et de le « épine dorsale ». Ajouter 350 µL de l’échantillon lavé (le volume de l’échantillon lavé requis pour combler tous les tubes sur le panneau). Mélangez bien à l’aide d’une pipette.
   Remarque : Calculer le volume total des anticorps de la colonne vertébrale pour membrane de surface coloration (comme indiqué dans le tableau 2).
7. Pipeter une quantité égale du mélange échantillon-épine dorsale dans 3 tubes en polypropylène pour l’analyse des FACS, identifiés avec les données du patient et « tube numéro 1 » à « tube numéro 3". Si nécessaire, utiliser le tampon de lavage pour atteindre un volume final de 200 µL par tube.
   ATTENTION : Veillez à ne laisser aucune trace de l’échantillon sur les parois des tubes ; dans le cas contraire, ces cellules ne vont pas être colorées. Si nécessaire, vortex les cellules et centrifuger le tube.
8. Dans chaque tube, ajouter le volume approprié d’anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire (sauf pour les marqueurs de la colonne vertébrale), comme indiqué dans le tableau 2. Mélangez bien à l’aide d’une pipette. Incuber 30 min à ta abri de la lumière.
9. Ajouter 2 mL de solution de lyse. Mélangez bien à l’aide d’une pipette. Incuber pendant 10 min à l’abri de la lumière de RT.
10. Centrifuger 5 min à 540 x g. Éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot, ce qui laisse environ 50 µL volume résiduel dans chaque tube. Mélangez bien à l’aide d’une pipette.
11. Ajouter 2 mL de tampon pour le culot de lavage. Mélangez bien à l’aide d’une pipette.
12. Répétez les étapes 2.10 – 2.11 (laver 2).
13. Centrifuger 5 min à 540 x g. Éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot et Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS. Mélangez bien à l’aide d’une pipette.
14. Acquérir les cellules, de préférence, immédiatement après la coloration ou conserver à 4 ° C, abri de la lumière, pendant pas plus de 1 h jusqu'à ce que mesurée dans le cytomètre en flux.

3. Acquisition de données

1. Ouvrir une nouvelle expérience dans les logiciels de Diva et renommez-le selon le nom, le type d’échantillon et la date.
2. Créer un nouveau spécimen contenant 3 tubes. Préciser dans la présentation de l’expérience les anticorps utilisés dans chaque tube.
3. Cliquez droit sur les « paramètres cytomètre », choisissez « paramètres de l’Application » et appliquer les valeurs obtenues dans les paramètres mensuels (pas 1.1.3.10).
4. Ouvrez une nouvelle feuille de calcul Global et créer les parcelles dot : SSC-A / FSC-a, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. Dans l’intrigue de dot SSC-A/FSC-A, créer un portail pour sélectionner des cellules singulet. Dans l’intrigue de dot SSC-A/CD45-BV500-A, créer des portails pour sélectionner 4 populations : granulocytes, les monocytes, les explosions et les lymphocytes. Le projet de ces populations dans les parcelles de dot créés précédemment.
5. Créez une nouvelle feuille de calcul Global pour la commande de compensation comme décrit à l’étape 1.1.5.9.11.3.
6. Acquérir le tube « MEDIUM » acquisition et enregistrement 500 000 événements/tube. Après validation technique (évaluation de l’indemnisation et la coloration appropriée), exporter les données sous forme de fichiers FCS3.0.

4. analyse des données

Remarque : Pour construire les bases de données normales BM sont des fichiers utilisés des donneurs sains et des individus sans aucun élément de preuve pour une maladie hématopoïétique comme suit 11 de 18 fichiers pour la Neutrophils_NM des bases de données, 10 de 18 fichiers de base de données Monocytes_NM et de 14 à 18 fichiers de base de données NRC_NM. Les dossiers détruits ont montré divers problèmes techniques, tels que présentés dans la section résultats représentant. Les fichiers ont été analysés individuellement en utilisant le logiciel Infinicyt (Table des matières), conforme aux diverses stratégies représentés dans la Figure 1 a(1-3) pour la lignée neutrophile (profil Neutrophils_Maturation.inp), Figure 2 A pour la lignée monocyte (profil Monocytes_Maturation.inp) et Figure 3A(1-2) pour la lignée de cellules érythroïdes (profil NRC_Maturation.inp).

1. Stratégie d’analyse pour les neutrophiles -Construction de base de données Neutrophils_NM 
   1. Identifier le CD34 + explosions neutrophile-commis à l’aide d’une intersection de sept portes, ce qui permet la sélection de CD34 + CD117 + HLADR + faibles CD10 - CD13 + CD11b-events (1 FigureA.1). Affecter ces événements à l’onglet « Neutrophiles » dans l’arborescence hiérarchique de Population et par la suite décochez cet onglet afin d’éliminer ces cellules (représentés en bleu) de l’affichage des événements restants (gris).
   2. Isoler le CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + faibles précurseurs neutrophiles à l’aide d’une intersection de six portes tel que représenté dans la Figure 1a (2) et attribuez-les à l’onglet « Neutrophiles » .
   3. Identifier les neutrophiles plus matures à l’aide d’une intersection de quatre portes, permettant la discrimination des CD45dim SSCint-Salut CD117-HLADR-cellules et leur affectation à l’onglet « Neutrophiles » .
   4. Décochez les autres événements, gardant seulement les neutrophiles visible, puis exporter cette population en cliquant "fichier | Export' et vérifier que tous les paramètres requis sont vérifiées et enregistrer les données sous forme de fichiers FCS.
   5. Dans un fichier fusionné comprenant tous les fichiers exportés de FCS, effectuera un contrôle de qualité en évaluant l’intensité de l’expression des marqueurs pour chaque sous-population. Avec APS emplacements avec médianes de chaque fichier et courbes de SD pour chaque sous-population montré, retirer les cas en dehors du 2SD courbes (voir détails dans la section résultats représentant) (Figure 1B).
   6. Dans le fichier composé avec « Neutrophiles » visibles, la voie de Maturation s’inspirent d’un diagramme d’APS (Figure 1C gauche) et enregistrez-les dans un fichier .cyt.
      Remarque : Une comparaison de schéma de la Maturation permet la visualisation de tous les paramètres de tous les fichiers inclus dans la base de données Neutrophils_NM représenté sur la base de données normalisée. Le schéma présenté dans la Figure 2C, droite, montre que tous les fichiers inclus dans la base de données Neutrophils_NM (n = 11) rentre dans 2 SD par rapport à la médiane du groupe.
2. Stratégie de l’analyse des monocytes - construction de base de données Monocytes_NM
   1. Identifier les cellules de la lignée monocytaire (CD117 +/-CD64 + Salut HLADR + Salut) à l’aide d’une intersection de quatre portes (Figure 2A). Affecter ces événements à l’onglet « Monocytes » dans l’arborescence hiérarchique de Population.
   2. Décochez les autres événements, gardant seulement les cellules monocytaire visible, puis exporter cette population en cliquant "fichier | Export' et vérifier que tous les paramètres requis sont vérifiées et enregistrer les données sous forme de fichiers FCS.
   3. Dans un fichier fusionné comprenant tous les fichiers exportés de FCS, effectuera un contrôle de qualité en évaluant l’intensité de l’expression des marqueurs pour chaque sous-population, puis retirer les cas en dehors des courbes de 2SD (détails dans la section résultats représentant) (Figure 2 ( B).
   4. Dans le fichier obtenu avec « Monocytes » cellules visibles, tracer la voie de Maturation sur le diagramme d’APS (Figure 2C gauche) et enregistrer ce qu’un fichier .cyt.
      Remarque : Une comparaison de schéma de la Maturation permet la visualisation de tous les paramètres de tous les fichiers inclus dans la base de données Monocytes_NM représenté sur la base de données normalisée. Le schéma présenté dans la Figure 2C, droite, montre que tous les fichiers inclus dans la base de données Monocytes_NM (n = 10) rentre dans 2 SD par rapport à la médiane du groupe.
3. Stratégie de l’analyse des hématies nucléées (NRCs) - construction de base de données NRC_NM
   1. Identifier le CD34 + les explosions d’érythroïdes commis à l’aide d’une intersection de sept portes qui permettent la sélection de CD34 + CD117 + HLADR + faible CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + events (Figure 3a (1)). Attribuer ces événements dans l’onglet « NRC » dans l’arborescence hiérarchique de Population et puis décochez cet onglet afin d’éliminer ces cellules (représentés en rouge) de l’affichage des événements restants (gris).
   2. Identifier le NRCs plus matures, à l’aide d’une intersection de quatre portes permettant la discrimination des CD45-/ + dim SSClow CD36 + Salut CD71 + Salut CD105 +/-cellules. Affecter ces événements à l’onglet « NRC » (Figure 3a, paragraphe 2). Les plaquettes (CD36 + Salut SSClow cellules) doit être retiré de la population de la NRC (Figure 3a, paragraphe 2).
   3. Décochez les autres événements, gardant seulement les cellules de la NRC visible, puis exporter cette population en cliquant "fichier | Export' et vérifier que tous les paramètres requis sont vérifiées et enregistrer les données sous forme de fichiers FCS.
   4. Dans un fichier fusionné comprenant tous les fichiers exportés de FCS, effectuera un contrôle de qualité en évaluant l’intensité de l’expression des marqueurs pour chaque sous-population, suivie par la suppression des cas en dehors de la 2SD courbes (voir détails dans la section résultats représentant) ( Figure 3 ( B).
   5. Dans le fichier obtenu avec les cellules « NRC » visibles, tracer la voie de Maturation sur le diagramme d’APS (Figure 3C, à gauche) et enregistrer ce qu’un fichier .cyt.
      Remarque : Une comparaison de schéma de la Maturation permet la visualisation de tous les paramètres de tous les fichiers inclus dans la base de données NRC_NM représenté sur la base de données normalisée. Le schéma présenté dans la Figure 3C, droite, montre que tous les fichiers inclus dans la base de données NRC_NM (n = 14) rentre dans 2 SD par rapport à la médiane du groupe.
4. Evaluation de la maturation dans des compartiments myéloïdes BM en utilisant les bases de données de Maturation
   1. Ouvrez le fichier .cyt correspondant à la lignée d’intérêt (i.e., Neutrophils_NM_GMFF.cyt pour la lignée neutrophile, Monocytes_NM_GMFF.cyt pour la lignée monocytaire et NRCs_NM_GMFF.cyt pour la lignée érythroïde).
   2. Faites un clic droit sur l’onglet « Maturation » sous l’onglet correspondant à la lignée d’intérêt (' neutrophiles | Monocytaire | NRC') et enregistrez la base de la Maturation de la Maturation.
   3. Ouvrez un nouveau fichier de FCS et effectuer une analyse comme expliqué précédemment (étape 4.1.1–4.1.3 de neutrophiles, étape 4.2.1 pour les cellules monocytes, et l’étape de 4.3.1–4.3.2 pour le CNRC).
   4. Tracer la voie de maturation pour la population d’intérêt.
   5. Ouvrez la base de données correspondante dans l’onglet « Outils » (analyse de la base de données) et comparer la population à analyser avec la base de données correspondante de la Maturation. Vérifier les données pour la compatibilité avec la base de données disponible : compléter la compatibilité (triangle vert) ; compatibilité partielle, la plupart écarts de cas au nom des paramètres (triangle jaune) ; et l’incompatibilité (triangle rouge).
   6. Si les données sont compatibles et compatibles partielles, le logiciel crée le schéma « différences de Maturation normalisé » . Pour visualiser les « paramètre bande Maturation différences », ouvrir un nouveau diagramme dans « Schéma » onglet, cliquez sur « Maturation » et choisissez combien de paramètres soient affichées, cliquez sur « OK » et le diagramme apparaissent. Avec un clic droit sur le schéma ; peuvent être modifiés dans la visualisation de données, visualisation de base de données et la visualisation de diagramme de Maturation.
   7. Afin de visualiser l’importance des différences entre le nouveau fichier et les données incluses dans la base de données, configurer un zoom (faites un clic droit sur « différences de Maturation normalisé » et s’applique « Zoomer »).

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Résultats

Les 54 échantillons BM récoltés en anticoagulant K-EDTA ont été inclus dans l’étude. Le MFC ont été analysées en l’absence de toute information sur les patients. Étude rétrospective a montré que les échantillons de BM étaient de 7 donneurs sains (5 mâles et 2 femelles avec un âge médian de 47,4 [35-48], 11 personnes sans aucun signe d’une maladie hématopoïétique (8 mâles et 3 femelles avec un âge médian de 57,9 [35-72]) et 36 cas avec divers certaines patholo...

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Discussion

La qualité de l’aspiration de la BM pourrait avoir une incidence sur le résultat final. L’hémodilution de l’aspiration de la BM pourrait fausser la distribution des cellules dans les différents stades de maturation en raison de l’absence de cellules souches ou cellules précurseurs. Probablement employant un vrac lyse méthode peut-être contribuer à la normalisation de la ponction de la BM pour l’hémodilution dans les analyses de cytométrie en flux. En outre, les étapes essentielles pour l’évaluatio...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain