In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé

Résumé

In vivo la microdialyse a permis la collecte des molécules présentes dans le liquide interstitiel de cerveau (ISF) des animaux éveillés, agir librement. Afin d’analyser les molécules relativement importantes dans l’ISF, l’article actuel se concentre spécifiquement sur le protocole de la microdialyse utilisant des sondes à haut poids moléculaire, couper des membranes.

Résumé

In vivo la microdialyse est une technique puissante pour recueillir l’ISF des animaux éveillés, agir librement basés sur un principe de la dialyse. Microdialyse est une méthode établie qui mesure relativement petites molécules, y compris les acides aminés ou neurotransmetteurs, il a été récemment utilisé pour évaluer aussi dynamique de molécules plus grosses dans l’ISF à l’aide de sondes à haut poids moléculaire coupé membranes. Lors de l’utilisation de ces sondes, microdialyse doit être exécuté en mode push pull pour éviter la pression accumulée à l’intérieur les sondes. Cet article fournit des protocoles étape par étape, y compris la chirurgie stéréotaxique et comment configurer les lignes microdialyse pour collecter les protéines de l’ISF. Au cours de la microdialyse, médicaments peuvent être administrés soit systématiquement, soit par injection directe dans ISF. Microdialyse inverse est une technique d’infuser directement composés en ISF. Inclusion des médicaments dans le tampon de perfusion microdialyse leur permet de diffuser dans l’ISF à travers les sondes alors qu’elles ramassaient simultanément ISF. En mesurant la protéine tau à titre d’exemple, l’auteur montre comment ses niveaux sont altérées lors de stimulation de l’activité neuronale par microdialyse inverse de la picrotoxine. Avantages et limites de la microdialyse sont décrits ainsi que l’application étendue en associant d’autres méthodes in vivo .

Introduction

ISF est composé de 15 à 20 % du volume total cérébral et offre un micro-environnement critique pour la transduction du signal, transport du substrat et dégagement des déchets¹. Donc, la capacité de collecte ISF auprès des animaux vivants offrira une plus grande implications pour les différents processus biologiques ainsi que le mécanisme de la maladie. In vivo la microdialyse est l’une des rares méthodes cet échantillon et quantifier les molécules extracellulaires d’ISF d’éveillé, se déplaçant librement les animaux et ce qui constitue un outil utile en neurosciences recherche champ^2,3. Dans cette méthode, microdialyse sondes avec les membranes semi-perméables sont insérés dans le cerveau et perfusés avec du tampon de perfusion au débit relativement lente (0,1 à 5 µL/min). Au cours de cette perfusion, molécules extracellulaires dans ISF passivement diffusent dans la sonde selon le gradient de concentration et de recueillent un dialysat. Bien que cet article se concentre sur la méthode d’échantillonnage ISF dans le cerveau, tant le principe que la méthode peuvent être appliquées à d’autres organes par des modifications appropriées si nécessaire.

Microdialyse fut d’abord employé dans les années 1960 et depuis, puis il a été largement utilisé pour recueillir les petites molécules, y compris les acides aminés ou des neurotransmetteurs dans le cerveau. Cependant, la récente disponibilité commerciale de microdialyse sondes à poids moléculaire élevé, coupée de membranes (100 kDa-3 MDa) a élargi son application aux protéines relativement plus importantes dans l’ISF ainsi que^{4,5,6 ,7}. Les études à l’aide de ces sondes a conduit à la conclusion que les protéines telles que tau ou α-synucléine qui ont été longtemps considérés comme exclusive cytoplasmique sont physiologiquement présents dans ISF^4,5,8.

Une des difficultés à l’aide de sondes microdialyse avec grande coupure de membranes (en général plus 1 000 kDa) est qu’ils sont plus sensibles aux pertes de fluides ultrafiltration en raison de la pression intérieure accumulée dans les sondes. Microdialyse sondes utilisées ici ont une structure unique pour éviter ce problème. La pression ne sera pas construite vers le haut en raison de cette structure, ainsi la microdialyse avec ces sondes peuvent être exploitées dans un mode « Push-Pull » à l’aide d’un pousse-seringue à perfuse les sondes (= push) et une pompe péristaltique/rouleau pour recueillir le dialysat venant de la prise de la sonde (= tirer) ⁹ (même si elle a besoin de pompes de pousser et de tirer, en raison de la pression annulant les orifices de ventilation dans les sondes, le système est techniquement seulement piloté par la pompe d’extraction). Cet article commence par la chirurgie stéréotaxique d’une implantation de canule guide et décrit comment configurer la microdialyse lignes afin de recueillir l’ISF par microdialyse sondes avec des membranes de coupure 1 000 kDa.

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Protocole

Toutes les études animales ont été examinées et approuvées par le Comité de l’utilisation de la Graduate School of Medicine de l’Université de Tokyo et d’institutionnels animalier.

1. pré chirurgicale

1. Avant de commencer la chirurgie, essuyez tout avec l’éthanol à 70 % pour maintenir des conditions stériles. Support thermique à l’aide d’un coussin chauffant est recommandé.
2. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de l’hydrate de chloral (400 mg/kg). Confirmer anesthetization en effectuant une pincée d’orteil. Utilisation du meloxicam SR à induction et de la buprénorphine lors de la restauration offre pendant au moins 24 heures est recommandée.
3. Se raser les cheveux avec une tondeuse chirurgicale. Fixer une souris chez la souris et l’adaptateur de rat nouveau-né à l’aide de barres d’oreilles et une pince nez.
   Remarque : Il est essentiel de s’assurer que la tête de souris est fixée à ce stade et ne bouge pas-by-side.
4. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.

2. stéréotaxique chirurgie d’Implantation de canule Guide

1. Mettre la souris et l’adaptateur de rat nouveau-né sur l’appareil stéréotaxique. Faire une incision de sagittally sur la peau sur le crâne à l’aide d’un scalpel.　Essuyez les sang et les tissus conjonctifs sur le crâne à l’aide d’un coton-tige humide.
2. Déterminer les coordonnées pour la région du cerveau d’intérêt à l’aide d’atlas du cerveau. Avant de commencer les mesures, assurez-vous que la ligne médiane est droite afin que la mèche peut être déplacé A-P et rester sur la suture médiane tout le temps.
   Remarque : Cet article utilise la coordonnée (A / p :-3,10 mm, taille M/L:-2,50 mm, D/v :-1,20 mm, 12 degrés) pour cibler l’hippocampe postérieure.
3. Crâne de niveau A-P
   1. Attacher une perceuse sur un manipulateur du cadre stéréotaxique. Abaissez le foret jusqu'à ce qu’il touche doucement lambda et enregistrer ses coordonnées ventrale. Répétez cette procédure pour bregma.
      Remarque : Lorsque le crâne est rasée, la mesure verticale de bregma est égale à celle de lambda. Sinon, ajuster la hauteur de la pince nez en conséquence. Après que le crâne obtient nivelé, enregistrer la coordonnée antérieur/postérieur, latérale du bregma.
4. Niveau skull gauche-droite
   1. Déplacer la perceuse de bregma à la coordonnée (A / p :-3,10 mm, taille M/L: +2,0 mm), d’abaisser la perceuse sur le crâne et enregistrer la coordonnée verticale. Puis répétez cette procédure pour la coordonnée (A / p :-3,10 mm, taille M/L:-2,00 mm).
      Remarque : Si le crâne est nivelé, ces cotes verticales de deux points équidistants de la ligne médiane sont égaux. Si ce n’est pas le cas, ajustez la hauteur des barres oreille.
5. Percer un trou de trépan soigneusement à la coordonnée de la cible (A / p :-3,10 mm, taille M/L:-2,50 mm) pour implanter une canule guide. Si le diamètre d’un trou de trépan n’est pas assez grand pour une implantation de canule guide, percer un autre trou qui chevauche avec le premier. Percer un autre trou dans l’os pariétal droit (côté controlatéral) et insérer une vis osseuse, ce qui contribue à garantir un ciment dentaire 1.10 (voir Figure 1 b).
6. Couper une pièce circulaire de verrouillage de l’arrière du couvercle d’un tube à centrifuger 1,5 mL par une lame de rasoir et faire une '' Couronne ''. Cette couronne est utilisée pour empêcher la propagation à la peau de ciment dentaire. Placez-le sur le crâne afin que les trous de burr effectuées à l’étape 2.5 restent au sein du cercle (voir Figure 1).
7. Mettre en place une Assemblée stéréotaxique en mettant une canule guide sur le bras court d’un adaptateur stéréotaxique et fixez-le à l’aide d’un écrou borgne. Mettre le bras le plus long de l’adaptateur stéréotaxique sur la bride de l’électrode. Fixez-le sur le manipulateur de l’appareil stéréotaxique (voir Figure 1 a).
8. Tournez l’ensemble de stereotax D-V sur le bras manipulateur de 12 degrés (voir Figure 1 b). Déplacer la canule guide vers le trou de trépan en 1.6. Insérer la canule guide lentement dans le cerveau en l’abaissant de 1,2 mm.
   Remarque : L’angle de la sonde est spécifique à l’hippocampe ; autres régions peuvent exiger aucun angle ou autres angles du tout. Consulter un atlas du cerveau pour les coordonnées précises. Sécher la surface du crâne, car si pas le ciment ne collera pas et bouchon de ciment peut se déplacer
9. Ajouter le ciment dentaire au sein de la Couronne pour couvrir entièrement les deux la partie métallique de la canule guide et la vis suffisamment pour les immobiliser. Appliquer le ciment dentaire supplémentaire s’il y a une partie de crâne exposé.
10. Attendez que le ciment dentaire est complètement sec (~ 12-20 min). Retirez l’adaptateur stéréotaxique de la pince de l’électrode. Enlever l’écrou borgne, remplacer l’adaptateur stéréotaxique avec une sonde fictive et serrer l’écrou borgne.
11. Relâchez le bouton de la souris de l’appareil stéréotaxique et abritent la souris seule dans une cage individuelle.
    Remarque : La souris ne doit pas être laissée sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Vérifier la souris tous les jours jusqu’au jour de la microdialyse. La souris reçoit des AINS tels que carprofène s’il lui semble être dans la douleur. Attendu 2 semaines est nécessaire pour les études de veille-sommeil, donc la souris habituates au nouvel environnement¹⁰, mais d’autres types d’études peuvent exiger des périodes de récupération plus courtes (par exemple, 1-2 jours).

3. microdialyse Setup

1. Contrôle de la qualité des sondes : Remplissez une seringue jetable 1ml avec glacées distillée Connectez-le à la sortie (port plus court) d’une sonde à l’aide d’un tube de byton. Recouvrir les orifices avec les doigts et enfoncer le piston de la seringue doucement pour infuser l’eau à la sonde. Vérifiez que l’eau ressort de l’entrée de la sonde, et il n’y a pas de fuite sur la surface d’une membrane microdialyse.
   1. Activation des sondes : immerger les membranes d’une sonde dans l’éthanol (70-100 %) pendant deux secondes. Puis, infuser l’eau distillée dans la sonde à nouveau avec une seringue à nouveau.
2. Préparation du tampon de perfusion : afin d’éviter l’adhérence des molécules cibles pour les tubes, ajouter BSA de diluer la solution de BSA de 30 % à 4 % avec le CSF artificiel (1,3 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 3 mM KCl, 0. 4 mM KH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃ , 122 mM NaCl, pH = 7,35), qui correspond étroitement à concentration d’électrolytes dans le LCR, immédiatement avant leur utilisation. Le tampon de perfusion par une unité de filtre de seringue avec 0,1 µm taille des pores du filtre.
   NOTE : 4 % de BSA améliore la récupération pour le collage des protéines mais peut limiter considérablement la livraison des composés, en particulier pour les composés qui ont élevé BSA-liaison. Il s’agit d’un avantage d’utiliser la plus faible concentration de BSA (tels que 0,15 %) dans certains cas³. Notez que les BSA peut agréger très facilement lorsque agitées par plaque de vortex ou de remuer. Ces agrégats peuvent obstruer les sondes ou les pores de la membrane. Soyez prudent lors de la préparation d’une solution de BSA pour limiter cette agrégation
3. Préparer deux lignes séparées pour l’entrée et la sortie (voir Figure 1) et relier les deux lignes avec une aiguille de connexion. Remplissez une seringue jetable 3 mL remplie avec le tampon de perfusion et connectez-le à la fin de l’entrée du tube à l’aide d’une aiguille émoussé-fin. Remplir le tube entier avec le tampon de perfusion en exécutant le pousse-seringue.
4. Arrêter la pompe de seringue et remplacer l’aiguille de connexion entre entrée et sortie ligne avec une sonde de microdialyse activés à l’étape 3.3 (voir Figure 1). Avant ce remplacement, mettre l’écrou sur la sonde.
5. Monter le tube dans le tube de sortie de la pompe à rouleaux. Démarrer la pompe seringue à 10 µL/min, puis la pompe à rouleaux au débit un peu plus lent (9,5 à 9,8 µL/min). Assurez-vous d’enlever toutes les bulles d’air dans le tube entier, qui peut-être influencer la récupération lorsqu’ils entrent dans la sonde.
6. Anesthésier la souris de l’étape 1.12 de la même manière qu’à l’étape 1.2. Mettre le collier de souris autour de son cou. Enlever l’écrou et la sonde factice, lentement insérer une sonde de microdialyse de 3,4 à travers la canule guide et serrer l’écrou borgne.
7. Place la souris dans la cage relié à un système de mouvement libre et une attache la souris avec le collier. Continuer à courir les pousse-seringue et pompe à rouleaux au débit indiqué dans l’étape 3.5 pendant au moins 1 h.
   Remarque : Pour obtenir la collection ISF des animaux éveillés, cet article utilise un système de mouvement libre, où la cage elle-même répond au mouvement de l’animal pour empêcher la torsion des tubes. Alternativement, émerillons liquides disponible provenant de diverses entreprises peuvent être également utilisés.
8. Arrêter le rouleau pompe tout d’abord, puis le pousse-seringue. Régler le débit souhaité. Exécutez la seringue pompe 20 % plus rapide que la pompe à rouleaux.
   NOTE : par exemple, si vous exécutez à 1 µL/min, fonctionnent le pousse-seringue à 1.2 µL/min. débit optimale doit être déterminée empiriquement pour chaque molécule.
9. Le prélèvement d’échantillons de l’ISF : Placez l’extrémité libre du tube de sortie sur le collecteur de fraction réfrigérés.
   NOTE : Volume de l’échantillon approprié varie en fonction des essais utilisés pour l’analyse.
10. À l’issue de l’expérience, retirer la sonde. (Anesthésier la souris selon les besoins.)  Gérer la souris récupération la même manière qu’à l’étape 2.11. Analyser l’ISF collecté par des méthodes comme la CLHP ou ELISA.
11. Pour laver le tube entier après la microdialyse, brancher l’entrée et tubes de sortie à nouveau en remplaçant la sonde avec la connexion d’aiguille et courir l’eau de Javel diluée dans le tube entier et puis de le rincer à l’eau. Sécher et stocker pour une utilisation répétée.
    Remarque : Autres types de tubes sont acceptables, cependant, BSA dans le tampon de perfusion peut boucher les tubes de petit diamètre, donc ces tubes sont considérés comme jetables. Les tubes peuvent être portés vers le bas ou bouché après plusieurs utilisations, alors assurez-vous que le débit est conforme à chaque fois avant de l’utiliser.

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Résultats

Pour stimuler ou inhiber l’activité neuronale dans la microdialyse inverse^11,12,13, picrotoxine, antagoniste des récepteurs GABA_A ou la tétrodotoxine, bloqueur des canaux Na⁺ ont été utilisés. Il a été démontré que tau libération est stimulée par l’augmentation de l’activité neuronale^13,14. Compati...

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Discussion

Microdialyse à haut poids moléculaire, couper des membranes doit être exploité par un mode push pull, donc il est essentiel que le débit soit fidèle et constante. L’inexactitude dans les débits peut être la cause de la génération de bulles d’air et l’incohérence de la concentration de l’échantillon. Si le flux est incohérent, vérifiez toutes les connexions des fuites. Si le problème persiste, il peut être nécessaire de re-commencer avec tubes et nouvelles sondes.

Micro...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Univentor 820 Microsampler	Univentor	8303002	Refrigerated fraction collector
Syringe pump	KD scientific	KDS-101
Roller pump	Eicom microdialysis	ERP-10
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1409	Free-moving system
Dual species cage kit	BASi	CX-1600
AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm)	Eicom microdialysis	PEP-8-02	Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical.
Microdialysis guide (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PEG-8
Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PED-8
Bone screw	BASi	MD-1310
Super bond C&B set	Sunmedical		Dental cement
Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console	Kopf	Model 940	Stereotaxic apparatus
Mouse and neonatal rat adaptor	Stoelting	51625
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting	51648
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A7284-50ML	30% BSA solution
FEP tubing (70 cm)	Eicom microdialysis	JF-10-70	Internal volume = 0.5 µL/cm
Teflon tubing (50 cm)	Eicom microdialysis	JT-10-50	Internal volume = 0.08 µL/cm
Byton tube	Eicom microdialysis	JB-30
Intramedic luer stab adaptor 23G	BD	427565	Blunt end needle
Roller tube	Eicom microdialysis	RT-5S	Internal volume = 4 µL
Cap nut	Eicom microdialysis	AC-5
0.25 mL microcentrifuge tube with cap	QSP	503-Q	Tubes for fraction collector
Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PESG-8
Connection needle	Eicom microdialysis	RTJ
Mouse animal collar	BASi	MD-1365
High Speed Rotary Micromotor kit	FOREDOM	K.1070	Drill
Picrotoxin	Sigma	P1675
Screw driver for bone screws
Scalpel
Cotton swab
Surgical clipper