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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.

Résumé

Glioblastome multiforme (GBM), le cancers du cerveau primaire plus fréquentes et les plus agressifs chez les adultes, est généralement associé à un mauvais pronostic, et rares thérapies efficaces ont été proposés au cours de la dernière décennie. Parmi les candidats prometteurs pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques, des immunothérapies cellulaires ont été ciblés pour éliminer très envahissante et chimio-radiorésistant des cellules tumorales, probables impliqué dans une rechute rapide et fatale de ce cancer. Ainsi, administrations de GBM-réactive allogéniques effecteurs de cellule immunitaire, telles que les lymphocytes T Vϒ9Vδ2 humains, dans le voisinage de la tumeur serait représente une occasion unique d’offrir efficace et hautement concentré des agents thérapeutiques directement dans la site des tumeurs malignes de cerveau. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept préclinique pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale de ces immunothérapies cellulaires qui s’appuient sur des injections stéréotaxiques de lymphocytes humains allogéniques dans lits tumeur intrabrain.

Introduction

GBM (qui grade astrocytome IV), est le cancer de cerveau primitif plus fréquentes et les plus agressifs chez les adultes. En dépit de traitements agressifs qui associent chirurgie et la radio-chimiothérapie, GBM reste associé à un très mauvais pronostic (survie médiane de 14,6 mois et un an-2-mortalité > 73 %)1. Cela prouve que quelques avancées thérapeutiques efficaces ont été validées au cours de la dernière décennie2. Parmi les candidats pour la conception du plus efficace des stratégies thérapeutiques3,4,5, immunothérapies6 sont actuellement explorées afin de suivre et d’éliminer très tumeur invasive et radio/chimio-résistant cellules, soupçonnés pour leur contribution essentielle à rapide et fatale de tumeur rechute7. Diverses cibles immunologiques potentielles ont été immunothérapies identifiés et proposés pour, comportant naturels ou modifié αβ lymphocytes T ϒδ tels que les antigènes de tumeur GBM spécifiques ou le stress induit par les molécules8,9, 10. La possibilité d’administrer des effecteurs de cellules immunitaires GBM-réactive sélectionnées représente une occasion unique d’offrir des quantités élevées de lymphocytes effecteurs directement dans le site de la tumeur maligne résiduelle. Pour soutenir cette stratégie, nous avons récemment démontré que les modèles basés sur des souris immunodéficientes transportant orthotopique primaires xénogreffes humaines de GBM fidèlement récapitulent le développement de tumeurs cérébrales dans GBM patients9,11. En outre, ces modèles ont servi à démontrer l’efficacité antitumorale forte de Moutschen transférés lymphocytes allogéniques des Vϒ9Vδ2T humains.

Ce protocole décrit les étapes expérimentales critiques pour la réalisation des immunothérapies stéréotaxiques des tumeurs cérébrales, telles que GBM, basée sur le transfert adoptif des lymphocytes de T allogéniques. L’article indique : (i) l’amplification des lymphocytes effecteur immunitaire allogénique thérapeutiques T, telles que les lymphocytes humains de Vϒ9Vδ2T ; (ii) la préparation de ces lymphocytes effecteurs T pour injection ; (iii) la procédure d’administration stéréotaxique dans le cerveau, près de la tumeur. Cet article donne également une idée sur le comportement de ces effecteurs cellulaires après injection stéréotaxique.

L’approche thérapeutique présentée ici est basée sur l’injection de 20 x 106 cellules effectrices par dose pour chaque souris immunodéficientes avec tumeur de cerveau. Une étape d’expansion initiale in vitro est nécessaire pour produire de grandes quantités de cellules immunitaires. Par conséquent, les expansions de cellules non spécifiques sont effectuées à l’aide de la phytohémagglutinine (PHA-L) et irradié des cellules nourricières allogéniques : cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) provenant de donneurs sains et cellule B-lymphoblastoïdes transformées par Epstein Barr Virus EBV lignes (BLCLs), dérivés de PBMC par in vitro l’infection par EBV contenant la culture surnageante de la lignée cellulaire Ouistiti B95-8, en présence de 1 µg/mL de cyclosporine-A.

Les cellules immunes effectrices GBM-réactive sont comparées et choisies dans in vitro tests9. Ces cellules effectrices sont activés et amplifié à l’aide de protocoles standard, selon leur nature (par exemple, de lymphocytes humains Vγ9Vδ2 T9 ou virus anti-herpès humain αβ T lymphocytes12) d’une pureté minimale de > 80 %, comme d’habitude vérifiée par l’analyse par cytométrie en flux. La procédure d’extension cellulaire détaillée ci-dessous s’applique à divers sous-ensembles de lymphocytes humains.

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Protocole

Les sujets impliquant animaux suivants de procédure s’est déroulée conformément aux directives institutionnelles (accord #00186.02 ; Comité d’éthique régional des Pays de la Loire [France]). PBMC humaines ont été isolées du sang provenant des donneurs sains informés (Etablissement Français du Sang de Nantes, France). Toutes les mesures sont effectuées dans des conditions stériles.

1. Expansion de non spécifique des Lymphocytes effecteurs cytotoxiques T

  1. Préparer et irradier les cellules nourricières à 35 Gy. Pour la stimulation de 2 x 105 - cellules effectrices de 4 x 10,5 , préparer les PBMC6 10 x 10 et 1 x 106 BLCLs de trois donateurs distincts, en bonne santés.
  2. Remettre en suspension les cellules nourricières et cellules effectrices dans 15 mL de RPMI additionné de FCS inactivés par la chaleur de 10 %, 2 mM de L-glutamine, pénicilline (100 UI/mL) et streptomycine (0,1 µg/mL) et 300 UI/mL IL-2 recombinante.
  3. Ajouter PHA-L à une concentration finale de 1 µg/mL, mélanger soigneusement et distribuer 150 µL de la suspension de cellules par puits dans les plaques à 96 puits à fond U.
  4. Incuber à 37 ° C et avec 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée.
  5. Vérifier quotidiennement la plaque jusqu'à ce que des touffes de grandes cellules forme dans les puits de culture (~ jour 7).
  6. Transférer les cellules dans un flacon de culture à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de culture fraîche.
  7. Déterminer le nombre total de cellules de comptage (2 x par semaine) et de les entretenir à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de culture fraîche.
    Remarque : Les cellules immunes effectrices devraient être prêts pour l’administration thérapeutique à un état de repos (généralement 3 semaines après l’impulsion initiale de l’amplification). La pureté et la réactivité de ces cellules effectrices doivent être vérifiés avant in vivo les injections (par exemple, avec des analyses in vitro ).

2. préparation de cellules effectrices préopératoire

  1. Après avoir vérifié le nombre de cellules effectrices, recueillir les cellules effectrices dans un tube de 50 mL par centrifugation (300 x g pendant 5 min).
    Remarque : Pour compenser toute perte, préparer un excès de cellules (par exemple, 50 x 10,6).
  2. Avec précaution, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 15 mL de PBS et de Centrifuger pendant 5 min à 300 x g stérile pour effectuer le lavage.
  3. Soigneusement et complètement éliminer le surnageant et puis Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS stérile.
  4. Transférer les cellules remises en suspension dans un microtube de 1,5 mL pour la centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
  5. Soigneusement et complètement supprimer le surnageant par pipetage lentement.
  6. Resuspendre le culot dans 8 µL de PBS stérile par souris.
    NOTE : Ceci est une étape cruciale.
  7. Mesurer le volume de la suspension cellulaire à l’aide d’une micropipette. Si nécessaire, ajouter une solution PBS stérile (20 x 106 cellules 15 µL de PBS par dose) et mélanger soigneusement.
  8. Vérifier, à l’aide d’une micropipette, que le volume final par souris se situe entre 15 et 20 μL (impérativement < 20 µL).
  9. Conserver les cellules sur la glace jusqu'à injection stéréotaxique.
    NOTE : plus de 3 h h n’ont pas été testés.

3. stéréotaxique Injection

  1. Installation de l’équipement
    1. Monter et étalonner un petit cadre stéréotaxique animaux selon les instructions du fabricant pour s’assurer de l’exactitude des injections intracrâniennes (p. ex., taille de la seringue, volume désiré et vitesse d’injection).
      Remarque : Une vitesse de perfusion lente est recommandé (p. ex., 2-3 µL/min).
    2. Installer le matériel sous une armoire de sécurité microbienne (MSC) de maintenir la stérilité des instruments et de protéger les souris contre les infections.
      NOTE : Place » blocs isothermes » dans un bain d’eau à 37 ° C. Ce système limite l’hypothermie des souris pendant la chirurgie. Chauffage des plaquettes, qui sont nécessaires pour les soins post-procédure, doit être utilisé au cours de la surveillance continue de la température.
  2. Préparation préopératoire animale
    1. Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (10 mg/mL) et de xylazine (0,1 mg/mL) à 10 µL/g de poids de la souris.
    2. Effectuer un test du pincement orteil pour assurer la complète anesthésie et analgésie de l’animal.
      Remarque : N’importe quel mouvement témoigne d’une analgésie profonde non et, dans ce cas, quelques minutes sont nécessaires avant de répéter l’opération.
    3. Une fois que la souris est correctement anesthésiée, utiliser des ciseaux pour enlever la fourrure du site chirurgical (entre les deux oreilles, jusqu'à le nez).
  3. Préparation préopératoire cellulaire
    1. Soigneusement Resuspendre les cellules avec une pipette (plusieurs fois) avant chaque injection, afin d’empêcher toute cellule agglomérante.
    2. Tracer soigneusement le volume de suspension cellulaire requis (15-20 µL) dans la microseringue 22-G pour éviter l’aspiration des bulles.
      Remarque : Cette étape de la cellule de chargement dans la microseringue est importante afin de minimiser les écarts dans les volumes injectés. Recharger les cellules pour chaque injection individuelle entre les procédures pour empêcher n’importe quelle cellule agglomérante tout en assurant un nombre pair d’administration de cellules effectrices de la cohorte.
    3. Ensuite, placez la seringue dans le pousse-seringue adaptée.
  4. Soins de la procédure
    1. Désinfecter le site chirurgical avec tampons trempés dans la solution de povidone-iode 5 % au moins de 3 x.
    2. Placer une pommade ophtalmique lubrifiante dans les yeux de la souris afin d’éviter tout dessèchement de la cornée.
    3. Position de la souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique, sur un bloc isotherme chaud recouvert d’une pellicule de plastique stérile pour maintenir la température de la souris pendant la chirurgie et de limiter la mortalité.
      NOTE : Nez et les dents de la souris doivent être convenablement positionnés au-dessus de la barre de la dent, afin d’assurer un débit respiratoire adéquat au cours de la procédure.
    4. Une fois que la souris est positionnée au-dessus de la barre de la dent, serrer les barres d’oreilles fermement sous les oreilles de la souris pour immobiliser la tête.
      Remarque : Veillez à ne pas endommager les tympans ou compromettre la respiration.
    5. Faire une incision de la peau sagittale médiane 1 ou 2 cm avec des ciseaux stériles le long de la partie supérieure du crâne d’antérieur postérieur pour exposer le crâne.
    6. Identifier l’intersection de la suture sagittale et coronale (Bregma) pour servir de points de repère pour la localisation stéréotaxique avant l’injection (illustrée à la Figure 1).
    7. Placez la microseringue au-dessus de ce point.
    8. Déplacer la microseringue latérale droite 2 mm et 0,5 mm partie antérieure de la Bregma.
    9. En utilisant un microforages, faire un petit trou dans le crâne avec une mèche stérile au point de coordonnées prédéterminé. Veillez à rester superficielle afin d’éviter toute lésion traumatique du cerveau.
      Remarque : Dans ce protocole, les cellules immunitaires ont été injectés au sein d’une tumeur établie (une semaine après l’injection de cellules tumorales). La peau devrait être réouvert (cicatrice) et l’injection est effectuée par les mêmes coordonnées utilisées pour l’implantation de cellules de tumeur (le trou est généralement toujours présent jusqu'à 2 semaines après l’injection). Coordonnées ont été sélectionnées pour l’injection des cellules tumorales et effecteurs dans le cerveau parenchyme13,14.
  5. Injection de cellules effectrices immunitaire
    1. Avec précaution, insérer la microseringue dans le trou percé et, se déplaçant lentement, transmettre l’aiguille 3 mm vers le bas dans la dure-mère et vers l’arrière puis 0,5 mm à une profondeur finale de 2,5 mm avant l’injection des cellules effectrices.
    2. Exécutez l’injection de cellules effectrices à 2-3 µL/min et surveiller les souris tout au long du temps d’injection.
    3. Une fois l’injection terminée, retirer l’aiguille pour seulement 1 mm et garder la microseringue en place pendant une minute supplémentaire avant de lentement se retirer complètement la microseringue, pour éviter toute fuite provenant du site de perfusion.
      Remarque : Après le retrait de l’animal de l’appareil stéréotaxique, nettoyer immédiatement le matériel d’injection pour des expériences à venir.
  6. Les soins post-opératoires et le suivi de la souris
    1. Retirez l’animal le cadre stéréotaxique et immédiatement appliquer la povidone-iode 5 % solution sur le site de l’incision puis fermez la peau avec une suture chirurgicale appropriée.
    2. Appliquez le gel de lidocaïne 2 % directement sur la plaie et administrer 0,15 µg/g de buprénorphine par une injection sous-cutanée d’analgésie post procédurale.
    3. Lieu de retour la souris anesthésiée à sa cage au-dessus d’un coussin chauffant mis à 37 ° C pour maintenir une température corporelle de souris approprié et d’éviter une hypothermie.
      Remarque : Un logement distinct n’est pas nécessaire.
    4. Contrôler la souris jusqu'à ce qu’il est complètement remis de l’anesthésie et le transférer dans une chambre de logement.
      Remarque : A ce jour, ce protocole est bien pris en charge que peu de complications imprévues ont eu lieu (5 < % des souris injectées).
    5. Tous les jours surveiller les souris et les euthanasier quand on observe des signes de santé en déclin (p. ex., posture voûtée, mobilité réduite, prostration ou perte de poids significative [≥ 15 %]).

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Résultats

Cette étude décrit la stratégie des transferts adoptifs des cellules effectrices immunitaires cellulaires dans le cerveau des souris porteurs de tumeur, basé sur des injections stéréotaxiques réalisées directement dans le lit de la tumeur.

Pour minimiser le risque de lésion cérébrale associée à un volume d’injection grande, la suspension de cellules effectrices doit être concentré (20 x 106 cellules e...

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Discussion

Un transfert adoptif de sélectionné natif ou cellules effectrices immunitaire machiné représente une approche prometteuse pour traiter efficacement les tumeurs, comme les cancers du cerveau infiltrante, en prenant soin de limiter la réactivité contre les cellules non transformées15, 16,17,18. Toutefois, le système nerveux central, qui comprend le cerveau, a un statut particulier de sys...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le personnel de l’hôpital universitaire animalerie (UTE) de Nantes pour l’élevage et soins, cellulaire et tissulaire d’imagerie de laboratoire central de l’Université de Nantes (MicroPICell) pour l’imagerie et la facilité de la cytométrie en flux (Cytocell) de Nantes pour leur assistance technique d’experts. Ce travail a été financé par l’INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interrégional 2017) et le consortium européen ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). L’équipe est financé par la Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Ce travail a été réalisé dans le contexte de la LabEX IGO et les programmes de IHU-Cesti, soutenu par le National Research Agency Investissements d’avenir via les programmes ANR-11-LABX-0016-01 et ANR-10-IBHU-005, respectivement. Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la région Pays de la Loire. Les auteurs remercient Chirine Rafia pour aider à corriger le manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
PBMCsfrom 3 different healthy donors
BLCLsfrom 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)Gibco31870-025
FCSDutscherS1810-500
L-glutamineGibco25030-024
penicillin/streptomycinGibco15140-122
IL-2Novartisproleukin
PHA-LSigmaL4144
Stereotaxic frameStoelting Co.51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame  Stoelting Co.51624
microsyringe pump injector WPIUMP3-4
NanoFil SyringeWPINF34BV-2
NSG miceCharles RiverNSGSSFE07S
KetamineMerialImalgène 1000
XylazineBayerRompur 2%
ScissorsWPI201758
ForcepsWPI501215
OmniDrill 115/230VWPI503598
Vicryl 4-0EthiconVCP397H
XylocaineAstrazeneca3634461

Références

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