Fréquente la queue-extrémité prélèvements chez les souris pour l’évaluation de la sécrétion de l’Hormone lutéinisante Pulsatile

Résumé

Nous présentons ici un protocole de prélèvement de sang de la queue-extrémité pour prélèvement fréquents chez les souris sans retenue. Cette méthode est utile pour évaluer des modèles de la sécrétion pulsatile de LH et pourrait être adaptée pour l’analyse d’autres facteurs circulants.

Résumé

Dans de nombreux systèmes endocriniens, des hormones ou des facteurs circulants ne sont pas libérés de façon continue, mais sont sécrétées comme une impulsion discrète en réponse à un facteur de libération. Seul point d’échantillonnage mesures sont insuffisantes pour comprendre pleinement la signification biologique du modèle sécrétrice d’hormones pulsatiles soit dans des conditions physiologiques normales, soit en cours de dérégulation. L’hormone lutéinisante (LH) est synthétisée par les cellules de gonadotrope hypophysaire antérieure et sécrétée de façon pulsatile qui nécessite de fréquent collecte d’échantillons de sang pour évaluation de l’impulsion. Cela n’a pas été possible chez la souris jusqu'à ce que récemment, grâce au développement d’un test de LH ultrasensible et avancement dans une technique de fréquentes de prélèvement d’échantillons de faible volume, initialement décrit par Steyn et ses collègues. ¹ nous décrivons ici un protocole pour le prélèvement de sang périphérique fréquents de souris avec l’acclimatation de manipulation suffisantes pour détecter la sécrétion pulsatile de LH. Le protocole actuel détaille une période d’acclimatation élargie qui permet de mesurer les impulsions robustes et continues de LH depuis plusieurs heures. Dans ce protocole, l’extrémité de la queue est coupée et le sang est recueilli de la queue à l’aide d’une pipette à main. Pour l’évaluation de type pulsatile LH chez la souris gonadectomized, échantillons de la série sont recueillies toutes les 5-6 min pour 90-180 min. ce qui est important, la collecte de sang et de la mesure des impulsions robustes de LH peuvent être accomplis en souris éveillés, librement de comportement anormal, étant donnés la manipulation adéquate acclimatation et des efforts pour minimiser les facteurs de stress environnementaux. Acclimatation suffisante peut être réalisée dans les 4-5 semaines ayant précédé le prélèvement de sang. Ce protocole met en évidence les progrès dans la méthodologie afin d’assurer la collecte d’échantillons de sang pour mesurer les patrons de sécrétion pulsatiles LH depuis plusieurs heures chez la souris, un modèle animal puissant de recherche neuro-endocrines.

Introduction

Fonction des gonades chez les mammifères est dépendante de la sécrétion de gonadotrophine, hormone lutéinisante (LH) et folliculostimulante hormone de l’hypophyse. Les gonadotrophines sont sécrétées en soit un modèle pulsatile ou surtension en réponse à la sécrétion hypothalamique de la gonadolibérine (GnRH). La synthèse et la sécrétion de LH et FSH sont réglementés par une action endocrine, paracrine et autocrine d’une variété de molécules dont GnRH hypothalamique, hormones stéroïdes gonadiques et le système de l’activine-inhibin-follistatine, mais aussi une myriade de conditions physiologiques, y compris l’équilibre énergétique et de stress. ²

Le modèle pulsatile de LH dans le sang provient plutôt brusque décharge de LH dans le sang périphérique, suivi par environ exponentielle élimination. Important du modèle comprennent la fréquence de chaque décharge de LH et l’amplitude de la réponse de la LH, qui sont dictées, en partie, par la libération de GnRH. Due à la difficulté dans la collecte de sang portal hypothalamo-hypophysaire pour la mesure de GnRH pulsatile, l’échantillonnage et la mesure de LH est utilisé comme un proxy pour règlement de GnRH de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. Donc, information critique est codée de la fréquence et l’amplitude des impulsions de LH, ce qui ne peut être déterminée à partir d’un seul échantillon.

Analyse de la sécrétion pulsatile de LH a toujours été limitée aux grands mammifères (moutons, les primates et les humains) en raison de leur volume sanguin important et la tolérance pour le prélèvement d’échantillons sanguins fréquents. Chez les rongeurs, les prélèvements sanguins fréquents se limitait au rat et atteint via oreillette cathéter à demeure. ^{3 , 4} le coût relativement faible et la disponibilité des ressources génétiques (par exemple , le cre-lox, le CRISPR) et des manipulations des circuits neuronaux complexes (p. ex. optogenetics, chemogenetics) faire des souris un organisme modèle attrayant ; Cependant, réalisation d’échantillons sanguins fréquents et l’analyse ultérieure des concentrations de LH a jusqu'à récemment, prouvé insaisissables. Cette tâche monumentale a été mis au point par Steyn et ses collaborateurs. ¹ depuis lors, plusieurs laboratoires ont commencé à utiliser les prélèvements sanguins fréquents et ultra-sensible des dosages de LH pour évaluer la sécrétion pulsatile de LH dans une variété de paradigmes expérimentaux. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} il convient de noter que la poursuite d’une méthode pratique de rassembler plusieurs échantillons de sang des souris a été en cours pendant au moins 40 ans¹⁰ avec plusieurs perfectionnements réalisés le long du chemin. ^{11 , 12}

Évaluation des modèles d’impulsions LH (c'est-à-dire la fréquence et l’amplitude) représente une amélioration majeure dans le suivi de la sécrétion de gonadotrophine basale dans ce modèle animal génétiquement tractable. Traditionnellement, les concentrations de LH chez la souris ont été déterminées dans un échantillon sanguin. Une faiblesse d’échantillons monopoint est un ensemble de données très variable, parce que les concentrations de LH sont naturellement fluctuant au cours de chaque impulsion. Une autre faiblesse est que les mesures isolées manquer intrinsèquement critique information véhiculée par les patrons de la sécrétion de LH impulsion. Ainsi, une méthode de collecte des échantillons de sang fréquents en comportement librement, souris sans retenue (à l’exception de la manipulation douce lors de l’échantillonnage) fournira informations améliorées et s’avérer utiles à de nombreux laboratoires enquêter sur règlement hormone pulsatile.

Nous décrivons ici un protocole pour la collecte de fréquents (toutes les 6 min) des échantillons provenant de souris éveillés, sans retenue de sang. Ce qui est important, nous incluons une manipulation protocole d’acclimatation qui permet pour détection robuste et continue des sécrétion pulsatile de LH dans les échantillons de sang entier recueillies pendant un laps de temps où, avant et après l’évaluation à une stimulation aiguë peut être déterminé, comme la réponse au stress psychosocial d’immobilisation et de retenue. Un test efficace pour les concentrations de LH provenant d’échantillons de sang entier a été décrit précédemment ; ¹ le présent protocole est axé sur une méthode pour rassembler les échantillons de sang pour une mesure du pouls LH.

Protocole

La méthode décrite ici est en accord avec les National Institutes of Health Animal Care et les directives d’utilisation et ont été autorisés par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Californie, San Diego et d’institutionnels animalier.

1. acclimatation à la manipulation

1. Procédure de gestion
   1. Placer les cages de souris dans la prévention des risques biotechnologiques armoire. Retirez la première souris de la cage et le déposer sur un support approprié (par ex. un couvercle de cage propre) au sein de la biosécurité du cabinet.
   2. Freiner doucement la souris sur la surface de travail en tenant la base de la queue avec l’index et le pouce d’une main. Ensuite, bien caresser la surface ventrale de la queue, de la base jusqu'à l’extrémité de la queue, avec l’index et le pouce de l’autre main. Répétez ceci caressant 6 fois (c'est-à-dire 1 ensemble) et de regagner sa cage de la souris.
   3. Attendre 6 min et répétez l’étape 1.1.2.
      Remarque : Au total, étape 1.1.2 sera répété 4 fois par souris (c'est-à-dire 4 séries de 6 coups), afin que chaque souris seront partageront une somme de 24 coups de queue sur chaque jour de traitement.
2. La fréquence des manipulations quotidienne
   1. De cinq jusqu'à deux semaines avant le jour de la collecte de sang prévues, gérer la souris comme indiqué au point 1.1, cinq jours par semaine (les souris ne sont pas gérés le samedi ou le dimanche avant les deux dernières semaines d’acclimatation).
   2. Si le traitement expérimental pendant la période d’échantillonnage inclura toute manipulation supplémentaire (p. ex. scruffing ou par injection intrapéritonéale), acclimater les souris à cette activité de manutention au cours de chaque séance de traitement.
      Remarque : Pour l’acclimatation aux procédures d’injection, utilisez une aiguille atténuée pour effectuer une injection simulée.
   3. Pendant les deux semaines avant le jour de la collecte de sang prévues, gérer la souris comme décrit au point 1.1, sept jours par semaine.
   4. Au moins deux semaines avant le jour de la collecte de sang prévues, maison de souris par paires afin de minimiser les perturbations des souris lors de l’échantillonnage.

2. préparation des Tubes de prélèvement sanguin

1. Préparer ultrasensible LH du tampon dans une bouteille en verre : 0,2 % d’albumine sérique bovine et 0,05 % Tween-20 dans du PBS [0,2 g KCl, 8 g de NaCl, 1,44 g Na₂HPO₄ (anhydre), 0,24 g KH₂PO₄, eau ultrapure à 1 L, pH 7,4, filtre et stériliser] , conserver à 4° C. ¹
   NOTE : Volume de tampon d’ultrasensible LH à préparer peut être calculé basé sur le nombre d’échantillons et le volume par exemple comme indiqué ci-dessous (2.2 & discussion)
2. Préparer les tubes de prélèvement sanguin (tubes de microcentrifuge de 0,6 mL). Étiqueter les tubes et tampon aliquote (57 µL de tampon par tube ; Notez, ce volume peut varier selon le volume du sang prélevé ou le rapport du sang vers le tampon souhaité). Tubes peut être jours prêts avant l’échantillonnage, conserver à 4 ° C.

3. collecte de sang

1. Préparation des documents de collection de sang.
   1. Préparer la biosécurité cabinet à utiliser et organiser les matériaux suivants dans la hotte ou sur une charrette à proximité : 10 µL Pipeter (jeu de 3 µL ou volume de collecte de sang désirée), pointes de pipette, poubelle pour pointes de pipette usagés, minuterie, imprimé avec nombre d’animaux et échantillon numéros ( pour les notes concernant les problèmes d’échantillonnage ou animales), la glace seau avec des tubes de prélèvement sanguin, ciseaux et petite gaze (2 "x 2").
      NOTE : Le « décompter » fonction sur une minuterie de laboratoire est utile car elle n’a pas une alarme sonore qui pourrait perturber les souris
   2. Utilisez un marqueur permanent pour marquer la queue de chaque souris (près de la base) pour aider à l’identification rapide de la souris correcte lors de l’échantillonnage.
2. Détourage de la préparation de la queue et de sang avant la collecte.
   1. À 45 min avant le début de la collecte de sang, enlever la première souris de sa cage et placer sur une surface appropriée (un couvercle de cage propre fonctionne bien) au sein de la biosécurité du cabinet.
   2. Utiliser des ciseaux pointus et stérile pour enlever 1 à 2 mm de l’extrémité de la queue de souris, après préparation aseptique (c.-à-d. frotter avec alcool et Bétadine).
      Remarque : Ceci peut être accompli chez l’animal éveillé avec retenue douce ou sous anesthésie isoflurane.  En outre, l’analgésie peut être fournie suite à la recommandation de l’IACUC local.
   3. Soigneusement caresser la queue de la souris comme décrit ci-dessus (1.1.2 ; 1-2 traits suffisent généralement) jusqu'à ce que la goutte de formes de sang sur le bout de la queue.
   4. Utiliser une pipette avec un embout propre à recueillir 3 µL de sang de l’extrémité de la queue et jeter l’embout de la pipette avec du sang.
   5. Avant de regagner sa cage de la souris, faire en sorte que le débit sanguin est arrêté. Si nécessaire, appliquez une légère pression avec une gaze stérile.
   6. Répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.5 pour toutes les souris. Des échantillons de sang suivantes peuvent être collectées en caressant fermement queue de la souris jusqu'à ce qu’une goutte de formes de sang à l’extrémité de la queue.
      Remarque : Si une goutte de sang ne forme pas après coups de fermes, la queue peut être tamponnée avec un tampon de gaze trempé dans une solution saline. Les caillots sont plus susceptibles de forme lors de l’échantillonnage moins fréquente (c'est-à-dire > 15 min d’intervalle). Une fois que le caillot est dégagé de la veine, l’échantillonnage peut continuer.
   7. Continuer à collecter 3 µL de sang de chaque souris comme décrit ci-dessus toutes les 6 minutes pendant environ 45 min au cours de cette période de préparation de prélèvement sanguin préalable. Jeter le bout de sang et de la pipette.
3. Prélèvements sanguins
   1. Collecter 3 µL de sang de l’extrémité de la queue comme décrit ci-dessus. Prendre des précautions pour s’assurer que tout l’échantillon 3 µL l'on tient l’embout de la pipette (sans bulles ou contamination literie). Éjectez l’échantillon de sang dans le tampon dans un tube marqué. Mélanger par retournement et retourner le tube à la glace.
   2. Avant de regagner sa cage de la souris, faire en sorte que le flux sanguin est arrêté. Si nécessaire, appliquez une légère pression avec une gaze stérile.
   3. Répétez les étapes 3.3.1 - 3.3.2 pour chaque souris, toutes les 6 minutes, pour la durée d’échantillonnage prédéterminé. Contrôler chaque animal pour des signes de détresse (des paupières par exemple partiellement fermées, position voûtée [ne pas causé par un autre traitement] ou absence de réponse au traitement) et arrêtez d’échantillonnage, si nécessaire.
      NOTE : Détresse comportementale ou autres complications qui exigent la cessation de l’échantillonnage survient très rarement dans notre laboratoire.
   4. Si les animaux n’est pas euthanasiés après les prélèvements sanguins, veiller à ce que le flux sanguin de la queue-extrémité soit complètement arrêtée. Essuyer tout sang déversé à l’intérieur de la cage de chaque animal (ou des cages de changement) et retourner les cages d’animaux à la crémaillère de logement.

4. traitement et analyse de l’échantillon

1. Conserver des échantillons de sang à-20 ° C jusqu'à l’analyse.
   Remarque : La LH est analysé dans les échantillons de sang total dilués dans du tampon ; aucune séparation du sérum ou du plasma n’est nécessaire avant le stockage ou l’analyse.
2. Essai des échantillons de sang par ELISA ultrasensible comme décrit précédemment les valeurs¹ et rapport en ng/mL de sang total après correction pour la dilution volume de l’échantillon dans le tampon.
3. Identifier les impulsions de LH dans le jeu de données. Calculer et comparer l’amplitude d’impulsion moyenne et fréquence d’impulsion (ou intervalle inter impulsion) en fonction de l’ensemble de données.
   Remarque : Les programmes et les critères publiés^13,14 ,^15,,¹⁶ , pour la détection des impulsions de LH sont disponibles.

Résultats

Représentant motifs d’impulsions de LH du 4 souris sont indiquées dans la Figure 1 (données Yang et al., tirées à 2017). LH a été mesuré dans des échantillons de sang fréquents pour déterminer la réponse à une stimulation aiguë de stress psychosocial. Les souris C57/Bl6 femelles adultes étaient ovariectomisées et traitées comme il est indiqué dans le présent protocole pour la collecte de sang fréquents. Des échantillons de sang...

Discussion

Nous décrivons ici un protocole de prélèvement de sang fréquents des échantillons de sang total queue-extrémité pour l’évaluation de la sécrétion pulsatile de LH chez la souris. Ce protocole permet le prélèvement d’échantillons pour la détection des changements aigus dans la sécrétion pulsatile de LH après exposition à un stress psychosocial et est bien adapté pour l’évaluation des impulsions de LH en vertu d’autres manipulations aiguës ou chroniques.

Un élément ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001