Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux

Résumé

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire est une technique d’analyse chimique directe qui minimise la préparation de l’échantillon et élimine la chromatographie, permettant la détection rapide de petites molécules de tissus végétaux.

Résumé

Les plantes produisent des milliers de petites molécules qui sont différentes dans leurs propriétés chimiques. Spectrométrie de masse (MS) est une technique puissante pour l’analyse des métabolites végétaux car il fournit des poids moléculaires avec une spécificité et une sensibilité élevée. Pulvérisation foliaire MS est une technique d’ionisation ambiant où tissu végétal est utilisé pour l’analyse chimique directe via electrospray, éliminant la chromatographie du processus. Cette approche d’échantillonnage des métabolites permet un large éventail de classes chimiques de détecter simultanément des tissus végétaux intacts, minimisant la quantité de préparation de l’échantillon nécessaire. Lorsqu’il est utilisé avec une MS de masse à haute résolution, précise, pulvérisation foliaire MS facilite la détection rapide des métabolites d’intérêt. Il est également possible de recueillir des données de la fragmentation de masse en tandem avec cette technique pour faciliter une identification composée. La combinaison de mesures précises de masse et de la fragmentation est bénéfique à confirmer les identités composées. La pulvérisation foliaire technique MS nécessite seulement des modifications mineures à une source d’ionisation de tuyères et est un outil utile pour accroître les capacités d’un spectromètre de masse. Ici, les tissus de la feuille fraîche de Sceletium tortuosum (Aizoaceae), une plante médicinale traditionnelle d’Afrique du Sud, sont analysée ; nombreux alcaloïdes mesembrine sont détectés avec une pulvérisation foliaire MS.

Introduction

Les plantes contiennent un large éventail de petites molécules ayant des propriétés chimiques différentes. MS est une technique puissante pour l’analyse de composés végétaux parce qu’elle peut offrir des compositions élémentaires avec une grande sensibilité et une spécificité pour la détection et l’identification des métabolites¹. Le plus souvent, MS est effectuée sur les échantillons extraits au solvant, qui sont séparés par chromatographie en phase avant l’analyse MS¹. Cependant, l’utilisation de la chromatographie liquide (LC) nécessite fois longue analyse et est souvent associée à un vaste échantillon préparation¹. En revanche, l’analyse chimique directe des tissus intacts qui contourne la chromatographie est une technique très rapide, nécessitant un minimum d’échantillon préparation². Ainsi, dans les cas où des mesures chromatographiques peuvent être abandonnées, une analyse chimique directe peut être très avantageuse.

Typique LC-MS pour la recherche de produits et de la métabolomique naturelle s’appuie sur les extractions longues en vrac de matériaux végétaux séchés ou surgelés contenant plusieurs tissus et cellules types³. Sinon, analyse chimique directe, telles que la détection de MS des métabolites du tissu végétal, peut isoler les types de cellules et éviter les artefacts de préparation⁴. Pulvérisation foliaire MS, également dénommée tissu-spray^5,6, est une technique d’ionisation ambiant direct MS, qui requiert essentiellement aucun échantillon préparation^5,7. Pulvérisation foliaire que MS est étroitement liée au jet de papier MS, une technique d’ionisation ambiant avec caractéristiques d’ionisation par électronébulisation qui permet la détection des analytes qui sont déposés sur papier,⁷. Malgré son nom, pulvérisation foliaire MS est applicable à différents types de tissus végétaux, laisse pas juste et a été démontrée sur les fruits, graines, racines, les tissus floraux et tubercules, entre autres,^{6,8,9, 10,11,12}. La technique facilite l’ionisation du endogène phytochimiques directement à partir des matières végétales dans le spectromètre de masse pour détection⁸. Pulvérisation foliaire MS peut également fournir des informations sur la distribution spatiale des produits chimiques dans les types de tissus différents en plantes¹³. Lorsque la pulvérisation foliaire MS est comparée à l’extraction par solvant et LC-MS, les résultats suggèrent de pulvérisation foliaire que MS permet une détection rapide des métabolites surfaces de types de cellules uniques tels que les trichomes¹³. La figure 1 illustre le montage expérimental de MS pulvérisation foliaire. Ionisation par électronébulisation directe se produit après que des modifications mineures de source. Une tension élevée est appliquée pour les tissus végétaux par un collier métallique, produisant une pulvérisation de gouttelettes survoltées, formant un cône de Taylor qui transporte les ions à l’entrée d’ion de la Mme Electrospray Ionisation se produit dans le liquide naturel de la plante ou de l’appl solvant EEI à la surface de la plante. Un embout pointu sur le tissu facilite l’électrospray et peut être naturellement naturels ou créés par la coupe.

Pulvérisation foliaire MS est une méthode rapide pour l’analyse qualitative et semi quantitative des tissus végétaux intacts qui ont trouvé l’utilitaire pour une grande variété d’applications. Par exemple, la technique a été utilisée pour détecter des composés endogènes pour distinguer les espèces apparentées et même d’évaluer les changements dans la même espèce cultivée dans des conditions différentes. Des études antérieures ont montré cette approche en mesurant les métabolites dans Callicarpe (Callicarpa L.) ¹² et ginseng américain (Panax quinquefolium L.) ⁶. dans le dernier exemple, ginsenosides, des acides aminés et oligosaccharides pourraient être détectés après mouillage tissu brut ginseng. Ginseng américain sauvage et cultivé ont été dissociés du tubercule tranches⁶. Le ginseng tuber intégrité a été préservée succédant pulvérisation foliaire MS, permettant une inspection morphologique et microscopique ultérieure⁶. En outre, les composés exogènes sur des échantillons de plantes peuvent également être détectés. Un certain nombre de pesticides (acétamipride, diphénylamine, imazalil, linuron et thiabendazole) ont été détecté sur peel ou pulpe de fruits et légumes⁹. Alors que ces études et beaucoup d’autres ont montré l’utilité de pulvérisation foliaire MS à diverses fins spécifiques, un protocole détaillé n’a pas été précédemment signalé.

Ici, la description de protocole ne se concentrera pas sur l’optimisation de la méthode pour un tissu spécifique ou composé. Plutôt, la détection des alcaloïdes mesembrine de Sceletium tortuosum (L.) n.e.br. (Aizoaceae) est utilisée à titre d’exemple pour discuter des mesures d’optimisation nécessaires qui doivent être prises lorsque vous configurez une expérience de MS pulvérisation foliaire pour une espèce, tissu, ou composés pour la première fois. S. tortuosum est une succulente endémiques à la région semi-aride de klkkfj d’Afrique du Sud. Un remède traditionnel du San et Khoi Khoi peoples, on l’utilisait pour suppression appétit et la soif ainsi que pour ses effets psychotropes et analgésique^14,15. Actuellement, les extraits normalisés sont utilisés pour le traitement des troubles neuropsychiatriques et neuropsychologiques^16,17. Les composés primaires d’intérêt incluent l’alcaloïde mesembrine et ses dérivés, dont beaucoup se trouvent aussi dans connexes Sceletium espèces¹⁵. Les populations sauvages et cultivées de S. tortuosum ont des concentrations variables d’alcaloïdes mesembrine, présentant ainsi un contrôle de la qualité défi¹⁸. Une méthode pour la détection rapide des alcaloïdes mesembrine, comme la pulvérisation foliaire MS, peut-être être utile pour la surveillance des produits de Sceletium . Car auparavant, il n’y avait eu aucun protocole d’essai visuel détaillé pour la pulvérisation foliaire technique MS, Nous illustrerons la méthode à l’aide de l’exemple de S. tortuosumet décrit ce qui suit : la modification d’une source de tuyères, les sélection et préparation des tissus végétaux, l’acquisition des données, l’interprétation des résultats et l’optimisation des paramètres du MS.

Protocole

1. les modifications à la Source de tuyères pour vantail pulvériser MS

1. Utiliser une source de tuyères modifiés pour pulvérisation foliaire MS. Comme aucun composant fluidique est nécessaire pour la pulvérisation foliaire MS, modifiez la source en retirant la sonde LC de la source.
2. Assembler le fil de MS pulvérisation foliaire qui s’applique à la tension pour les tissus végétaux avec la goupille appropriée pour brancher à la source. Souder les broches à une extrémité d’un fil isolé ; une pince à l’extrémité opposée du fil à souder.
   Remarque : La pince (alligator clip type) peut ou peut ne pas avoir de dents. Pour les petits tissus, une pince sans dents est préférée. Un bras flex en option avec une pince peut être ajouté à la source de tuyères pour aider à positionner le tissu de la plante. Remarque que ce protocole décrit plus précisément comment effectuer la pulvérisation foliaire MS sur un analyseur masse piège ionique quadripolaire hybride MS système (voir la Table des matières) ; Cependant, les autres systèmes MS peuvent être modifiées pour effectuer cette technique⁶. Pulvérisation foliaire de couplage MS avec une analyse chimique en temps réel portable spectromètre de masse peuvent être effectuées sur place sans avoir à transporter le matériel végétal au laboratoire^19,20.
3. Placez un tapis protecteur antistatique sur l’étage inférieur de la source pour réduire la décharge électrique qui peut-être résulter de la source lors de l’utilisation des hautes tensions.

2. préparation du système MS MS pulvérisation foliaire

1. Si le système a été récemment utilisé, laissez-le refroidir au toucher et supprimer n’importe quelle source alternative et le cône de balayage. Attachez la source de MS de pulvérisation de feuille tuyères.
2. Créez un fichier de musique avec les paramètres appropriés d’ionisation définies comme suit : gaine, auxiliaire et le gaz de balayage à 0 ; la tension de pulvérisation de 2 à 5 kV ; la température capillaire à 150-250 ° C ; et le niveau de RF S-objectif à 50. Enregistrez le fichier de musique avec les paramètres désirés^8,13. Optimiser la tension et la température pour la meilleure ionisation des tissus et des composés d’intérêt.
   Remarque : Les bons points de départ sont 4 kV et 200 ° C.
3. Faire un fichier de méthode, y compris le fichier d’air spray MS feuille avec : MS pleine positives et négatives ; une résolution de 70 000 ; une cible d’AGC de 1 x 10-⁶; un maximum de 200 ms ; et la gamme de numérisation souhaitée m/z. Alternativement, utiliser seulement 1 polarité.

3. préparation de l’Instrument, des solvants et des tissus végétaux

Remarque : Toujours porter des gants et n’utilisez pas de tissu de la plante qui a été manipulé à mains nues. Dans le cas contraire, les ions de contaminants comme le polyéthylène glycol dominera les spectres.

1. Apporter les tissus végétaux pour l’analyse de la même pièce que le système de SM pour permettre un échantillonnage rapid.
2. Pour les tissus végétaux qui n’ont pas une pointe naturellement, utiliser une lame de rasoir sur une lame de verre pour couper un point conique (Figure 2). Déterminer la quantité de tissu nécessaire à l’analyse fondée sur la sensibilité de l’instrument, type de tissu et composés d’intérêt (p. ex., un jeune S. tortuosum feuille d’environ 5 mm de longueur).
   1. Coupe S. tortuosum quitte à 10 semaines après la germination en fines lanières, chacune avec une extrémité effilée pour former un point.
3. Forceps permet de sélectionner doucement le tissu de la plante à la fin qui est ancrée. Tenant le tissu avec une pince, soigneusement les transférer dans la pince.
   ATTENTION : Ne touchez pas la source de l’instrument si la tension est activé.
4. Ajuster le bras flexible et le fil avec la pince pour positionner le tissu conforme à l’entrée du MS afin que la distance entre le tissu de la plante et l’entrée d’ion de la MS est de 5-10 mm pour le triple quadripôle (p. ex., TSQ) et linéaire piège quadripolaire (LTQ) et 10 -50 mm pour le piège à ions analyseur de masse (p. ex., Orbitrap valant)⁸.
   1. Branchez l’autre extrémité du fil à la source. Si les premières tentatives de produire une intensité de signal faible, déplacer les tissus végétaux plus près à l’entrée d’ions (se reporter à la Discussion pour l’optimisation).
5. Chargez le fichier méthode ; Nommez le fichier de données et définissez l’emplacement de stockage du fichier. Allumez le système SM en cliquant sur Play , puis cliquez sur Démarrer pour commencer l’acquisition de données.
6. Appliquer un solvant (p. ex., méthanol) à l’aide d’une pipette avec une pointe de gel de chargement afin de maximiser la distance entre les mains et la haute tension pour protéger l’utilisateur.
   Remarque : Le volume de solvant nécessaire dépend de la taille, la sécheresse et la texture du tissu, généralement ~ 2-20 µL. S. tortuosum feuilles ne nécessitent pas un solvant quelconque à ajouter. Appliquer soigneusement le solvant et ne touchez pas la source de l’instrument lorsque la tension est allumé. Utiliser des solvants grade LC-MS et la verrerie qui a été lavé l’acide et est exempt de détergents. Dans certains tissus, on peut observer un signal sans l’ajout d’un solvant en raison de la teneur en eau naturelle du tissu végétal. Toutefois, une plus grande intensité de signal et réduit S/N est généralement obtenue en appliquant un solvant sur le tissu.
7. Acquisition de données tant que persiste le signal ou jusqu'à ce que les spectres suffisantes ont été recueillies, généralement de 30 à 60 s. Si nécessaire, appliquer des solvants supplémentaires afin de maintenir une intensité de signal élevé pour une plus longue durée. Arrêter la collecte de données et mettre en pause le système SM.
8. Enlever le tissu et laver la pince avec 100 % de méthanol et d’un chiffon non pelucheux. Nettoyer l’entrée d’ion MS après environ 1-2 h de l’acquisition par pulvérisation foliaire MS selon les spécifications du fournisseur. En outre, nettoyer l’entrée d’ions MS entre les analyses des types de tissus différents.

4. évaluation de la qualité de données

1. Ouvrez le fichier de données et inspecter visuellement le chronogramme de masse pic de base. Vérifier que l’intensité du signal est ~1.0 x 10⁷ à 5,0 x 10⁸. Si le signal est plus faible, déplacer le tissu de plus près à l’entrée d’ions. Si plus haut, l’extrémité avant du système MS se sale, donc passer le tissu plus éloigné de l’entrée de l’ion.
2. Basé sur la présence ou l’absence des ions d’intérêt dans les spectres de masse produit, modifier les paramètres.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

5. Fragmentation de masse en tandem

1. Décider quels ions sont d’intérêt pour la fragmentation de masse en tandem (MS/MS) ; un signal de spectres de masse qui est > 1,0 x 10⁵ est suffisant pour la sélection des ions pour MS/MS.
2. Faire un nouveau fichier de méthode avec une liste d’inclusion de m/z à 4 décimales. Cliquez sur listes globales et l’Inclusion. Sous Propriétés du PRM, sélectionnez l’énergie de fragmentation [p. ex., énergie de collision normalisée (RCE) de 30-50 est une bonne gamme d’abord] et d’autres paramètres de MS/MS.
   1. Pour obtenir des données de MS/MS pour les alcaloïdes mesembrine, fragmenter les ions suivantes, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zet de 292.1897 m/z, 35 NCE.
      Remarque : L’acquisition de données de MS/MS peut être effectuée immédiatement après la MS ou à une date ultérieure. Le même tissu peut souvent rester fixé après une MS complet et peut être réutilisé pour acquérir des données de SM/SM. Toutefois, si un pulvérisées ne fournit pas un signal suffisant, utilisez un nouveau tissu.
3. Charger le fichier de méthode MS/MS et un fichier de données nommé. Allumez le système MS et commencer à acquérir des données, en ajoutant un solvant si nécessaire. Quand les spectres suffisantes ont été recueillies, généralement après 30 à 60 s, arrêter l’acquisition.
4. Recueillir la fragmentation au niveau de plusieurs énergies différentes lors de l’affectation des ions fragments.
   Remarque : Étant donné que la pulvérisation foliaire MS ne dispose pas d’une séparation chromatographique, les spectres de fragmentation sont susceptibles de contenir de nombreux ions et fragmenter à différentes énergies aidera à faire la lumière.

6. putatives Identifications par Fragmentation masse masse exacte et Tandem

1. Faire des identifications putatives en faisant référence à des mesures de masse exactes des bases de données accessibles au métabolite comme Metlin²¹,²²de la base de données du métabolome humaine, Banque de masse²³, Lipid Maps²⁴, Institut National de la Normes et technologie MS recherche²⁵, ReSpect des composés phytochimiques²⁶ou PNB²⁷.
2. Ces bases de données n’étant pas exhaustives, effectuer un examen de la documentation supplémentaire sur les espèces végétales caractérisés chimiquement au besoin.
3. Match des ions de fragmentation de la feuille de pulvériser MS/MS pour les bases de données ci-dessus lorsque MS/MS information n’est disponible, ou à la littérature. Vous pouvez également utiliser une interprétation manuelle des ions fragments MS/MS ou une fragmentation d’un étalon authentique réalisée par l’injection directe ou LC-MS/MS.

7. analyse de données

1. Convertir les fichiers raw de MS mzXML des fichiers avec l’outil msConvert de Proteowizard²⁸.
2. Utilisez le progiciel XCMS implémenté dans R pour le prélèvement de crête. Utiliser une injection directe procédé pour la pulvérisation foliaire MS analyse de traitement.
   Remarque : Les scripts bien annotées utilisés pour le traitement des données se trouvent à https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
3. Pour obtenir des mesures semiquantitative, représente la variabilité expérimentale, normaliser l’intensité de chaque métabolite de l’actuel total d’ion (TIC), comme la pulvérisation foliaire MS signal intensité peut varier, en partie en raison de légères variations dans le positionnement des la feuille dans la source et les différences dans la taille et la forme des feuilles.
4. Sinon, utiliser du fournisseur de logiciel pour l’analyse des données ou MZmine2 (pour être trouvé à http://mzmine.github.io/)²⁹.

Résultats

À 10 semaines qu'après la germination, fraîchement prélevés cultivés en serre S. tortuosum feuilles ont été analysés par pulvérisation foliaire MS. Le flux de travail expérimental pour la détection des métabolites de S. tortuosum laisse à l’aide de pulvérisation foliaire que MS est illustrée à la Figure 2. Une feuille a été sélectionnée, coupée en une bande mince avec un embout conique pour former un point et serrée ...

Discussion

L’utilisation réussie de ce protocole repose sur l’optimisation des différentes étapes pour les espèces végétales, type de tissu et cibles composés d’intérêt. Les paramètres décrits dans le protocole fournissent un bon point de départ. Les décisions expérimentales suivantes doivent être réalisés et mis à l’essai : si oui ou non à l’emploi (1) couper ou tissus non circoncis et solvant (2) ou pas de solvant, (3) quel solvant utiliser et dans quel volume, (4) ce qui la distance du tissu de l’...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conn Pin	Digi-Key elctronics	WM2563CT-ND	pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp	Digi-Key elctronics	314-1018-ND	CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp	Digi-Key elctronics	290-1951-ND	ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink	Digi-Key elctronics	Q2Z1-KIT-ND	to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software	Thermo scientific		Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software	Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum