Évaluation de l’Interface synaptique des cellules primaires humaines T du sang périphérique et le tissu lymphoïde

Résumé

Le protocole décrit une technique pour étudier la capacité des cellules T humaines primaires polyclonaux pour former des interfaces synaptiques utilisant des bicouches lipidiques planes. Nous utilisons cette technique pour montrer la capacité de formation de synapse différentielle des cellules T primaires humaines dérivées de ganglions lymphatiques et le sang périphérique.

Résumé

La compréhension actuelle de la dynamique et les caractéristiques structurales des interfaces synaptiques de lymphocytes a été en grande partie déterminés par l’utilisation de verre-prise en charge des bicouches planaires et in vitro-T-cellule dérivée des clones ou lignes^{1,2 ,3,4}. Comment ces conclusions s’appliquent aux primaire les cellules T humaines isolées du sang ou lymphoïdes tissus ne connaît pas, en partie en raison d’importantes difficultés à obtenir un nombre suffisant de cellules pour analyse⁵. Ici nous abordons cela grâce à l’élaboration d’une technique exploitant les diapositives des flux multicanaux pour construire des bicouches lipidiques planes contenant des molécules d’adhésion et d’activation. La faible hauteur des lames débit favorise la sédimentation cellulaire rapide afin de synchroniser l’attachement cellulaire : bicouche, permettant ainsi aux chercheurs d’étudier la dynamique de la formation de l’interface synaptique et la cinétique de la libération de granules. Nous appliquons cette approche pour analyser l’interface synaptique d’aussi peu que 10⁴ 10⁵ primaire cryoconservés T cellules isolées de ganglions lymphatiques (LN) et du sang périphérique (PB). Les résultats révèlent que la technique de bicouches lipidiques planes roman permet l’étude des propriétés biophysiques des cellules T humaines primaires dérivés de sang et les tissus dans le contexte de la santé et la maladie.

Introduction

Connaissances scientifiques sur les caractéristiques structurales des synapses immunitaires lymphocytes et leur lien avec l’activité fonctionnelle des cellules T ont été recueillies principalement de l’étude des lignées cellulaires et clones provenant de PB. À quel degré ces constatations se rapportent à des cellules primaires de T a obtenu de sang ou des tissus lymphoïdes humains ne sait pas, comme les interfaces synaptiques des cellules T qui résident dans les tissus lymphoïdes et autres n’ont pas été analysés jusqu'à présent. Ce qui est important, nouvelles données suggèrent que les tissus-résident et organes lymphoïdes-dérivés des cellules T peuvent avoir des différences significatives dans leur phénotype et leur activité fonctionnelle par rapport à celles du PB^6,7. Cela se solidifie davantage la nécessité de mieux comprendre les fonctionnalités de l’interface synaptique de lymphocytes dans les cellules T humaines primaires.

À cette fin, nous avons développé une approche nouvelle échelle mini exploitant des bicouches lipidiques incorporés dans les glissières des flux multicanal nous permettant d’effectuer l’imagerie des interfaces de T-cellule/bicouche avec moins de 10⁵ primaire T cellules isolées de PB humaine et LN. Cette nouvelle technique permet d’étudier les propriétés biophysiques de humain lymphocytes synaptiques interfaces primaires pour mieux modéliser et comprendre en vivo les interactions cellule-cellule.

Protocole

Cette étude a été réalisée conformément à la déclaration d’Helsinki. Consentement éclairé a été obtenu de tous les participants, et les échantillons de sang et les ganglions lymphatiques ont été acquises avec l’approbation de l’Institutional Review Board à l’Université de Pennsylvanie (CISR #809316, la CISR # 815056). Tous les sujets humains étaient des adultes. Les échantillons de sang de cordon ont été gracieusement fournis par le travail et l’accouchement de la département d’obstétrique et de gynécologie à l’Université Thomas Jefferson. Tous les échantillons sont dépersonnalisées.

1. isolement des CD4⁺ T des cellules pour une analyse de l’Image

1. Décongeler une portion de 1 mL contenant 10⁷ congelés les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ou de cellules mononucléées de ganglion lymphatique (LNMCs) des échantillons recueillis. Sous une hotte stérile, ajouter les cellules décongelées dans 9 mL de RPMI additionné de pénicilline/streptomycine et de la glutamine.
   1. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 300 x g à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI contenant 10 % SVF (milieu complet). Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C.
2. Le lendemain, purifier CD4⁺ T cellules en négatif immunomagnetic tri à l’aide d’un kit disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
3. Pour mesurer le nombre de CD4 fraîchement purifié⁺ T cellules, mélanger 5 µL de la suspension cellulaire avec un volume égal d’une solution de bleu de trypan. Charger un hémocytomètre avec un cellule-trypan mélange de bleu et de compter les cellules vivantes à l’intérieur les 5 sections de l’hémocytomètre.
4. Prenez la moyenne du nombre de cellules et de déterminer le nombre de cellules de la suspension cellulaire original : le nombre de cellules/1 mL = la numération moyenne x 2 x 10⁴. Si le nombre total de cellules isolées est trop petit, utilisez les cellules comme c’est sans compter.
5. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min et remettre en suspension dans un tampon (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na₂HPO₄, D-glucose, KCl, 1 mM MgCl₂à 5 mM à 5 mM, 2 mM CaCl₂et 1 % d’albumine sérique humaine) à 10^{5 < /C13 > cellules/50 µL ou moins et de garder les cellules à 4 ° C (pendant 1 à 2 h) jusqu’au moment de l’utiliser dans les expériences.}
6. Éliminer tous les déchets biologiques selon les directives institutionnelles pertinentes.
7. Si vous le souhaitez comme une population de cellules contrôle, préparer les cellules T CD8 activées provenant de sang ombilical PBMC, placer 10⁷ cellules dans 5 mL de milieu complet dans un flacon de culture T25 recouvert d’un mélange d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28 à 10 µg/mL et 1 µg/mL , respectivement.
8. Le lendemain, enlever les cellules de sang de cordon activés de la fiole, lavez-les 1 x avec frais moyen de compléter et étendre les cellules en présence de IL-2 recombinante (100 U/mL) pendant 2 semaines.
9. Purifier le sang du cordon ombilical CD8⁺ T cellules en négatif immunomagnetic tri à l’aide de la trousse disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant. Compter les cellules et d’échanger les médias pour le tampon comme décrit aux points 1.3 à 1.6 pour LN et CD8 PB⁺ T des cellules.

2. les composants pour préparer les bicouches lipidiques planes

1. Préparer 3 types de liposomes comme décrit ailleurs⁵: (a) 0. 4 mM DOPC (1, 2-dioléoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine) liposomes, liposomes DOPC (b) 0,4 mM contenant 33 mol% de chiens-NTA (1, 2-dioléoyl -sn- glycéro - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) acide iminodiacétique) succinyl] (sel d’ammonium)) lipides, (c) 0,4 mM DOPC liposomes contenant 4 mol % Biotinyl-Cap-PE (1, 2-dioléoyl -sn- glycéro-3-phosphoéthanolamine - N-(cap biotinyl) (sel de sodium)).
2. Préparer une solution 5 % caséine comme précédemment décrit⁵.
   1. Dissoudre 5 g de poudre de caséine dans 100 mL d’eau ultrapure et ajouter 350 µL d’hydroxyde de sodium 10 M. Tout mélanger sur un agitateur magnétique ordinaire à une vitesse lente selon l’échelle disponible, à température ambiante pendant 2 h et ensuite la nuit à 4 ° C. Ajuster le pH à 7.3 et ultracentrifugeuse la solution pendant 2 h à 100 000 x g à 4 ° C. Filtrer le liquide surnageant avec un filtre stérile de 0,22 µm et conserver la solution en aliquotes à-80 ° C.
      ATTENTION : la solution d’hydroxyde de Sodium peut provoquer des brûlures chimiques et peut provoquer la cécité permanente lors du contact avec les yeux. Utiliser des gants en caoutchouc, vêtements de sécurité et une protection oculaire lors de la manipulation de ce produit chimique ou ses solutions.
3. Anticorps anti-CD3 d’étiquette avec de la biotine pour produire des molécules d’anticorps mono-bionylated avec une approche décrite précédemment⁸.
   1. Préparer une solution de biotine-PEO4-NHS dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à 0,1 mg/mL. Ajouter 3,7 µL de la solution de biotine-PEO4-NHS à 1 mg d’anticorps dans 0,5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du bicarbonate de sodium de 100 mM.
   2. Incuber le mélange pendant 2 h à température ambiante. Préparer une solution d’ester d’Alexa Fluor 488 NHS à 10 mg/mL dans le DMSO. Ajouter la solution d’ester Alexa Fluor 488 NHS à l’anticorps marqué par biotine-PEO4-NHS à un excès molaire 10 fois.
   3. Incuber le mélange pendant 1 h à température ambiante sous agitation lente sur un agitateur magnétique ordinaire. Séparer le colorant non lié à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique.
   4. Déterminer la concentration en anticorps en mesurant la densité optique de la solution d’anticorps à 280 nm (un₂₈₀). Mesurer la densité optique des anticorps étiquetés à 577 nm (un₅₇₇).
   5. Déterminer le ratio de colorant-à-anticorps à l’aide de l’équation suivante :
      
      NOTE : Trouver des détails supplémentaires dans le protocole du fabricant.
4. Exprimer une protéine recombinante de ICAM-1 soluble dans un système d’expression de drosophile comme décrit plus haut^3,4,9,10.
   1. Clone, avec cDNA codant, l’ectodomaine de l’ICAM-1 dans l’expression de la drosophile vector pMT/V5-His avec un promoteur inductible métallothionéine pour produire une protéine recombinante ajoutée avec son étiquette de₆ sur l’extrémité C-terminale.
   2. Co transfecter cellules S2 avec le plasmide contenant résultant de ICAM-1 et un vecteur d’expression G418. Sélectionnez les transfectants stables en utilisant les médias de drosophile de Schneider additionnés de 10 % de sérum de veau foetal (FCS) et 0,5 mg/mL de G418 pendant 3 semaines. Développez les cellules dans un milieu sans sérum insecte et induire une expression de la protéine avec 0,5 mM CuSO₄ pendant 3 jours.
   3. Concentrer le surnageant de culture, 10 x et dialyser contre PBS via un concentrateur de flux tangentiel comme décrit précédemment¹¹.
   4. Appliquez le surnageant de culture concentré à une colonne contenant le Sépharose avec un anticorps monoclonal anti-ICAM-1 immobilisé par liaison covalente et éluer l’ICAM-1 lié avec un tampon de glycine de 50 mM, pH 3.0. Immédiatement neutraliser la protéine éluée d’ICAM-1 avec un tampon Tris de 2 M, pH 8,0.
   5. Dialyser le matériau éluée contre PBS, pH 8,0 et ajoutez les matières dialysée à une colonne contenant Ni-NTA agarose. Éluer soluble ICAM-1 avec imidazole de 200 mM, pH 8,0. Dialyser le matériau éluée contre un tampon PBS, pH 8,0.
   6. L’ICAM-1 purifiée avec ester Cy5 NHS selon les instructions du fabricant de l’étiquette.
      Remarque : Le meilleur ratio final de colorant-à-protéine est de 1:1.
5. Produire des Fab d’un anticorps anti-CD107a des fragments de digestion de la papaïne et de purifier la Fab fragments par chromatographie échangeuse d’ions comme décrit plus haut³. Étiquette de fragments de la Fab avec ester Alexa Fluor 568 NHS selon les instructions du fabricant.

3. formation des bicouches lipidiques planes soutenus par verre

1. Préparer une solution fraîche piranha acides en mélangeant 140 mL d’acide sulfurique concentré et 60 mL d’eau oxygénée 30 %. Lavez le couvre-objet en verre pour les diapositives de flux en les trempant dans la solution acide piranha pour 30 min. Maintenez la lamelle de verre avec une pince-ciseaux polypropylène.
   ATTENTION : Solution de Piranha est un oxydant très fort. N’oubliez pas de porter des lunettes de sécurité ou des lunettes ou un bouclier intégral ainsi que des gants en caoutchouc épais en tout temps lors de la manipulation de la solution. Ne fonctionne qu’avec la solution de piranha sous une hotte aspirante. Évitez de chauffage, du transport ou secouant à tout moment pendant l’utilisation, car il peut exploser. Collecter les déchets de piranha dans une bouteille en verre avec un trou contenant du plomb. Contacter la Commission institutionnelle de la sécurité sur l’utilisation appropriée des déchets.
2. Rincer les lamelles lavé 7 x avec de l’eau ultrapure par séquentiellement les transférer dans des béchers contenant de l’eau fraîche. Ensemble, les lamelles humides côté pour laisser le restant d’eau roulent sur le verre propre, abandonnant le verre sec.
   1. Sinon, utiliser un embout de la pipette joint à une pompe à vide pour retirer délicatement les gouttelettes d’eau restante de la lamelles couvre-objet.
3. Dans la hotte stérile, effectuer des dilutions de lipides divers pour produire le mélange de liposomes pour faire des bicouches. Tout d’abord, mélanger les 37 µL de liposomes DOPC et 3 µL de liposomes Biotinyl-Cap-PE. Ensuite, mélanger 14 µL de liposomes DOPC et 15 µL de liposomes de chiens-NTA. En troisième lieu, ajouter 1 µL du mélange premier à 29 µL du deuxième mélange pour fabriquer le mélange final liposome.
4. Dans la hotte stérile, mis en place un espace de travail avec lamelles sèche à proximité. Aliquote 2 µL du mélange final liposome (voir étape 3.3) précisément dans le centre d’une chaîne de glissière autocollante. Immédiatement et très précisément aligner un lamelle couvre-objet propre et sec avec le toboggan et abaissez doucement la lamelle sur le côté collant de la diapositive.
   1. Si vous préparez plusieurs diapositives, travailler sur une diapositive à la fois, car le mélange de liposome s’évapore rapidement. Retournez la lame et la bague extérieure des pinces-ciseaux polypropylène permet d’exercer une pression douce sur le contact périphérique de la lamelle avec la diapositive, en vous assurant que le bordereau est amarraient à la diapositive pour empêcher les fuites.
      Remarque : Ne pas presser contre les canaux de la diapositive pour éviter la rupture ou la fissuration de la lamelle couvre-objet.
   2. Retournez la diapositive à nouveau et marquer la position de la bicouche formée, qui ressemble à une chute entre la lamelle et la diapositive de canal, de dessin 4 points avec un marqueur permanent autour de la bicouche du côté de la lame externe de l’Assemblée.
5. Avant la première injection d’un liquide dans le canal, désigner un port du canal comme le port d’entrée et l’autre comme le port de sortie et maintenir cette désignation tout au long de l’expérience.
6. Pour éviter la formation de bulles, insérer l’extrémité de la pipette directement dans le port d’entrée du canal. Remplir lentement les canaux de la diapositive avec 50 µL de chaud (au moins la température ambiante) tampon (Voir l’étape 1.5 pour la composition du tampon).
7. Préparer une solution de chlorure de nickel (II) de 0,5 M. Décongeler une portion de 2 mL de solution de caséine dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 min et compléter avec une solution de chlorure de nickel à une concentration finale de 200 µM.
8. Laver les bicouches en première injection 100 µL de la solution de caséine dans le port d’entrée du chenal puis immédiatement supprimer 100 µL du port de sortie sur la diapositive de pipetage. Bloquer les bicouches avec la même solution en injectant 100 µL de la solution de la caséine dans le port d’entrée de chaque canal et en incubant la lame pendant 45 min à température ambiante.
9. Décongelez les aliquotes de protéines de₆ et streptavidine Cy5-ICAM-1-His. Combiner les protéines dans le tampon à la concentration finale de 2 µg/mL de chacun. Centrifuger la solution pendant 30 min à 20 000 x g et 4 ° C pour éliminer n’importe quel agrégat.
10. Retirer le reste de la solution de blocage de l’orifice de sortie du chenal de la diapositive en pipettant également. Injecter 100 µL de la solution contenant l’ICAM-1 et streptavidine dans le port d’entrée.
11. Incuber la lame pendant 45 min à température ambiante. Retirer tout excédent de la solution de protéines de l’orifice de sortie. Laver la bicouche 2 x en première injection 100 µL du tampon dans le port d’entrée du chenal puis immédiatement supprimer 100 µL de l’orifice de sortie.
12. Diluer un anticorps anti-CD3 Alexa Fluor-488-marqués avec le tampon à une concentration finale de 2 µg/mL. Injecter 100 µL de la solution d’anticorps dans le port d’entrée de la diapositive et il incuber pendant 45 min à température ambiante. Retirer tout excédent de la solution de protéines de l’orifice de sortie. Laver la bicouche 2 x 100 µl de la tampon comme au point 3.11.

4. imagerie de l’Interaction de cellules T avec la bicouche planaire

1. Préchauffez la scène et l’objectif d’un microscope à fluorescence (FRBR) réflexion interne totale ou confocale jusqu'à ce que la température est équilibrée à 37 ° C. Mettre en place la lame avec la bilayer(s) sur la platine chauffante. Déplacer la scène à une position appropriée selon les marques d’encre et de se concentrer sur la bicouche employant la fluorescence des molécules marquées Cy ICAM-1.
   1. Utiliser un objectif X 61 pour la microscopie confocale, ou un objectif X 100 pour le microscope TIRF, avec les paramètres de filtre approprié.
2. Pour granule imagerie au microscope TIRF, ajouter Alexa Fluor-568-marqué anti-CD107a des fragments Fab d’anticorps à la suspension de cellules à une concentration finale de 4 µg/mL avant d’injecter les cellules dans les ports d’entrée.
   1. Resuspendre le CD4 préparés⁺ T les cellules isolées de LN ou PB ou du cordon de sang et injecter 50 µL de la suspension cellulaire dans le port d’entrée du chenal de la diapositive contenant la bicouche.
3. Choisissez le nombre désiré de champs et d’enregistrer des images de chaque champ 1 x toutes les 2 min pendant 30 min après l’injection.
4. Exploiter des canaux lumineux et fluorescents lumineux-zone, réfléchies (Alexa 488 et Cy5) du microscope confocal pour acquérir les images. Utilisez le mode de la FRBR pour fluorescence Alexa-Fluor-488 et Alexa-Fluor-568 et widefield pour fluorescence Cy5, ainsi que l’imagerie lumineux-zone, le microscope TIRF.

5. image Analysis

1. Analyser les images acquises à l’aide de logiciels appropriés. Observer la morphologie cellulaire en images en lumière transmises et exclure en cluster et visiblement endommagé ou cellules apoptotiques de l’analyse. Inclure dans l’analyse uniquement les cellules qui interagissent de façon productive avec la surface de la bicouche (c.-à-d., les cellules accumulent Alexa-Fluor-488 fluorescence (anticorps anti-CD3) à l’interface).
2. Déterminer la taille de la zone d’adhérence cellulaire à 20 min après le début de l’interaction cellule-bicouche.
   Remarque : La zone d’adhérence est la zone sombre, développée à l’interface de cellule-bicouche sur les images de microscopie (IRM) de réflexion de brouillage.
3. Observer une accumulation de fluorescence Cy5-ICAM-1 et une formation de la jonction de l’anneau par des molécules de Cy-ICAM-1 réservés à l’interface de la cellule-bicouche. Si accumulé ICAM-1 molécules formées une jonction adhérence au moins deux images consécutives, désigner ces cellules comme les cellules développant un périphérique supramoléculaire de cluster (pSMAC) Activation¹².
4. Évaluer la libération des granules en mesurant l’intensité de fluorescence Alexa-Fluor-568 à l’interface de lymphocytes T-bicouche sur la fluorescence de fond à l’extérieur de la zone de contact à proximité de la cellule. Désigner les cellules avec un ratio de Alexa-Fluor-568 signal-à-fond d’au moins 1,3 degranulating cellules.

Résultats

Tout d’abord, nous avons comparé la structure de l’interface synaptique formé par CD8 activés de dérivés du sang-cordon⁺ T des cellules exposées à des bicouches lipidiques construit soit en écoulement à grande échelle traditionnel systèmes de cellules (voir la Table des matières pour plus de détails)^{1 ,2,3,4} ou dans ...

Discussion

Cette nouvelle technique décrite ici utilise des réactifs similaires nécessaires pour construire des bicouches planaires dans le débit conventionnel cellule⁵ et peut être appliquée avec succès pour effectuer l’imagerie du primaire des lymphocytes T humains – bicouche interfaces^{3,4 ,},¹⁵. La technique offre une réduction significative de l’utilisation de molécules fluorescentes et nécessite...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD4 T cell isolation kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
DOGS NTA	Avanti Polar Lipids	790528C
Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	870273C
Human Serum Albumin	Octapharma USA	NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608
Coverslips for sticky-Slides	ibidi	10812
Bioptech FCS2 Chamber	Bioptech	060319-2-03
anti-CD3 antibody	Thermo Fisher Scientific	16-0037-81	OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody	Genetex	GTX14664	9.3 clone
Casein	Sigma	C5890
Biotin-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	21329
DMSO	Sigma	D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification	Thermo Fisher Scientific	A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification	Thermo Fisher Scientific	A10238
Amersham Cy5 NHS Ester	GE Life Science	PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection	ATCC	37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B	Sigma-Aldrich	C9142	Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems	Pall Laboratory	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30210
Dialysis tubing	Spectra/Por	131384
Papain from papaya latex	Sigma	P3125
mouse anti-human antibody against CD107a	BD Bioscences	555798	Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves	Fisher Scientific	19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
Streptavidin	ProZyme	SA10
Confocal microscope	Nikon		Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope	Andor		Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software	Molecular devices