Dérivation et différenciation des canines ovarienne des cellules souches mésenchymateuses

Résumé

Ici, on décrit une méthode pour l’isolation, l’expansion et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien canin.

Résumé

Intérêt pour les cellules souches mésenchymateuses (CSM) a augmenté ces dix dernières années en raison de leur facilité d’isolement, l’expansion et la culture. Récemment, des études ont démontré la capacité de différenciation large que ces cellules possèdent. L’ovaire représente un candidat prometteur pour les thérapies à base de cellules due au fait que c’est riche en MSCs et qu’elle est fréquemment ignorée après chirurgies ovariectomie comme un déchet biologique. Cet article décrit les procédures pour l’isolement, l’expansion, et différenciation des MSCs dérivée de l’ovaire canine, sans la nécessité du tri des cellules techniques. Ce protocole représente un outil important pour la médecine régénérative en raison de la large applicabilité de ces cellules fortement différentiables dans les essais cliniques et applications thérapeutiques.

Introduction

Le nombre d’études publiées qui mettant l’accent sur les cellules souches a considérablement augmenté ces dix dernières années, un effort de recherche qui a été alimenté par l’objectif commun de découverte des thérapies de médecine régénérative puissant. Les cellules souches ont deux marqueurs définissant primaires : auto - rénovation et la différenciation. Cellules souches mésenchymateuses sont responsables de chiffre d’affaires de tissu ordinaire et ont une capacité plus restreinte de la différenciation par rapport aux cellules souches embryonnaires¹. Récemment, plusieurs études ont montré une large gamme de différenciation de MSCs, et un sujet en discussion est de savoir si il existe des différences entre les cellules souches embryonnaires et adultes à tous les².

L’épithélium de surface ovarium est une couche non validée de cellules, relativement moins différenciée, qui exprime les deux marqueurs épithéliaux et mésenchymateux³, conservant la capacité de se différencier en différents types de cellules en réponse à signaux environnementaux⁴. L’emplacement exact des cellules souches dans l’ovaire n’est pas connue ; Toutefois, il a été proposé que bipotential progéniteurs dans l’albuginée donnent naissance à des cellules germinales⁵. Les études immunologiques ont émis l’hypothèse que ces cellules ont une origine stromales⁶ ou sont situés dans ou proximale à la surface de l’ovaire⁷. Étant donné que les cellules souches mésenchymateuses exprimant des récepteurs nombreuses qui jouent un rôle important dans la cellule adhérence⁸, une expérience a été conçue pour tester l’hypothèse selon laquelle la sélection d’une population de cellules avec adhérence rapide isolerait clairement une population de cellules caractérisable comme mésenchymateuses dans la nature. Récemment, notre groupe a signalé la dérivation de MSCs de tissu ovarien basée sur leur capacité d’adhérence à la surface en plastique de la boîte de Petri pendant les 3 premières heures de la culture, afin d’obtenir une population purifiée de cellules présentant une adhérence rapide⁹. Nous décrivons ici la méthode développée pour l’isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien.

Protocole

Cette expérience a été réalisée avec les ovaires de quatre chiennes bâtards donnés après interventions chirurgicales non urgentes à un programme de stérilisation canine. Cette expérience a été approuvée par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux de UNESP-FCAV (protocole n° 026991/13).

1. préparation expérimentale

1. Préparer ou acheter 500 mL tampon phosphate salin de stérile Dulbecco (SPD) sans calcium ou de magnésium.
2. Préparer une collagénase j’ai solution mère en mélangeant 40 µg de l’enzyme dans 1 mL de SPD. Filtrer à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm et stocker des parties aliquotes de 2 mL à-20 ° C.
3. Préparer les milieux de culture de moyen (DMEM) faible concentration de glucose de l’aigle modifié de Dulbecco avec sérum de foetus de 10 % et 1 % des antibiotiques.
4. Recueillir le matériel stérile : ciseaux et pinces, un flacon de culture tissulaire, plats, tubes et pipettes de 10 mL et 5 mL.
5. Utiliser les équipements de laboratoire de culture cellulaire standard : une hotte de sécurité biologique (BSC), un incubateur de culture cellulaire fixé à 5 % de CO₂ et 38 ° C et à une centrifugeuse.
6. Nettoyer le BSC : avec des mains gantées, stériliser avec 70 % EtOH, à l’aide de lampes UV.

2. isolement des cellules souches mésenchymateuses de l’ovaire

1. Après l’opération, garder les ovaires dans du PBS sur la glace dans un tube à fond conique, jusqu'à leur arrivée au laboratoire.
2. Remplir deux boîtes de pétri 100 mm avec 10 mL de PBS.
3. Retirer les ovaires du tube et de les transférer à la première boîte de pétri avec du PBS. Lavez-les avec mélange de mouvements.
4. Doucement récupérer l’ovaire et placez-le dans un autre plat. Avec des ciseaux et des pinces stériles, émincer le tissu en très petits morceaux, environ 1 mm de taille.
5. Transfert du tissu ovarien à un 35 mm boîte de Pétri et ajouter 2 mL de collagénase. Émincer le tissu un peu plus.
6. Placez la boîte de pétri dans l’incubateur à 38 ° C pendant 3 h et secouez légèrement le plat de pétri avec des mouvements circulaires toutes les 20 min.
7. Après 3 h, sortir la boîte de pétri de l’incubateur.
8. Transférer le contenu de la capsule dans un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de médias de l’expansion.
9. Retourner doucement le tube avant la centrifugation. Centrifuger le tube à 2100 x g pendant 7 min. retirer le surnageant et resuspendre le culot avec 3 mL de médias de l’expansion.
10. Transférer le culot dans une bouteille de T25. Placez la bouteille dans l’incubateur avec 5 % CO₂ à 38 ° C pendant 3 h.
    Remarque : La partie la plus importante de la procédure est de changer les médias après 3 h d’incubation.
11. Enlever la bouteille de l’incubateur et les médias avec le tissu restant. Ajouter 3 mL de médias expansion fraîche dans la bouteille.
12. Modifier les médias toutes les 48 h et observer la bouteille pour confluence cellulaire.
    NOTE : Les principales étapes de la procédure peuvent être observées dans la Figure 1.

3. l’expansion des cellules souches mésenchymateuses de l’ovaire

1. Passage de la cellule
   1. Lorsque les cellules atteignent la confluence, retirez le support de la bouteille.
   2. Laver la bouteille avec 3 mL de PBS. Retirez le PBS.
   3. Ajouter 1,5 mL de trypsine et mettre la bouteille dans l’incubateur à 38 ° C pendant 3 min. tapoter doucement le flacon pour aider les cellules à se détacher.
      Remarque : Les cellules devraient atteindre confluence environ 5 - 7 d après les ensemencements initiaux.
   4. Ajouter 3 mL des médias de l’expansion et transférer le contenu dans un tube à fond conique.
   5. Centrifuger le tube à 2100 x g pendant 7 min. retirer le surnageant et ajouter 1 mL de médias de l’expansion.
   6. Doucement, homogénéiser le contenu du tube.
   7. Prélever une partie aliquote de 10 µL de l’échantillon pour effectuer la cellule de comptage et de remettre le tube avec les cellules dans l’incubateur.
   8. Placer 10 µL du mélange dans l’hémocytomètre.
2. Comptage des cellules
   1. Utiliser l’objectif du microscope 10 X et se concentrer sur les lignes de la grille de l’hémocytomètre.
   2. Compter les cellules dans cinq petits carrés (Figure 2).
   3. Multipliez le nombre compté par 50 000 pour estimer le nombre de cellules par millilitre.

4. différenciation des cellules souches mésenchymateuses de l’ovaire

Remarque : La différenciation des analyses ont été effectuées conformément aux lignes directrices établies en Hill et al. ⁹.

1. Semences 1,0 x 10⁴ cellules par puits, en trois exemplaires, à l’aide d’une boîte de Petri de 4 puits.
2. Ajouter 1 mL de médias de l’expansion.
3. Agiter délicatement le plat avec des mouvements circulaires.
4. Après 24h, remplacez les milieux de culture par les médias de différenciation souhaitable.
5. Pour ostéogénique, adipocytaire et différenciation chondrogéniques, incuber les cellules avec les médias d’induction pendant 30 jours, avec remplacement de médias chaque 3 kits de différenciation spécifique d. ont été utilisées pour chacun de ces tests.
6. Pour la différenciation de la lignée neurogène, incuber les cellules pendant 10 jours dans les médias de l’induction, avec remplacement de médias tous les 3 jours. Les milieux utilisés ici contenaient DMEM faible concentration de glucose, acide valproïque 2 mM, 1 hydrocortisone µM, 10 µM forskoline, chlorure de potassium de 5 mM, 5 µg/mL d’insuline et 200µm butylhydroxyanisol.
7. Pour les précurseurs de l’endoderme, incuber pendant 5 jours dans les médias selon les instructions du fabricant réactif endoderme.
8. Pour la différenciation de cellules germinales primordiales de lignage, incuber les cellules dans les médias d’induction pendant 14 jours, avec remplacement de médias tous les 3 jours. Les milieux utilisés ici contenant DMEM, 10 % FBS, pyruvate de sodium 1 mM, 10 ng/mL FRV, acides aminés non essentiels de 1 mM, 2 mM de L-glutamine, 5 µg/mL d’insuline, du β-mercaptoéthanol 0,1 mM, 60 putrescine µM, 20 transferrine µg/mL, 10 ng/mL souris facteur épidermique de croissance, 1 ng/mL homme facteur de croissance basique des fibroblastes, 40 ng/mL homme glial cell facteur neurotrophique dérivé et la pénicilline de 15 mg/L.

Résultats

Isolement de cellules souches mésenchymateuses par ovaire Canine :

La technique d’isolation MSC ovarienne est résumée dans la Figure 1. Après chirurgie, tissu hacher, digestion de collagénase et un changement de support 3 h après le début de la culture, une population de MSC putative avec propriétés de plastique adhésif rapides a été avec succès isol...

Discussion

Ci-après nous fournir la preuve que MSCs peuvent être isolés du tissu ovarien canin, qui est considéré comme un déchet biologique après une ovariectomie. Dû au fait que plusieurs types de cellules se trouvent dans l’ovaire, nous avons proposé un protocole pour sélectionner MSCs basés sur leur adhésion rapide au plastique, qui a sélectionné les cellules qui s’est développée en une monocouche avec une morphologie des fibroblastes.

Le premier rapport de la dérivation de MSCs ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Thermo Fisher	14190144
Collagenase I	Thermo Fisher	17100017
Tissue flask	Corning	CLS3056
DMEM low glucose	Thermo Fisher	11054020
FBS	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	StemCell	5110
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-Tubulin	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F