Extraction de la caféine, l’activité enzymatique et l’Expression génique de caféine Synthase de Suspensions de cellules végétales

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie efficace pour l’extraction et le dosage de la caféine dans des suspensions cellulaires de c. arabica L. et un processus d’expérimentation pour l’évaluation de l’activité enzymatique de synthase de caféine avec le niveau d’expression de le gène codant pour cette enzyme.

Résumé

Caféine (1,3,7-trimethylxanthine) est un alcaloïde de la purine présent dans les boissons populaires tels que le café et le thé. Ce métabolite secondaire est considéré comme un moyen de défense chimique, car il a une activité antimicrobienne et est considéré comme un insecticide naturel. Caféine peut également produire des effets allélopathiques négatifs qui empêchent la croissance des plantes environnantes. En outre, les gens partout dans le monde consomment caféine pour ses effets analgésiques et stimulants. En raison de l’intérêt pour les applications technologiques de la caféine, recherches sur la voie de biosynthèse de ce composé a augmenté. Ces études ont principalement porté sur la compréhension des mécanismes biochimiques et moléculaires qui régulent la biosynthèse de la caféine. Culture de tissus in vitro est devenu un système utile pour l’étude de cette voie de biosynthèse. Cet article décrit un protocole étape par étape pour la quantification de la caféine et de mesure des niveaux de transcription du gène (CCS1) codant synthase (CS) de la caféine dans des suspensions de cellules de c. arabica L. en plus de son activité.

Introduction

La caféine est un métabolite secondaire qui est biosynthétisée à partir de plantes du genre Coffea¹. Cet alcaloïde appartient à la famille des méthylxanthines et est considéré comme une défense de l’usine de produits chimiques car il peut agir contre les effets néfastes des pathogènes et des herbivores,^2,3. En outre, ce métabolite est responsable des propriétés stimulantes de la boisson de café, qui est couramment consommée dans le monde entier^4,,⁵. En raison de ses propriétés, sont intéressés par plusieurs groupes de recherche étudie la voie de biosynthèse et de catabolisme de caféine^6,7. Actuellement, des cultures de plantes in vitro cellules/tissus servent d’alternative pour évaluer l’accumulation de la caféine sous diverses stratégies biotiques et abiotiques^8,9.

Biosynthèse de caféine implique la libération hydrolytique des 7-méthylxanthine de nucléoside ribose correspondante suivie d’ordonnée N-méthylations aux positions 3 et 1. Une spécifique S- adénosyl méthionine (SAM)-charge N-méthyltransférase (NMT) catalyse la méthylation en position 7, tandis que théobromine synthase (TS) et CS sont impliqués dans la 3 - et 1-méthylations, respectivement, produisant la théobromine et caféine. L’étude des gènes codant pour les territoires non métropolitains distincts a permis de comprendre le mécanisme qui régule la production de caféine^10,11. CS, qui possède l’activité N -méthyltransférase, catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse de la caféine,¹¹. Chez les plantules de caféier, il a été démontré que le rayonnement lumineux peut augmenter l’activité CS, qui se traduit par une augmentation dans la biosynthèse de la caféine. Récemment, nous avons montré que l’entretien des suspensions cellulaires de c. arabica L. sous irradiation lumineuse est la condition optimale pour évaluer les effets que produisent des facteurs de stress abiotique ayant une incidence sur la voie de biosynthèse de caféine⁸. Les renseignements obtenus dans ces études pourraient avoir des applications en biologie de systèmes et génie métabolique pour maximiser l’étude de la biosynthèse de la caféine dans de tels systèmes in vitro .

Étant donné les avantages d’obtenir un modèle approprié pour l’étude de la biosynthèse de la caféine, nous avons optimisé les conditions d’extraction de la caféine sur des suspensions cellulaires c. arabica L. Il était également possible d’élaborer un protocole utile pour l’étude de l’activité enzymatique, mais aussi les étapes méthodologiques permettant d’évaluer le niveau de transcription des gènes de Coffea caféine synthase 1 (CCS1) codant pour cette enzyme. Ici, nous présentons un protocole pour extraire et quantifier la caféine dans les suspensions de cellules de c. arabica par chromatographie sur couche mince et densitométrie (TLC-densitométrie).

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Protocole

1. caféine Extraction dans des Suspensions cellulaires c. arabica L.

1. Utiliser c. arabica cellule suspensions⁹. Maintenir les suspensions de sous-cultures toutes les deux semaines dans le milieu de Murashige et Skoog à pH 4,3 avec constant 100 tr/min secouant à 25 ° C sous une lumière continue (8,3 W/m²).
2. Récolter les cellules sous la filtration sous vide à l’aide de papier-filtre pore de 11 µm et d’un entonnoir de Buchner.
3. Enregistrer le poids frais des cellules recueillies à l’aide d’une échelle, enveloppez-les dans du papier d’aluminium, congelez-les dans l’azote liquide et gardez-les à-80 ° C jusqu'à l’analyse.
4. Lyophiliser le matériel cellulaire congelé pendant 72 h.
5. S’inscrire à la masse des cellules lyophilisées afin d’estimer le rendement en poids sec.
6. Stocker les matériaux en poudre dans des sacs de polyéthylène réutilisables (9 cm x 7,5 cm). Faire macérer le matériau à une poudre fine et un magasin dans un dessicateur jusqu'à utilisation.
7. Mesurer 0,5 g de matière sèche de cellulaire sur la balance analytique et l’ajouter à une fiole de verre (25 mL).
   1. Ajouter 10 mL d’acétone aux cellules lyophilisées et mélanger dans un vortex pour 30 s pour l’homogénéisation. Puis, scellez la fiole avec du papier aluminium.
   2. Mélanger à 100 tr/min à l’aide d’un agitateur à température ambiante (25 ° C) pendant 5 h.
8. Transférer tout le matériel dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min. transférer le liquide de phase dans un nouveau tube et ramènent à elle séchage à température ambiante dans la hotte.
9. Remettre en suspension l’échantillon avec 25 µL d’acétone.

2. conditions pour l’évaluation de la caféine par la mince couche de chromatographie (TLC)-densitométrie

1. Appliquer 1 µL de l’extrait de caféine préalablement remises en suspension à la phase stationnaire.
   Remarque : les plaques de gel de silice (F254) sont utilisés comme la phase stationnaire. Avant d’appliquer les échantillons, les plaques ont été développés avec 10 mL de chloroforme-méthanol [9:1 v/v] dans une chambre de chromatographie (14 x 12 cm x 9,5 cm), et les plaques ont été séchés à température ambiante. Les caractéristiques de la plaque chromatographique où les échantillons sont appliquées sont indiquées à la Figure 1. La chambre était saturée pendant 30 min avec du solvant avant d’élaborer la plaque. Plaques de CCM doivent manipuler avec des gants pour éviter la contamination.
2. Développer le TLC dans la chambre de chromatographie avec 10 mL de la phase mobile cyclohexane-acétone [40:50 v/v].
   Remarque : Ce mélange permet la séparation de la caféine à un facteur de rétention (Rf) de 0,34.
   1. Retirez la plaque TLC de la chambre et laisser sécher à température ambiante.
3. Visualiser les bandes de caféine dans l’ultraviolet de courte longueur d’onde (UV, 254 nm). Utiliser une lampe UV compacte. En outre, pour cette étape, utilisation des lunettes avec protection UV.
4. Quantifier les niveaux de caféine par densitométrie à 273 nm. L’instrument est muni d’un logiciel de chromatographie.

3. l’acide ribonucléique (ARN) Isolation

1. Prendre les suspensions cellulaires à l’étape 1.1 et vide filtrat avec filtre en papier (taille des pores 11 µm).
2. Rassemble le matériel cellulaire du papier filtre, peser 0,5 g du matériel cellulaire sur une balance analytique et l’emballer dans du papier d’aluminium. Congeler l’échantillon liquide N₂.
3. Broyer l’échantillon cellulaire dans un mortier en porcelaine avec de l’azote liquide et ajouter 1 mL de réactif d’isolement ARN jusqu'à homogénéisé.
   Remarque : Stériliser les mortiers de porcelaine dans un four à moufle à 300 ° C pour 6 h. RNA isolation réactif contient phénol, l’isothiocyanate de guanidine et autres composants.
   1. Transférer 500 µL de l’échantillon dans un tube stérile microcentrifuge (1,5 mL). Ajouter 300 µL de chloroforme-isoamylique alcool (24:1) et 300 μl du mélange phénol (pH 8,0).
4. Mélanger l’échantillon avec un vortex et centrifuger à 20 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
5. Transférer 300 μL de la phase supérieure dans un tube de microcentrifuge. Ajouter 200 μL d’isopropanol. Incuber le tube pendant 1 h à-20 ° C.
6. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et décanter ensuite la phase liquide.
   1. Ajouter 1 mL d’éthanol (70 %) pour former une boulette dans le tube. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min et décanter. Répéter cette étape deux fois.
7. Sécher l’échantillon pendant 1,5 h à température ambiante (25 ° C). Remettre en suspension l’extrait de RNA avec 25 μL de diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-l’eau traitée.
   Remarque : Pour l’extraction de l’ARN, utiliser l’eau traitée DEPC 0,1 % v/v.

4. incubation de transcription de l’ARN avec désoxyribonucléase (DNase)

1. Dans un tube de microcentrifuge stérile, ajouter l’extrait de 2 µg d’ARN total. Ajouter 1 μL de tampon de réaction 10 x (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂). Ajouter 1 μL de 1 U/µL DNase.
   1. Apporter la réaction pour un volume final de 10 μL, avec l’eau traitée DEPC. Mélanger l’échantillon et centrifuger brièvement à 2 000 x g pendant 1 min.
2. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min.
3. Arrêter la réaction avec l’ajout de 1 μL de 50 mM disodique dihydraté de tétrasodium (Na₂EDTA) et incuber l’échantillon à 65 ° C pendant 10 min.
4. Analyser l’intégrité de l’ARN par électrophorèse sur gel d’agarose.
   1. Préparer un gel d’agarose à 1 % standard et souiller avec 1 µL de 3 x intercalant solution tache acide nucléique.
   2. Appliquer 500 ng d’ARN de l’agarose gel et exécutez le gel.
   3. Visualiser l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un système de documentation de photo de gel.
   4. Utiliser RNA comme modèle pour la synthèse de cDNA de la transcriptase inverse.

5. complémentaire (ADNc) synthèse d’acide désoxyribonucléique

1. Ajouter 2,5 μg d’ARN total dans un tube de microcentrifuge. Ajouter 1 μL de primer oligo-deoxythymine (dT) et remplissez le tube pour un volume final de 13 μL d’eau exempte de nucléase. Mélanger l’échantillon et puis centrifuger un 2 000 x g pendant 1 min.
2. Incuber les échantillons à 65 ° C pendant 5 min, puis à 4 ° C pendant 2 min.
3. Ajouter 4 μL de 5 x tampon de réaction pour la transcriptase inverse, 2 μl du mélange de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs) (10 mM de chaque dNTP) et 1 μL de la transcriptase inverse (200 U/µL). Mélanger doucement et centrifuger à 2 000 g pendant 1 min.
4. Incuber les échantillons à 45 ° C pendant 50 min, puis à 70 ° C pendant 10 min.
5. Quantifier la cDNA concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV.
6. Utiliser l’ADNc comme modèle pour la réaction en chaîne par polymérase (PCR).
   Remarque : Le tampon de réaction a été utilisé comme 10 x (étape 4.1.1) et 5 x fois concentrée (étape 5.3), respectivement.

6. Real-time PCR Quantitative (qPCR) pour amplifier le gène CCS1

1. Ajouter 7,5 μL de Taq DNA polymérase 2 x (0,1 U/mL) et 0,1 μM de 5-carboxy-X-rhodamine (ROX) dans un tube de microtubes PCR.
   Remarque : Le démarrage à chaud Taq DNA polymérase 2 x a été utilisé comme une solution 2 x concentré.
   1. Ajouter 5 μl d’eau exempte de nucléase.
   2. Ajouter 0.75 μL de 10 μM et inverses l’apprêt pour amplifier le gène CCS1 (AB086414) (vers l’avant : 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' et vers l’arrière : 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Utiliser les amorces de tubuline que le gène de ménager dans une réaction séparée (vers l’avant : 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' et vers l’arrière : 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. Ajouter 600 ng de matrice d’ADNc.
2. Effectuer la réaction d’amplification à 50 ° C pour 2 min et 95 ° C pendant 5 min. Incuber dans le système PCR en temps réel la réaction 40 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s.
3. Incuber les échantillons à 50 ° C pour 30 s à 20 ° C pendant 10 s.
4. Analyser les données avec le logiciel PCR.
5. Calculer l’expression relative de la 2-^ΔΔCT méthode décrite par Livak et Schmittgen (2001)¹².
   Remarque : Analyser une réaction du contrôle qui contient tous les composants sauf la matrice d’ADN (aucun contrôle de modèle, NTC) aux rejets contaminés réactifs ou amplification amorce-dimères.

7. total extrait de protéines de Suspensions cellulaires c. arabica L.

1. Filtre des suspensions cellulaires sous vide avec un filtre en papier moyen-pore.
2. Peser 1 g de matière cellulaire et l’emballer dans du papier d’aluminium.
   1. Congeler l’échantillon avec de l’azote liquide. Broyer l’échantillon dans un mortier de porcelaine stérilisé pour obtenir une poudre fine.
3. Transférer l’échantillon dans un flacon en verre et ajouter 2,5 mL de tampon d’extraction (400 mM tris (hydroxyméthyl) aminométhane chlorhydrate (Tris-HCl), à pH 8,0, contenant 10 mM β-mercaptoéthanol, 5 mM Na₂EDTA et ascorbate de sodium 0,5 % (p/v).
   1. Mélanger l’échantillon dans un Vortex pendant 2 min.
      Remarque : Il est important que l’échantillon est conservé sur la glace pour éviter la dénaturation de la protéine.
4. Centrifuger l’échantillon à 20 000 x g pendant 20 min à 4 ° C et transférer 500 µL d’extraits dans des flacons cryogéniques (2 mL). Conserver les échantillons à-72 ° C jusqu'à l’utilisation.
5. Mesurer la concentration de protéines de l’échantillon à 562 nm dans un spectrophotomètre à l’aide de dosage acide bicinchoninic avec l’albumine sérique bovine comme la norme.

8. Test enzymatique pour le Synthase de caféine

1. Préparer un mélange réactionnel dans un tube de microcentrifuge contenant 200 µM SAM, 4,07 kBq de méthyle [³H]-SAM, 200 théobromine µM, 200 µM MgCl₂et caféine 5 µM. Augmentez le volume à 200 µL avec 100 mM Tris-HCl à un pH de 8,0.
2. Maintenir le tube de microcentrifuge sur la glace et ajouter un volume de la fraction soluble contenant 7-9 mg de protéine. Ensuite, mélanger en vortex et incuber 30 min à 30 ° C dans un bain thermostatique/circulateur. Pour un lot de plusieurs échantillons, incuber chaque échantillon en double dans les périodes de 1 min pour donner assez de temps pour arrêter les réactions de tous les échantillons dans un laps de temps exact de 30 min.
   1. Ajouter 1 mL de chloroforme pour arrêter la réaction et puis agiter l’échantillon avec un vortex. Agiter l’échantillon à l’aide d’un Vortex pendant 3 min pour éliminer la caféine radioactif dans le solvant.
3. Centrifuger les échantillons à 11 000 x g pendant 5 min et soigneusement restaurer un volume de 900 µL. Ensuite, transférer les échantillons pour les flacons scintillation.
4. Évaporer le chloroforme jusqu'à siccité dans le capot à la température ambiante de 25 ° C. Ajouter 5 mL de scintillation liquide dans le flacon et mélanger l’échantillon.
5. Analyser la radioactivité incorporée dans la caféine dans un compteur à scintillation.

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Résultats

Les extraits de caféine obtenus via le processus présenté ici ont été analysés par TLC-densitométrie en soumettant les échantillons pour la plaque de chromatographie selon le schéma illustré à la Figure 1. Pour quantifier les niveaux de caféine dans les extraits de cellules, une courbe avec différentes concentrations de norme commerciale pour ce composé a été utilisé (Figure 2 a). Le modèle de l’absorbance pou...

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Discussion

Nous présentons ici les conditions optimales permettant d’évaluer la contenu de caféine, niveaux d’activité et de transcription CS dans in vitro plant tissue culture, tels que des suspensions de cellules de c. arabica. Précédents rapports ont confirmé que les cellules maintien sous irradiation lumineuse et en présence de théobromine dans le milieu de culture sont les paramètres appropriés pour augmenter le niveau de caféine, ce qui permet d’évaluer les méthodes de séparation de caf?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210