Une approche In Vitro à la thérapie photodynamique

Résumé

La thérapie photodynamique (PDT) est un acte médical qui consiste à l’incubation d’un photosensibilisateur exogène appliquée (PS) suivie de photoactivation de lumière visible pour induire l’apoptose. Nous présentons un protocole en vitro PDT conçu pour simuler des PDT qui peut-être être utilisé pour étudier les différences en incubation de PS et paramètres de traitement par la lumière.

Résumé

La thérapie photodynamique (PDT) est un acte médical qui implique d’incubation d’un photosensibilisateur exogène appliquée (PS) suivie de visible photoactivation léger pour induire l’apoptose des cellules. La Federal Drug Administration a approuvé la PDT pour le traitement de la kératose actinique et lignes directrices cliniques recommandent PDT comme traitement de certains cancers cutanés non mélanocytaires et l’acné vulgaire. PDT est une modalité thérapeutique avantageuse car il est bon marché, non invasif et associé à des effets secondaires minimes et effrayer. Dans la première étape de PDT, un PS est appliqué et s’accumule dans les cellules. Irradiation lumineuse subséquente induit la formation d’espèces réactives de l’oxygène, qui pourrait déboucher sur l’apoptose des cellules, rupture de la membrane, lésions mitochondriales, modulation du système immunitaire, la prolifération des kératinocytes et chiffre d’affaires de collagène. Ici, nous présentons une méthode in vitro pour étude PDT dans une lignée de cellules adhérentes. Ce protocole de traitement est conçue pour simuler les PDT et peut être ajusté à l’étude de l’utilisation de PDT avec diverses lignées cellulaires, photosensibilisants, températures d’incubation ou longueurs d’onde de photoactivation. Carcinome épidermoïde cellules ont été incubées avec 0, 0,5, 1,0 et 2 mM l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA) pendant 30 min et photoactivées à 417 nm bleu pour 1 000 s. Le critère d’évaluation principal était l’apoptose et nécrose, telle que mesurée par cytométrie annexine-V et 7-Aminoactinomycine D. Il y avait une augmentation dose-dépendante de l’apoptose des cellules après trente minutes d’incubation de 5-ALA. Pour atteindre la grande validité inter-test, il est important de maintenir cohérente incubation et paramètres de lumière lors de l’exécution des expériences in vitro PDT. PDT est qu'une recherche clinique utile de la procédure et in vitro peut permettre le développement de nouveaux PSs, optimisation de protocoles et de nouvelles indications de PDT.

Introduction

La thérapie photodynamique (PDT) est un acte médical qui implique d’incubation d’un photosensibilisateur exogène appliquée (PS) suivie de visible photoactivation léger pour induire l’apoptose des cellules. La Federal Drug Administration (FDA) a approuvé la PDT pour le traitement de la kératose actinique (Ka) et lignes directrices cliniques recommandent PDT comme traitement de certains cancers cutanés non mélanocytaires et vulgaris d’acné,^1,2. Nouvelles utilisations non dermatologiques pour PDT incluent le traitement des cancers gastro-intestinaux, la prostate et gynécologiques³. PDT est une modalité thérapeutique avantageuse car elle est associée à des événements indésirables minimes et cicatrisation², non invasif et faible coût.

Dans la première étape de PDT, un PS est appliqué et s’accumule dans les cellules². Aux États-Unis, l’acide 5-aminolévulinique topique (5-ALA) est couramment pour traiter l’AKs. Pendant l’incubation phase, 5-ALA est convertie en protoporphyrine IX (PP-IX) par l’intermédiaire de la voie de biosynthèse heme dans des cellules constituées de³. Cancer et les cellules ont diminué l’activité de ferrochélatase, qui convertit la protoporphyrine IX (PP-IX), le produit final, hème. Ainsi, les cellules de cancers s’accumulent PP-IX par rapport aux cellules normales^4,5. Cette accumulation de PP-IX dans le cancer et les cellules de précancer par rapport aux tissus environnants permet PDT une approche ciblée avec des effets secondaires minimes. Irradiation lumineuse conduit à la génération de (ROS) les espèces réactives de l’oxygène lorsque l’oxygène accepte des électrons excités de PP-IX. PP-IX a une absorption de pic dans le spectre ultraviolet avec des petits pics dans tout le spectre de lumière visible, y compris la lumière bleue et rouge². Formation de ROS pourrait déboucher sur l’apoptose des cellules, rupture de la membrane, dommages mitochondrial, modulation du système immunitaire, la prolifération des kératinocytes et collagène chiffre d’affaires de^{6,7,8,9 , 10}.

PDT a été développé dans les années 1970 et est une évolution de la modalité thérapeutique³. Le protocole approuvé par la FDA pour le traitement de l’AKs recommande 5-ALA peau une incubation de 14 à 18 h, mais les incubations de 1 à 2 h sont couramment utilisées en pratique clinique². In vitro, nous avons montré que des incubations plus courtes de 5-ALA 15 min augmente l’apoptose des cellules fibroblastes par rapport aux fibroblastes non traitée^11,12. En outre, roman chlorine, phtalocyanine et PSs à base de nanoparticules sont étudiées afin d’améliorer l’efficacité de PDT³. Ici, nous présentons une méthode in vitro pour étude PDT dans un carcinome épidermoïde adhérent cellules. Dans ce protocole, CSC-13 les cellules sont incubées avec 0, 0,5, 1,0 et 2 mM 5-ALA pendant 30 min et photoactivées à 417 nm bleu pour 1 000 s. Le critère d’évaluation principal est l’apoptose et nécrose, telle que mesurée par cytométrie annexine-V et 7-Aminoactinomycine D (7-AAD). Ce protocole de traitement est conçue pour simuler les PDT et peut être ajusté à l’étude de l’utilisation de PDT avec d’autres lignées cellulaires, photosensibilisants, températures d’incubation ou longueurs d’onde de photoactivation. Préparation des groupes témoins supplémentaires peut-être être nécessaire, y compris sans tache, seul un fluorophore tachée, contrôles négatifs et positifs pour la cytométrie en flux. Un examen approfondi de la théorie, des protocoles, conception expérimentale et blocage pour cytométrie en apoptose/nécrose peut être trouvé ailleurs¹³.

Protocole

1. préparation des cellules

1. Plaque 20 000 cellules dans 2 mL de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque de 6 puits utilisant une technique stérile dans une armoire de sécurité biologique.
2. Placer les plaques 6 puits dans un incubateur humidifié (37 ° C, 5 % de CO₂) pendant 24 heures afin de permettre aux cellules d’adhérer aux plaques.

2. préparation des photosensibilisants pour le traitement des cellules

1. Préparer des solutions 5-ALA 0,5, 1 et 2 mM en milieu de culture. Si le sérum fœtal (SVF) est un ingrédient de milieu de culture, préparer et traiter des cellules avec le 5-ALA en solution de milieu de culture avec 0,1 % FBS pour des incubations. ^{11 , 12} dans ce cas, CSC-13 cellules n’exigent pas des BF, donc 5-ALA a été ajouté directement au milieu sans sérum des kératinocytes, additionné de l’extrait pituitaire bovine et facteur de croissance épidermique.
2. Aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec au moins 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Aspirer les PBS et ajouter 2 mL de solutions 5-ALA 0, 0,5, 1 ou 2 mM dans les puits ou plaques séparées.
4. Incuber les cellules avec 0, 0,5, 1 ou 2 mM 5-ALA sur un bloc pour 30 min. de chauffage de 36 à 37 ° C protègent les cellules de l’exposition à la lumière durant l’incubation à l’aide de papier d’aluminium.
5. Aspirer les solutions de 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA et laver les cellules avec 2 mL de PBS.
6. Aspirer les PBS et ajouter 2 mL de milieu de culture pour l’irradiation de lumière bleue.

3. blue Light photothérapie

1. Avant d’irradier les cellules, activer le dispositif de lumière bleu (p. ex., diode électroluminescente, fluorescente ou halogène) et faites fonctionner pendant un cycle (1 000 s) pour réchauffer l’appareil. Le dispositif de lumière bleu devrait avoir une longueur d’onde de sortie de 417 +/-5 nm. Permettant à l’appareil de fonctionner pendant un cycle avant les traitements s’assure que la longueur d’onde de lumière bleue et le rayonnement sont cohérentes au cours de la phase de photoactivation.
2. Un photomètre permet de mesurer le rayonnement à la surface cellulaire. L’irradiance lumineuse bleue à la surface cellulaire devrait être de 10 mW/cm². La distance entre la lumière et les cellules peut devoir être ajustée pour obtenir un éclairement énergétique de 10 mW/cm² selon l’intensité de la source lumineuse.
3. Placer les groupes de traitement ALA 0, 0,5, 1 et 2 mM sur une surface noire sous la source de lumière bleue. Irradier les cellules avec la lumière bleue pour 1 000 s (16 min et 40 s) pour une fluence totale de 10 J/cm². Suite de photoactivation de lumière bleue, les cellules sont prêts pour l’analyse.

4. collecte et coloration

1. Préparer le tampon du flux conformément aux directives de fabricant (voir Table des matières).
2. Aspirez le milieu de culture et laver les cellules avec 2 mL de PBS.
3. Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA et permettre aux cellules de se détacher pendant environ 3 à 5 min. Les cellules peuvent être examinés au microscope afin de confirmer le détachement cellulaire.
4. Ajouter 1 mL de milieu de culture (ou PBS) avec 10 % sérum de veau fœtal pour désactiver la trypsine.
5. Recueillir suspension cellulaire dans des tubes de flux marqués 5 mL.
6. Essorage tube de mesure de 5 mL dans une centrifugeuse à 201 x g pendant 5 min. aspirer solution sans enlever le culot cellulaire.
7. Ajouter 200 µL de tampon de flux avec l’anticorps conjugué d’annexine-V (1 µL d’annexine-v par 39 µL de tampon de flux) pour chaque échantillon.
8. Remettre en suspension les cellules et les placer dans l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO₂) pendant 20 min pour autoriser la liaison annexine-V.
9. Ajouter 3 µL de 7-AAD dans chaque échantillon. Incuber 5 min à température ambiante.

5. cytométrie

1. Suivez les instructions de fabricant de cytomètre en flux pour la mise en place (voir Table des matières).
2. Recueillir et analyser des échantillons par cytométrie en flux. ¹³
3. Effectuer une comparaison statistique de traitement et les groupes de contrôle à l’aide de l’analyse de variance (ANOVA)¹⁴. Comparer les moyens des groupes de traitement à la moyenne du contrôle avec test de Dunnett, une analyse post hoc .

Résultats

Après CSC-13 cellules ont été incubées pendant 30 min avec 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA et irradiés avec 1 000 s de bleu clair, il y avait une augmentation dose-dépendante de l’apoptose cellulaire. Total apoptose (moyenne ± écart de moyenne) est de 3,94 ± 0,34, 7.90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 et 38,33 ± 1,81 après 30 min d’incubation avec 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA, respectivement et 1000 secondes du bleu clair (Figure 1). Nous avons comparé le pourcentage moyen d’apoptose cellulaire entre 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA couvés groupes utilisant l’analyse de la variance. Les cellules traitées avec 1 et 2 mM 5-ALA a eu une augmentation significative dans l’apoptose des cellules par rapport à 0 mM 5-ALA les cellules traitées. Figure 2 a montre flux représentatif par cytométrie en flux Gate de dispersion vers l’avant (FSC) par rapport à la diffusion latérale (SSC) pour CSC-13 cellules incubées en présence de 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA. Le blocage du cercle entoure la population de cellules CSC-13. Pour cette expérience, 7500 événements ont été collectés et la porte de la population cellulaire CSC-13 capturé au moins 90 % des événements. Figure 2 b montre un terrain représentatif de la 7-AAD sur l’axe x et l’annexine-V sur l’axe y. Les populations de cellules sont bloquées en quatre quadrants (Q1 à Q4) pour distinguer les cellules apoptotiques. Q1 (haute annexine-v, faible 7-AAD) représente des cellules en apoptose précoce. Q2 (haute annexine-v, haut 7-AAD) représentent des cellules subissant une fin apoptose ou nécrose. T3 (faible annexine-v, haut 7-AAD) représente des cellules subissant une nécrose. Représente (faible annexine-v, faible 7-AAD) Q4 cellules subissant pas l’apoptose ou nécrose. Pour calculer le pourcentage de cellules en apoptose, nous avons ajouté le pourcentage de cellules en Q1 et Q2. Manque d’uniformité dans la longueur de la période d’incubation de 5-ALA, la température d’incubation ou dose d’irradiation de photoactivation peut-être altérer l’efficacité PDT. La figure 3 montre une parcelle de cytométrie de flux d’écoulement annexine-V et 7-AAD représentante lorsque la température d’incubation est variée (c.-à-d., 27, 36 ou 42 ° C). Il y avait une augmentation dépendant de la température dans l’apoptose.

Figure 1 : augmentation de la Dose-dépendante l’apoptose après trente minutes d’incubation de 5-ALA 5-ALA incubés à 36 ° C pendant trente minutes suivis par 1 000 s de lumière bleue dans les cellules de la CSC-13. Barres représentent le pourcentage moyens annexine-V cellules positives dans chaque traitement et le groupe témoin. Des expériences ont été effectuées en trois exemplaires, technique. Signification statistique a été déterminée par analyse de la variance, avec p < 0,05 précédé d’un astérisque (*). Barres d’erreur représentent la moyenne ± erreur-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : parcelles représentant Flow Cytometry. (A) représentant avant vs côté scatter cytometry diagrammes en unités arbitraires (UA) pour x - axes et y pour 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA incubé les cellules. Pour cette expérience, 7500 événements ont été collectés et la porte de la population cellulaire CSC-13 capturé 90 % des événements. (B) représentant annexine-V vs 7-AAD cytométrie parcelles en pour - et axe x y 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA cellules couvés. Q1 : les cellules apoptotiques précoces, Q2 : fin cellules apoptotic/nécrotiques, Q3 : cellules nécrotiques et Q4 : cellules viables. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : incubation 5-ALA à différentes températures peut-être altérer l’efficacité PDT. Cytométrie en flux représentatif annexine-V vs 7-AAD parcelles pour les axes x et y - pour CSC-13 cellules incubées avec 0,5 mM 5-ALA à 27, 36 et 42 ° C. Q1 : les cellules apoptotiques précoces, Q2 : fin cellules apoptotic/nécrotiques, Q3 : cellules nécrotiques et Q4 : cellules viables. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il y avait une augmentation significative de la CSC-13 l’apoptose après incubation de 30 min de 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA suivie par 1 000 s de lumière bleue. Ces résultats sont en accord avec nos recherches déjà publiées démontrant que le 5-ALA incubations de 30 min, suivie d’une activation lumineuse bleue conduit à une augmentation dose-dépendante du pourcentage de cellules de fibroblaste subissant l’apoptose^{12, 14}.

Cette approche expérimentale pour étudier PDT a les avantages et les limites. Les méthodes décrites sont conformes à la pratique clinique comme un PS commercialement disponible et source de lumière ont été utilisés. Les chercheurs peuvent personnaliser les méthodes avec différents types de cellules, PSs, sources lumineuses et paramètres de l’irradiation. Cependant, il y a des limites de cette approche que ce protocole est conçu pour les cellules adhérentes cultivées dans une monocouche. Dans la pratique clinique, des différences dans la pathologie d’architecture ou de la maladie de tissu (c.-à-d., une hyperkératose ou fibrose) peuvent diminuer l’absorption de PS ou¹⁵de la pénétration de la lumière. Ainsi, les doses de traitement et les résultats expérimentaux ne peuvent pas correspondre directement à la pratique clinique. Modèles de tumeur sphéroïde et puce microfluidique ont été étudiés comme des méthodes pour mieux reproduire tumeur microenvironnements^16,17,18. Sphéroïdes ont des niches cellulaires internes et externes qui peuvent différentiellement incorporent les photosensibilisants et représentent la tumeur hétérogène architecture. D’autres chercheurs ont utilisé des puces microfluidiques pour écran traitement et de livraison vasculaire des photosensibilisants. Cependant, puces microfluidiques peuvent être coûteux pour développer ou difficile à mettre en œuvre pour les chercheurs peu familiers avec la technique. En outre, les sphéroïdes et puces microfluidiques peuvent ne pas refléter le traitement clinique des cancers de la peau dans laquelle photosensibilisants sont directement appliquées à la surface de la tumeur sans diffusion vasculaire. Les chercheurs peuvent doivent évaluer les avantages et les inconvénients de culture monocouche, modèles de tumeur sphéroïde et de puces microfluidiques pour étudier PDT dans des systèmes différents de la maladie. Comme il n’y a pas de cellules immunitaires ou matrice extracellulaire, il n’est pas possible de déterminer comment la PDT affecte les interactions cellule-cellule complexe. Les chercheurs peuvent doivent confirmer in vitro les résultats expérimentaux à l’aide de modèles animaux et des essais cliniques. Pour atteindre la grande validité inter-test, il est important de maintenir cohérente incubation et paramètres de lumière lors de l’exécution des expériences in vitro PDT.

Température est connue pour altérer l’efficacité du PDT¹⁹. Une étude a démontré que la mort cellulaire, absorption de 5-ALA, PP-IX formation et cytokines peuvent être améliorées en incubant les cellules avec le 5-ALA à des températures jusqu'à à 44 ° C¹⁹. Températures d’incubation supérieure à 44 ° C peuvent conduire à la mort cellulaire induite thermique et températures d’incubation inférieure à 20 ° C peuvent entraîner non significative 5-ALA absorption et l’accumulation de¹⁹. Il est recommandé que les chercheurs effectuent des incubations PS sur un bloc de chauffage réglable en température à une température constante au contrôle de confusion potentiellement les effets thermiques. En outre, il est important à incuber le photosensibilisateur pendant une durée suffisante pour permettre la conversion des 5-ALA en PP-IX. Dans ce protocole, CSC-13 cellules ont été incubées avec le 5-ALA pendant 30 min, qui avec succès induit l’apoptose des cellules. Nous avons démontré précédemment qu’une incubation de 10 min de 5-ALA n’augmente pas sensiblement l’apoptose des fibroblastes par rapport au témoin non traité fibroblastes^11,14. PP-IX commence à s’accumuler dans la peau de souris après que 5-ALA est en incubation pendant six minutes à 37 ° C. C’est pourquoi, après dix minutes d’incubation 5-ALA, il peut-être pas une accumulation suffisante de PP-IX pour induire l’apoptose de cellules²⁰. Nous recommandons une période d’incubation minimale de 20 à 30 min pour 5-ALA basé sur nos précédentes études^11,14. Les chercheurs peuvent doivent optimiser la période d’incubation, basée sur le laboratoire, photosensibilisateur d’intérêt, type de cellules et indication clinique. Expériences de titrage et d’optimisation des anticorps peuvent être effectués pour de meilleurs résultats en utilisant les directives du fabricant. Autres tests d’intérêt peuvent être réalisés après photoactivation de lumière bleue dont dihydroethidium quantification de cytométrie en flux de ROS. ¹⁴

Variation de quantité de lumière livré par unité de surface (p. ex., rayonnement solaire) et la dose d’irradiation totale (c'est-à-dire, fluence) pendant la phase de photoactivation susceptibles d’affecter la formation de ROS et de l’apoptose cellulaire²¹. La relation entre la fluence, éclairement et le temps peut être décrit par l’équation suivante :

Fluence (J/cm²) = éclairement énergétique (W/cm²) x temps (s)

Car fluence dépend de l’heure, allongeant ou en raccourcissant les phases de photoactivation peut modifier l’efficacité du traitement. L’irradiance est proportionnel à la distance au carré entre la source lumineuse et le tissu cible. Ainsi, si la lumière est trop loin, il peut-être pas suffisamment d’énergie lumineuse envoyée vers les tissus ciblés pour exciter le PS. Subsidiairement, l’éclairement énergétique peut être augmentée par la lumière se reflétant sur les surfaces environnantes. Par conséquent, nous recommandons de procéder irradiations légers avec les plaques de culture cellulaire placés sur une surface noire pour empêcher la réflexion de la lumière. Les chercheurs peuvent acquérir commercialement disponibles ou approuvés par la FDA bleus diodes électroluminescentes et appareils fluorescents à utiliser dans les expériences de PDT, mais ces dispositifs peuvent avoir des puissances différentes et une uniformité du champ lumineux. Un photomètre de longueur d’onde spécifique devrait servir à mesurer l’éclairement énergétique à la surface des cellules et l’uniformité du champ lumineux avant chaque expérience pour des résultats uniformes. Un diffuseur disponible dans le commerce peut servir à améliorer l’uniformité du champ, si nécessaire.

En résumé, nous avons décrit une approche in vitro d’enquêter sur les PDT en détaillant la théorie, méthodes expérimentales, limites, pièges potentiels et des recommandations pour l’optimisation. PDT est qu'une recherche clinique utile de la procédure et in vitro peut permettre le développement de nouveaux PSs, optimisation de protocoles et de nouvelles indications de PDT.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte serum free medium	Thermofisher	17005042	Culture medium for SSC-13 cells
DMEM low glucose glutamax	Thermofisher	10567022	Possible culture medium for other cell types
6-well culture plates	Thermofisher	720083
PBS	Thermofisher	14190250
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25200056
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermofisher	15250061	For cell counting and plating
BLU-U light	DUSA	Request from manufacturer	Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used
5-ALA	DUSA	Request from manufacturer
FBS	Atlanta Biologicals	C17032
FlowCellect Annexin Red Kit	Millipore Sigma	FCCH100108	Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer
FACSCanto II	BD	Request from manufacturer	Any flow cytometer may be used
Counting Chamber	Hausser	3120	For cell counting and plating
FlowJo	FlowJo	Request from manufacturer	Flow cytometry analysis software