Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

Résumé

Nous décrivons ici les protocoles de validation chimique et génétique de c-Fos et Dusp1 comme cible de drogue dans la leucémie à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo de génétique et humanisé. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.

Résumé

La démonstration des inhibiteurs de tyrosine kinase (utilisation) dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) a annoncé une nouvelle ère dans la thérapeutique anticancéreuse. Cependant, une petite population de cellules ne répond pas au traitement TKI, entraînant la maladie résiduelle minime (MRD) ; même les plus puissants inhibiteurs fail pour éradiquer ces cellules. Ces cellules MRD servent de réservoir à développer une résistance au traitement. Pourquoi le traitement TKI est inefficace contre les cellules MRD ne connaît pas. Signalisation du facteur de croissance est impliquée dans le soutien à la survie des cellules MRD durant le traitement TKI, mais une interprétation mécaniste fait défaut. Des études récentes ont démontré qu’un élevé de c-Fos et d’expression Dusp1 par suite convergente oncogène et facteur de croissance de signalisation dans les cellules MRD médient résistance TKI. L’inhibition génétique et chimique de c-Fos et Dusp1 rend CML extraordinairement sensible aux inhibiteurs et durcit CML dans les deux modèles de souris génétiques et humanisé. Nous avons identifié ces gènes cibles à l’aide de puces multiples des cellules résistantes et - TKI sensibles. Ici, nous fournissent des méthodes pour la validation de cibles à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo. Ces méthodes peuvent facilement être appliquées à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.

Introduction

L’activité kinase tyrosine constitutive des oncogènes de fusion BCR-ABL1 provoque CML, qui fournit une justification pour cibler l’activité kinasique de petites molécules inhibitrices. Le succès de l’utilisation dans le traitement des patients atteints de LMC a révolutionné le concept de thérapie ciblée^1,2. Par la suite, la thérapie Anti-kinase comme médicament de précision a été développée pour plusieurs autres tumeurs malignes, y compris les tumeurs solides. Jusqu'à présent, plus de trente inhibiteurs de kinase ont été approuvés par la FDA des État Unis pour le traitement de diverses tumeurs malignes. Alors que le traitement TKI est très efficace pour supprimer la maladie, il n’est pas curatif. En outre, une petite population de cellules cancéreuses persiste pendant le traitement : le MRD^3,4,5. Même les patients qui ont montré la rémission complète sont retrouvent avec MRD, qui finalement réprimées les résultats en rechute, sinon en permanence. Par conséquent, l’élimination des cellules MRD est nécessaire pour atteindre une réponse durable ou curative. LMC représente un paradigme précieux pour définir le concept de la médecine de précision, les mécanismes de l’oncogenèse, rationnelle axée sur les cibles thérapeutiques, progression de la maladie et la résistance aux médicaments. Cependant, aujourd'hui encore, le mécanisme de mort cellulaire induite par TKI au volant dans les cellules cancéreuses n’est pas entièrement compris, ni pourquoi les cellules MRD (composées de cellules souches leucémiques [CDL]) sont intrinsèquement résistants à cette^4,6. Néanmoins, le phénomène de la « dépendance oncogène » à mutant kinase oncoprotéine est impliqué dans efficacité TKI où l’inhibition aiguë de l’oncogène ciblé par cette provoque un choc oncogène qui entraîne une réponse massive proapoptotique ou quiescence dans la cellule manière contextuelle^6,7,8,9. Toutefois, le fondement mécaniste de la dépendance de l’oncogène est absent. Des études récentes ont mis en cause que la signalisation du facteur de croissance abroge la dépendance de l’oncogène et par conséquent confère une résistance aux TKI thérapie^10,11,12. Par conséquent, pour mieux comprendre le mécanisme de la dépendance de l’oncogène, nous avons effectué profilage de l’expression du génome entier de BCR-ABL1 accro et des cellules nonaddicted (cultivées présentant des facteurs de croissance), qui a révélé que le c-Fos et Dusp1 sont des médiateurs critiques de oncogène addiction¹³. La délétion génétique de c-Fos et Dusp1 est cellules létales permettant d’exprimer par le BCR-ABL1 synthétiques et les souris utilisées pour l’expérience n’a pas développé une leucémie. De plus, l’inhibition de c-Fos et DUSP1 de petites molécules inhibitrices guéri induite par la BCR-ABL1 LMC chez la souris. Les résultats montrent que les niveaux d’expression de c-Fos et Dusp1 définissent le seuil de l’apoptose dans les cellules cancéreuses, tels que des niveaux inférieurs confèrent sensibilité aux médicaments, alors que des niveaux plus élevés causent la résistance à la thérapie de¹³.

Pour identifier les gènes de la dépendance de l’oncogène de conduite, nous avons effectué plusieurs profilage des expériences en présence de facteur de croissance et d’un TKI (imatinib) à l’aide de la souris - et cellules d’origine patient LMC (K562) de l’expression du génome entier. Ces données ont été analysées en parallèle aux ensembles de données patients LMC, obtenu à partir de CD34⁺ des cellules souches hématopoïétiques avant et après traitement par l’imatinib. Cette analyse a révélé trois gènes (un facteur de transcription [c-Fos], la double spécificité phosphatase 1 [Dusp1] et une protéine de liaison à l’ARN [Zfp36]) qui sont couramment positivement en cellules TKI-résistantes. Pour valider l’importance de ces gènes conférant une résistance aux médicaments, nous avons effectué des analyses in vitro et in vivo étape par étape. Les niveaux d’expression de ces gènes ont été confirmés par qPCR en temps réel (RT-qPCR) et western blot dans les cellules résistantes aux médicaments. En outre, la surexpression de cDNA et knockdown de Sharn barettes de c-Fos, Dusp1, et Zfp36 a révélé qu’élevés de c-Fos et Dusp1 des expressions sont suffisantes et nécessaires pour conférer résistance TKI. Par conséquent, nous avons effectué une validation in vivo à l’aide de modèles murins avec c-Fos et Dusp1 seulement. Pour la validation génétique de c-Fos et Dusp1, nous avons créé inductibles par ROSACreERT de souris (conditionnel knockout) c-Fos^{fl/fl 14} et les croisées avec Dusp1^{- / -} (droite knockout)¹⁵ à faire ROSACreERT2-c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} souris double-transgéniques. Les cellules de moelle osseuse c-Kit⁺ (de c-Fos^fl/fl-, Dusp1^{- / -}- et c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) exprimant BCR-ABL1 étaient analysées in vitro dans un test d’unité (CFU) formatrices et en Vivo par greffe de moelle osseuse chez des souris mortellement irradiés, pour tester la condition c-Fos et Dusp1 seul ou ensemble dans le développement de la leucémie. De même, les inhibitions chimiques de c-Fos par DFC (difluoré curcumine)¹⁶ et Dusp1 par BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one),¹⁷ ont été testés in vitro et in vivo par BCR-ABL1-exprimant, OS cellules de moelle osseuse c-Kit⁺ par la type sauvage (WT) de souris. Pour confirmer l’obligation de c-Fos et Dusp1 dans les cellules souches leucémiques, nous avons utilisé un modèle de souris de LMC où BCR-ABL1 a été spécifiquement induits dans ses cellules souches par doxycycline (Tet-transactivateur se déclare dans les cellules souches murines leucémie (SCL) gène 3' enhancer règlement)^18,19. Nous avons utilisé la moelle osseuse Lin^–c-Kit de Sca⁺⁺ (LSK) les cellules de ces souris lors d’un essai in vivo de transplantation. En outre, nous avons établi les niveaux phopsho-p38 et l’expression d’IL-6 comme biomarqueurs pharmaco-dynamique pour Dusp1 et inhibition de c-Fos, respectivement, in vivo. Enfin, d’élargir l’étude humaine pertinence, dérivé de patient CD34⁺ cellules (équivalent pour les cellules de c-Kit⁺ de souris) ont été soumis à long terme essais in vitro qui lance la culture cellulaire (LTCIC) et un modèle de souris humanisée in vivo des CML^20,21. Les souris immunodéficientes ont été transplantées avec LMC CD34 + cellules, suivies du traitement de la toxicomanie et l’analyse de la survie des cellules leucémiques humaines.

Dans ce projet, nous développons des méthodes d’identification des cibles et des validations à l’aide d’outils génétiques et chimiques, à l’aide de différents modèles précliniques. Ces méthodes peuvent être appliquées avec succès afin de valider les autres objectifs de développement chimiques modalités de développement thérapeutique.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC). Les prélèvements humains (BM normale et celle de LMC (p210-BCR-ABL +) leucémie) ont été obtenues par le biais de protocoles approuvés Institutional Review Board (Institutional Review Board : Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children Hospital Medical Center) et consentement des donateurs informés de CCHMC et de l’Université de Cincinnati.

1. en temps réel qPCR analyse

1. Isoler l’ARN total de BaF3 cellules qui croissent en milieu RPMI additionné de milieu de culture WEHI passé FBS et 10 % 10 % comme source de l’interleukine-3 (IL-3).
2. Récolter les cellules en phase logarithmique (99 % de vie) des traités (IL-3 et imatinib) ainsi que des échantillons non traités et les centrifuger à 435 x g pendant 3 min. La santé et les stades de croissance des cellules sont cruciaux car leurs profils d’expression génique peuvent changer de façon spectaculaire.
3. Isoler l’ARN par purification total RNA²². Quantifier l’ARN total ; Ensuite, assujettir à la DNase traitement²³. Convertir des quantités égales d’ARN sans ADN (2 µg) d’ADNc avec²⁴de la transcriptase inverse.
4. Effectuer y avec les amorces de gène-spécifique (tableau 1). Effectuer PCRs dans 20 réactions µL à 0,2 mL, à parois minces PCR tubes avec bouchons optiques, à l’aide d’une polymérase 1 x mélangent (voir Table des matières), 0,5 µM de chaque amorce, 1 µL d’ADN et de l’eau. Placer la réaction dans le thermocycleur avec le cycle suivant : étape 1, 95 ° C pendant 10 min ; L’étape 2, 95 ° C pendant 15 s ; Étape 3 à 60 ° C pendant 1 minute ; Étape 4, répétez les étapes 2 et 3 40 fois. Effectuer toutes les RFT en géométrie et normaliser les données en temps réel à l’expression de la β-actine avant traçage.

2. Western Blot

Remarque : Extraits de cellules entières ont été préparés en ajoutant 250 µL de 1 x tampon de lyse, comme décrit dans Kesarwani Al¹³ additionné d’un inhibiteur de la protéase cocktail et phosphatases 2 cocktail.

1. Récolte des cellules BaF3 5 millions à phase logarithmique (99 % de vie) de traités (IL-3 et imatinib) ainsi que de BaF3 non traitées des cellules par centrifugation à 435 x g pendant 3 min à 4 ° C. Lyse des cellules dans le tampon de lyse (250 µL) de pipetage et descendre 1 x, suivie d’une incubation de 5 min à 80 ° C. Laisser agir le lysat de briser tous les ADN avec des impulsions de 5 et 6 de 5 s chacun dans une chambre froide à 4 ° C.
2. Transférer le lysat dans un tube de 1,5 mL et il centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min enlever toute matière insoluble. L’extrait peut être conservé à-80 ° C jusqu'à utilisation. Échantillons de chaleur à 80 ° C pendant 5 min dans un bloc chauffant avant le chargement. Charger de 10 µL de l’échantillon à l’aide d’une pointe de gel-chargement sur gel SDS-PAGE 10 %.
3. Résoudre les protéines à 150 V jusqu'à ce que la teinture de référence atteint le fond du gel. La protéine de transfert à des membranes de nitrocellulose par un transfert électrophorétique à 1 ampère pendant 1 h. Après le transfert, bloquer les membranes en 1 x tampon Tris salin + 0,1 % Tween 20 (TBST) avec du lait écrémé 5 % pour 1 h et la sonde pendant la nuit à 4 ° C avec les anticorps appropriés à une dilution de 1 : 1 000.
4. Laver les membranes 3 x à 5 x avec un mélange TBST pendant 10 min chacun ; Ensuite, la sonde avec un HRP conjugué approprié anticorps secondaire (1:5, 000 dilution) à température ambiante pendant 1 h. La quantité d’un mélange TBST utilisé dépend de la taille du conteneur. Veillez à plonger la membrane dans un mélange TBST complètement. Laver l’anticorps secondaire 3 x de 5 min chacun, avec un mélange TBST.
5. Développer la tache à l’aide du réactif chimioluminescent substrat. Mélanger des quantités égales de substrat et le tampon des deux bouteilles, juste avant utilisation. Ajoutez le substrat en haut de la membrane pour couvrir l’ensemble membrane avec une pipette 1 mL et incuber pendant 1 min. Les taches doivent être photographiés au sein de 1 à 10 min de l’ajout du substrat.
6. Avec une pincette émoussé, placer soigneusement la membrane sur la plate-forme du système d’imagerie (voir Table des matières), en évitant une grande partie du liquide. Sélectionnez un mode live view et choisissez les taches et chemiluminiscence dans le menu. À l’aide d’acquisition manuelle, acquérir des expositions multiples à différents moments. Ces fichiers peuvent être visualisées et quantifiées à l’aide de logiciels d’imagerie.

3. génération des souris Knockout

1. Croix de souris de c-Fos^fl/fl ROSACreERT2 souris pour générer de souris^fl/fl ROSACreERT2c-Fos¹³. Pour créer les chez des souris double-knockout (KO), nichent souris^fl/fl ROSACreERT2c-Fos avec Dusp1^{- / -} souris pour générer ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} souris¹³. Génotype les souris par clips queue suivi d’ACP, tel que décrit ci-dessous.
2. Génotypage :
   1. Pour préparer l’ADN, clip une infime partie de la queue avec des ciseaux et mettez-la dans un tube de 1,5 mL. Cautériser la queue avec des ciseaux chauffants. Ajouter 200 µL de 50 mM NaOH à la queue coupée dans le tube et laisser incuber à 95 ° C dans un bloc chauffant pendant 1 h.
   2. Vortex le tube bien et, ensuite, neutraliser par ajouter 50 µL de 1 M Tris-HCl pH 6,8 et vortex à nouveau. Centrifuger le tube à vitesse maximale pendant 1 minute.
   3. Effectuer PCRs dans 20 µL des réactions dans 0,2 mL, tubes PCR à paroi mince en utilisant 1 x Taq polymérase maître mélange contenant le colorant, 0,5 µM de chaque amorce, 1 µL d’ADN et de l’eau. Placer les tubes dans le thermocycleur et exécuter les cycles appropriés comme indiqué dans le tableau 2.
   4. Exécuter le produit PCR sur gel d’agarose à 2 % et de l’image à l’aide d’un système de documentation de gel.

4. isolement de c-Kit⁺ cellules de moelle osseuse

1. Sacrifier les souris selon les lignes directrices.
   Remarque : Ici, les souris ont été exposées au dioxyde de carbone (CO₂) à une fonction à l’AVMA recommandé débit jusqu'à ce que la mort a été déterminée par l’arrêt de la respiration et le rythme cardiaque, suivie de la dislocation cervicale.
2. Récolter lesOS de la souris — deux fémurs, deux tibias, deux iliaques. Nettoyer tous les tissus des os en raclant avec un scalpel. Mettre les os dans du PBS 1 x contre le rhume sur la glace — 5 mL dans un tube de 15 mL. Versez le contenu du tube dans un mortier et écraser avec un pilon.
3. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube 50 mL à bouchon à vis avec une pipette de 10 mL, attachée, à l’aide d’une pipette. Laver le mortier et pilon plusieurs fois avec du PBS 1 x contre le rhume, collecte et en ajoutant la suspension cellulaire dans le tube de 50 mL. Tourner vers le bas de la moelle osseuse à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant via un vide avec une pipette de verre connectés. Suspendre le culot cellulaire dans 5 mL de solution de 1 PBS x avec une pipette.
4. Avec une pipette, ajouter lentement suspendu la moelle osseuse vers le haut de 5 mL de la température ambiante (la température est critique) polysucrose, prenant bien soin à ne pas déranger l’interface. Essorage à 400 x g à température ambiante pendant 20 min avec le frein mis hors tension.
5. Recueillir l’interface nuageux total de cellules mono-nucléaire (TMNC) avec une pipette et mettez-la dans un nouveau tube de 15 mL. Compléter le volume jusqu'à 10 mL avec du PBS 1 x pour le lavage, prenant 20 µL de comptage et tourner à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. jeter le surnageant et sauver le culot sur la glace pour l’étape 4.6.1.
6. Effectuer le c-Kit⁺ cellule d’isolement.
   1. Suivre un protocole faisant de kit pour le c-Kit⁺ cellule d’isolement. Resuspendre le culot dans 80 µL de PBS 1 x + EDTA + BSA à 10⁷ cellules. Pour obtenir la suspension cellulaire, ajouter 20 µL de cellules total de⁷ CD117 microbilles/10. Mélanger bien au vortex et incuber pendant 10 min à 4 ° C. Compléter le volume à 10 mL en ajoutant 1 x PBS + EDTA + BSA et un essorage à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min.
   2. Retirez le surnageant via un vide et suspendre le culot cellulaire dans 500 µL/10⁸ cellules total de PBS 1 x + EDTA + BSA. Utilisation du support de l’aimant avec la colonne magnétique attachée, ajouter 3 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA et laisser s’écouler par gravité dans un tube de prélèvement de 15 mL.
   3. Une fois la première addition de tampon terminée passant par la colonne, ajouter la suspension cellulaire à la colonne, ce qui lui permet de circuler à travers par gravité dans le tube de prélèvement de 15 mL. Cette redistribution est la fraction cellulaire non désirés.
   4. Laver la colonne 3 fois avec PBS 1 x 3 mL + EDTA + BSA chaque fois, ce qui lui permet de circuler à travers par gravité dans le tube de prélèvement. Supprimer la colonne de l’aimant et placez-la sur le haut d’un tube de 15 mL.
   5. Ajouter 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA et rincer avec le piston fourni avec la colonne. Enlever le piston et répéter la chasse d’eau avec 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA supplémentaire. Compter les cellules dans le volume total à l’aide de méthodes standard.
   6. Tournez en bas des cellules à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans IMDM complet (IMDM + 10 % BF + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) pour la culture. Culture de que ces cellules pour la nuit en 2 x 10⁶ cellules/1 mL de médias complet de la cellule IMDM en les plaçant dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂.

5. transduction

1. Transfection rétrovirale plasmide
   1. Fraîchement décongeler les cellules HEK293 définie de l’après-midi avant dans un bain-marie à 37 ° C. Faites tourner le cryotube contenant les cellules HEK à 435 x g à température ambiante pendant 3 min. retirer le surnageant via un vide et suspendre le culot dans 1 mL de DMEM supplémenté de 10 % des BF, la pénicilline, la streptomycine et la glutamine.
   2. Compter les cellules et ajouter le volume approprié à un plat de 10 cm traité (~ 4 x 10⁶ HEK293T cellules). Ajouter 14 mL des médias DMEM 10 au plat et mélangez-le bien en le faisant glisser verticalement pour une répartition égale. Placer le plat dans un 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur du jour au lendemain.
   3. Le lendemain matin, vérifiez la confluence des cellules sous un microscope inversé léger (50 % ou plus fonctionne bien).
   4. Combiner l’ADN (plasmide retroviral désirée), PclEco (plasmide d’emballage), 2 M CaCl₂et H₂0 dans un tube de 1,5 mL (= 500 µL) à l’aide d’une micropipette dans les montants suivants : 7,5 µg d’ADN (BCR-ABL1-YFP), 7,5 µg de pCLeco, 62 µL de CaCl 2 M₂ et de l’eau pour un volume final de 500 µL. ajouter 500 µL de 2 x HBS dans un autre tube de 1,5 mL.
   5. Ajouter l’ADN mélanger quelques gouttes dans le tube de 1,5 mL contenant 500 µL de 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES et 1,5 mM Na₂HPO₄) tout en mélangeant. Atteindre cet objectif en définissant un vortex à la vitesse la plus basse et tenir le tube HBS sur elle pour un mélange constant tout en ajoutant le mélange de transfection.
   6. Laissez le mélange de transfection à incuber pendant 20 à 30 min à température ambiante. Pendant l’incubation, ajouter 25 chloroquine nM aux cellules HEK et placez-les dans l’incubateur. Après l’incubation, ajouter le mélange de transfection goutte aux cellules HEK et, ensuite, doucement agiter les médias pour mélanger la transfection tout au long de la plaque.
   7. Incuber les cellules avec le mélange pendant environ 8 h en a 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur. Modifier les médias sur ces cellules en ajoutant très lentement 14 mL de frais DMEM 10 médias. Pipetage lentement contre la paroi du plat contribue à prévenir tout décapage des cellules HEK. Incuber les cellules pendant la nuit dans les 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur.
   8. Recueillir le surnageant viral avec une seringue de 10 mL, aspirer le surnageant dans la seringue et fixer la seringue-filtre de 0,45 µm. Plonger le surnageant viral dans un nouveau tube de prélèvement. Prendre la première collection de viral surnageant ~ 16 h plus tard.
2. La transduction et la fibronectine concentration virale
   1. Ajouter 2 mL d’un fragment de fibronectine humaine recombinante 0,1 mg dans du PBS 1 x plaques de culture de 6 puits non traitée. Préparer la fibronectine autant que nécessaire, qui dépend du nombre de cellules et de génotypes. Eh bien, on peut transmettre suffisamment 10 million de cellules c-Kit⁺ . Incuber la plaque pendant une nuit à 4 ° C.
   2. Le lendemain, retirer la fibronectine provenant des puits avec une pipette, pipette de 2 mL de BSA stérile de 2 % dans du PBS 1 x à bloquer la plaque et incuber 30 min à température ambiante. Supprimer la BSA via un vide et laver soigneusement par pipetage 2 mL de solution 1 PBS x puis supprimer via un vide.
   3. Ajouter immédiatement fraîchement recueillie et filtrée (avec 0,45 µm) surnageant viral, jusqu'à 5 mL. Centrifuger à 435 g à 32 ° C pour 2 h. retirer le surnageant via un vide et répétez cette étape avec supplémentaire surnageant viral fraîchement récolté et tourner de nouveau. Retirez le surnageant via un vide et laver les puits en ajoutant 2 mL de solution de 1 PBS x ; Ensuite, supprimer via un vide.
   4. Ajouter que la souris c-Kit⁺ cellules qu’ont été cultivée pendant la nuit (étape 4.6.6) à virale de la microplaque de bien mélanger les suspensions cellulaires et eux pipetage dans la plaque de fibronectine concentré virale maintenant. Tourner à 1 200 g à 25 ° C pendant 90 min. mettre les cellules en a 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur.
   5. posttransduction 48 h, les cellules de granule par centrifugation à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min et les remettre en suspension dans le tampon de FACS #1 (solution 1 PBS x + 0,5 % de BSA) à 6 x 10,6/ml. Déterminer le pourcentage de cellules positives BCR-ABL1 en mesurant le pourcentage de YFP positive à l’aide de cytométrie en flux.
   6. Acquérir des événements avec la procédure standard. Tout d’abord, porte les cellules vivantes basés sur la diffusion vers l’avant et latérale. Puis, porte les YFP positive des cellules vivantes à l’exclusion de la YFP-negativecells déterminé par le contrôle négatif (Figure 4).

6. formant des colonies UnitAssays

1. Dégelez la méthylcellulose avec cytokines de souris à température ambiante pendant 1 à 2 h. Aliquot 3 mL de méthylcellulose dans un tube de FACS à l’aide d’une seringue de 5 mL sans aiguille. Trier les cellules YFP-positif sur un trieur de cellules.
2. Faire tourner les cellules vers le bas et suspendre le culot dans médias complet IMDM. Compter les cellules pour être plaqué et diluer pour obtenir 5 000 cellules YFP positives dans 100 µL de médias complet IMDM.
3. Ajouter 100 µL de la suspension cellulaire contenant 5 000 cellules YFP-positives et les inhibiteurs appropriés à 3 mL de méthylcellulose (voir Table des matières). Vortex en haut à mélanger pendant 10 à 30 s.
4. Après la majeure partie de l’air ont échappé à bulles, utiliser une seringue de 1 mL à 1 mL de médias en trois plaques répétées 3 cm sur plaque en éjecte le support sur un côté et en inclinant lentement la plaque dans un mouvement circulaire de se répandre uniformément.
5. La concentration finale des inhibiteurs d’utiliser sont imatinib à 3 µM, DFC à 0,2 µM et BCI à 0,5 µM, seuls ou en combinaison. Chaque fois que nécessaire, supprimez c-Fos en ensemençant les cellules avec 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) ajouté à la méthylcellulose.
6. Après ensemencement, mettre les plaques dans une grande boîte de pétri avec une capsule ouverte contenant 2 mL d’eau stérile au milieu. Couvrir la grande boîte de Pétri et incuber soigneusement à la 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur. Enregistrer le nombre de colonies après une semaine d’électrodéposition en comptant le nombre total de colonies sous un microscope.
7. Analyser quelques colonies de plaques appropriées pour la suppression de c-Fos par PCR. Recueillir les colonies en les suçant avec une pointe de P1000. Déloger les cellules de 500 µL de PBS 1 x en lavant la pointe dans du PBS plusieurs fois. Faites tourner les suspensions cellulaires à 6 000 x g pendant 1 min et extrait le culot cellulaire à l’aide d’un kit d’isolation de l’ADN génomique de l’ADN.
8. Utiliser l’ADN génomique pour PCR avec des amorces MFO-FP3 et MFO-RP5, tel que décrit dans le tableau 2. Analyser les produits PCR sur un gel d’agarose à 2 % et une image à l’aide d’un système de documentation de gel.
9. Pour une présentation graphique des colonies, tacher les colonies, à l’aide de chlorure d’Iodonitrotétrazolium. Dissoudre 10 mg de chlorure d’Iodonitrotétrazolium dans 10 mL d’eau pour obtenir une solution de 1 mg/mL. Filtre de stériliser la solution en utilisant un raccord Luer lock avec filtre 0,2 µm attaché à une seringue de 10 mL dans des conditions stériles sous une hotte de culture de tissus.
10. Dans la hotte de la culture de tissus, ajouter 100 µL de solution colorante goutte autour de la plaque de l’UFC ; Veillez à ne pas glisser ou perturber les colonies. Incuber les boîtes de nuit à un 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de₂ cellules. Les colonies seront vire au brun rougeâtre foncé. À l’aide d’un fond blanc dans la hotte de la culture de tissus stériles, prendre des photos de la plaque d’UFC tachée.

7. transplantation et analyse de la mortalité

1. Mortellement irradier les souris avec un rayonnement de split en utilisant un 137 Cs base Gamma-ray à un dosage de 7,0 Gy suivie de 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h d’intervalle avant la transplantation.
2. Transplant 4 x 10⁴ unsorted YFP-positive (calculée sur le pourcentage de YFP) 3 x 10⁵ cellules de moelle osseuse normale comme entreprise dans chaque souris à queue vein injection.
3. Après une semaine de la transplantation, déterminer la prise de greffe en analysant les cellules YFP-positive du sang périphérique à l’aide de FACS.
4. Effectuer une purge de veine de queue et des analyses de FACS.
   1. Réchauffer la cage des souris sous une lampe chauffante avec attention de ne pas surchauffer ou brûler.
   2. Empêcher une souris dans une drisse de souris et entailler la veine caudale avec une lame stérile. Le lait doucement la queue d’antérieur postérieur, ce qui permet une goutte de sang à s’accumuler. Recueillir le sang avec un tube capillaire hépariné jusqu'à ce qu’il est rempli (frais virés autour de 75 à 100 µL). Plonger le sang du tube capillaire rempli dans un tube de prélèvement de sang contenant de l’EDTA et bien mélanger.
   3. Lyse des globules rouges en ajoutant 30 – 40 µL de sang à 3 mL de tampon de lyse RBC 1 x (150 mM de chlorure d’ammonium, bicarbonate de potassium 10 mM et 0,13 mM EDTA). Bien mélanger, renversant le tube plusieurs fois. Incuber à température ambiante pendant 10 à 15 min. Spin à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant via un vide et suspendre le culot dans 2 mL de solution de 1 PBS x pour un lavage.
   4. Tourner à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant et le suspendre dans un tampon FACS #1. Réaliser FACS analyse comme décrit ci-dessus dans l’étape 5.2.5–5.2.66. Magasin à court terme le sang restant dans le tube de prélèvement, qui peut être utilisé à diverses autres fins, à 4 ° C.
5. Transplanté de souris qui a montré de 10 à 40 % des cellules positives YFP dans le sang périphérique ont été utilisés pour l’expérience. Les souris qui avaient moins de 2 % des cellules YFP-positives ont été exclus de l’étude.
6. Préparer le tamoxifène 20 mg/ml dans de l’huile de maïs à 60 ° C avec agitation intermittente jusqu'à dissolution complète et conserver à 4 ° C dans l’obscurité pendant la durée du traitement. Après une semaine de la transplantation, supprimer l’allèle de c-Fos^fl/fl en injectant du tamoxifène (100 mg/kg dans l’huile de maïs) par voie intrapéritonéale (i.p.) dans les souris, chaque jour pendant trois jours consécutifs. Il est important que les souris sont pesés pour déterminer combien tamoxifène à injecter. Après le traitement tamoxifène (le cas échéant), les souris pour les traitements médicamenteux de groupe (n = 5/groupe).
7. Surveiller les souris pour la survie et la progression de la leucémie et déterminer leucémiques fardeau (cellules YFP positives par FACS) hebdomadaire jusqu'à huit semaines chez les survivants des souris.
8. Analyser le sang pour la suppression de c-Fos où cela est nécessaire, comme décrit ci-dessus à l’article 6. Enregistre le nombre de survivants souris chaque jour et tracer la courbe de survie à la fin de l’expérience en utilisant un logiciel graphique.

8. transgéniques modèle de leucémie BCR-ABL1

1. Isolement de LSK
   1. Maintenir la souris transgénique Scl-tTA sur chow doxycycline pour empêcher l’expression de BCR-ABL1. Quatre semaines avant la transplantation, prendre les souris hors de la doxycycline chow pour BCR-ABL1 expression.
   2. Isoler les TMNCs du Scl-tTA souris transgéniques comme décrit ci-dessus à l’article 4. Suspendre les TMNCs dans un tampon FACS #2 (solution 1 PBS x + 0,5 % de BSA + 2 mM EDTA) d’obtenir 10⁶ cellules/mL.
   3. Appauvrissent les TMNCs pour les cellules de la lignée positive en ajoutant 10 µL de biotine cocktail de la cellule de détection lineage (biotine-conjugués anticorps monoclonaux contre CD5 [rat IgG2a], CD11b [rat IgG2a], CD45R [B220] [rat IgG2a], Anti-7-4 [rat IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rat IgG2a] et Anti-Ter-119 [rat IgG2b]) par 1 x 10⁶ cellules. Incuber les cellules à 4 ° C pendant 10 min dans le noir, suivi d’un lavage avec 5 mL de tampon de FACS #2 et tourner complètement à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant et suspendre les cellules de 400 µL de tampon de FACS #2.
   4. Ajouter 5 µL de anti-biotine anticorps-FITC conjugué, 1,2 µL de PECy7 Ly-6 a/E (Sca1) et 2,4 µL de CD117 (c-Kit) APC anticorps pour jusqu'à 10⁸ millions de cellules. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min. lavage en mettant le volume jusqu'à 5 mL avec le tampon de FACS #2 ; puis, centrifuger à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant et suspendre le culot cellulaire dans 500 µL de tampon de FACS #2.
   5. Filtrer la suspension de cellules dans un tube avec bouchon à filtre bleu FACS.
   6. Cellules vivantes porte à l’aide de dispersion vers l’avant et latérale. Ensuite, sélectionnez les cellules de lin^– qui a montré des IFM (signifie l’intensité de la fluorescence de moins de 10²) pour obtenir LSK cellules de c-Kit⁺ et Sca1⁺ sur un bi-exponentielle tracer du parent de Lin^– et les trier (Figure 7 C).
   7. Recueillir les cellules triées et eux centrifuger à 1 200 x g à 4 ° C pendant 5 min.
2. Transplantation
   1. Mortellement irradient les souris BoyJ avec une dose de rayonnement de split de 7,0 Gy suivie de 4,75 Gy après 3 h, avant la transplantation.
   2. Injecter 3 x 10³ à 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK él 0,3 x 10⁶ cellules de moelle osseuse d’assistance provenant de souris WT BoyJ via la veine caudale (i.v.) dans les souris irradiées de la BoyJ.
   3. Post-transplantation de quatre semaines, analyser les souris bénéficiaires pour CD45.1 et CD45.2. Obtenir le TMNC du sang périphérique en queue veine saignement comme indiqué au point 7.4. Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de FACS. Incuber les cellules avec 1 µL de chaque de l’anticorps CD45.1-FITC et CD45.2-PE à température ambiante pendant 1 h.
   4. Laver les cellules en mettant le volume à 3 mL avec le tampon de FACS et essorage à 1 200 g à 4 ° C pour 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension il dans 200 µL de solution 1 PBS x.
   5. Analyser le pourcentage de CD45.1 et CD45.2 en premier déclenchement l’issu des nuages de points avant et latéraux, suivie par blocage des cellules positives-FITC et à PE basés sur l’exemple sans coloration des cellules vivantes.
   6. Les souris du groupe en quatre groupes (n = 6 par groupe). Commencer le traitement par l’imatinib (75 mg/kg 2 fois par jour) seuls ou en combinaison avec DFC + BCI (les deux médicaments ont été administrés à une dose de 10 mg/kg 2 fois par jour).
   7. De même, traiter des autres groupes avec des combinaisons de curcumine (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) et imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg), imatinib (75 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) pendant trois mois, 2 fois par jour, par injection i.p.
   8. Analyser les souris 1 fois par mois pendant six mois pour chimérisme leucémique en déterminant le pourcentage de CD45.2 positive de cellules dans le sang périphérique de queue veineuse saignement tel que décrit à l’étape 7,4.

9. en Vivo évaluation de BCI et activité de DFC

1. Analyse de Phospho-p38
   1. Prenez trois souris leucémiques (âgés de 8 à 12 semaines) qui ont été transplantées avec cellules de c-Kit⁺ BCR-ABL1-exprimant, comme décrit à l’article 7. Injecter les souris avec BCI (10 mg/kg) par injection i.p. quatre semaines après la transplantation.
   2. Mesurer les niveaux de sang périphérique phospho-p38 TMNC grâce au kit de cytométrie de flux phosphorylation selon les instructions du fournisseur. Recueillir le sang de chaque souris avant et 6 h après l’injection de drogues. Isoler les TMNCs par l’appauvrissement de RBC et les fixer comme suit.
   3. Ajouter 4 mL de solution de lyse RBC par 100 µL de sang périphérique. Mélanger et laisser incuber sur glace pendant 5 min lyser les globules rouges. centrifuger les cellules à 1 200 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez la lyse 1 x plus.
   4. Après la deuxième étape de lyse, laver les granules cellulaires avec 1 mL de 2 % de BSA dans du PBS. Fixer les cellules en ajoutant 100 µL des solutions de fixation et permeabilization et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l’obscurité. La cellule a granulé par centrifugation à 1 200 x g pendant 5 min à 4 ° C.
   5. Laver les boulettes avec 1 mL de 1 x lavage perméabilisation. Bloquer les cellules en ajoutant 300 µL de 2 % de BSA dans le tampon de lavage perméabilisation à température ambiante pour 20 min. diviser les cellules en trois égales aliquotes de 100 µL de chaque (~ 1 x10⁶).
   6. Ajouter 1 µL d’anticorps p-38 total, 1 µL d’anticorps phospho-p38 ou 1 µL d’isotype IgG contrôle, respectivement à chaque aliquote de cellules fixes et incuber une nuit à 4 ° C.
   7. Laver les cellules 1 x 5 ml de BSA 2 % dans du PBS et incuber avec l’anticorps secondaire (1 µL d’Alexa Fluor-488 conjugué) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les cellules 1 x nouveau et suspendez-les dans 200 µL de PBS 1 x.
   8. Acquérir les données de FACS et les analyser par le logiciel d’analyse de cytométrie en flux.
   9. Déduire l’IMF du contrôle IgG provenant de l’ITSM des échantillons expérimentaux. Les valeurs MFI de phospho-p38 sont ensuite normalisées à celle du total p-38 pour déterminer les niveaux de phospho-p38 après l’injection de BCI.
2. Analyse de l’expression génétique quantitative des gènes cibles de c-Fos
   1. Prenez trois souris leucémiques (âgés de 8 à 12 semaines), qui ont été transplantées avec BCR-ABL1-c-Kit⁺ les cellules exprimant tel que décrit à l’article 7. Recueillir le sang périphérique de chaque souris et les souris puis injecter 10 mg/kg chacun de DFC + BCI.
   2. Recueillir le sang périphérique 6 h après l’injection de drogues. Isoler les TMNCs par l’appauvrissement de RBC, tel que décrit ci-dessus. Les TMNCs de granule et suspendez-les dans un tampon de lyse axée sur le phénol (voir Table des matières).
   3. Effectuer l’analyse RT-qPCR (tel que décrit à l’article 1) pour Bcl2l11, FRV et IL-6 en utilisant des amorces de gène-spécifique (voir tableau 1).

10. à long terme qui lance Culture Cell Assay

Remarque : Un test LTCIC a été réalisé comme décrit plus haut²⁵.

1. Cultiver une lignée de cellules de fibroblastes de souris MS-5 en MEMα à confluence dans une fiole de vitroplants T175. Trypsinize les cellules comme décrit ci-dessus pour HEK293T. Suspendre les cellules en MEMα à 2 x 10⁶ cellules/mL. Prenez 10 x 10⁶ cellules dans un tube conique de 50 mL et irradier à 80 Gy. Diluer les cellules à 0,5 x 10⁶ cellules/mL dans MEMα additionné de médias FBS (M10) de 10 %. Plaque 2 mL par puits dans une plaque de 12 puits et incuber il en a 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur du jour au lendemain.
2. Le lendemain, préparer l’hémisuccinate de sodium d’hydrocortisone en dissolvant 2,5 mg dans 5 mL de MEMα (solution à 1 M). Filtre-stériliser la solution d’hydrocortisone en utilisant un filtre de seringue 0,2 µm dans le capot de la biosécurité. Diluer l’hydrocortisone par dilution en série en MEM pour obtenir une solution de 100 µM. Ajouter 250 µL de cela dans 25 mL de milieu de culture à long terme humain (HLTM) (voir la Table des matières) juste avant d’utiliser, pour obtenir une concentration finale de 1 µM.
3. Tournez en bas la CML-CD34⁺ et TMNCs UCP3 et suspendez-les dans la HLTM au vortex brève et déterminer les chefs d’accusation par un hémocytomètre.
4. Passer l’aspirateur sur les médias M10 de la plaque de 12 puits ensemencée avec des cellules du stroma et remplacez-le par le 1 mL de cellule patient (LMC-CD34⁺ [10 000] et UCP3 TMNCs [1 x 10⁶]) suspension dans HLTM. Utilisez trois puits par combinaison de médicaments par type de cellule.
5. Diluer les stocks de médicaments à 2 x la concentration nécessaire dans HLTM. Ajouter 1 mL des médias avec des médicaments dans les cellules mentionnées ci-dessus pour obtenir une concentration de drogue 1 x. Remplacer la moitié des médias par HLTM fraîchement préparé chaque semaine pendant cinq semaines.
6. À la fin de la période de test de LTC-IC de six semaines, prélever les cellules non adhérentes dans un tube de cultures. Trypsinize cellules adhérentes et les combiner avec les cellules non adhérentes correspondantes.
7. Laver les cellules et les analyse pour UFC en méthylcellulose moyen contenant 30 % sérum de veau foetal, érythropoïétine (3 unités/mL), SF (50 ng/mL) et IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) et le facteur stimulant les colonies de granulocytes/macrophage (GM-CSF) (20 ng / mL). déterminer les chefs d’accusation par un hémocytomètre.
8. Plaque de 5 x 10⁴ cellules en trois répétitions. Geler les cellules restantes dans le DMSO de FBS et 10 % 20 % vers le bas. Disposer les plaques dans une grande boîte de pétri avec une capsule ouverte contenant de l’eau au milieu. Couvrir la grande boîte de pétri avec soin et il incuber dans un 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur pendant deux semaines.
9. Marquer les colonies des deux semaines plus tard. Dans certains cas, qu’une partie de la récolte est essayée pour UFC). Calculer que le nombre total des LTCIC présent dans la suspension de la cellule initiale par extrapolation basée sur l’UFC obtenus d’une partie de la récolte de la cellule. La production moyenne d’UFC par FLC-IC est 8.
   Remarque : Par exemple, si initialement 1 x 10⁶ cellules ont été cultivées dans un puits, après cinq semaines, 0,5 x 10⁶ cellules ont été récoltées et pour l’UFC, 5 x 10⁴ cellules étaient plaqués et 50 UFC ont été obtenus. Cela équivaut à 500 UFC/1 million de cellules plaqué. Divisez ce nombre par 8 pour obtenir la LTCIC, qui est de 62,5.

11. humanisé modèle de souris à l’aide de CML CD34 cellules⁺

1. A irradier les souris gamma NOD scid semaines 8, exprimant IL3 humaine, GM-CSF et SCF (commissions), avec une dose unique de 7,0 Gy (700 rads) avec 50 propulseurs en l/min.
2. Injecter 3 x 10⁶ CD34⁺ les cellules sélectionnées de patients en phase chronique de LMC BCR-ABL1 dans les souris irradiées par injection intraveineuse.
3. Après deux semaines de la transplantation, déterminer leucémique prise de greffe de moelle osseuse de FACS en utilisant des anticorps spécifiques à la souris et l’homme contre CD45.
4. Effectuer une analyse de FACS.
   1. Prendre l’aspirat de moelle osseuse des fémurs des souris transplantées. Lyse des globules rouges à l’aide de tampon de lyse de RBC comme décrit ci-dessus et de recueillir les TMNCs par centrifugation. Laver le culot 1 x avec du PBS 1 x contre le rhume.
   2. Bloquer les cellules avec blocs de FcR humaine et souris FcR suivi par coloration avec anti-homme CD45 FITC et anti-souris CD45 APC^Cy7 durant la nuit à 4 ° C. Effectuer l’analyse de FACS sur LSRII et analyser les données à l’aide du logiciel d’analyse de cytométrie en flux.
5. Regrouper les souris dans quatre différentes cohortes (n = 6/groupe) pour le traitement avec le véhicule, imatinib (75 mg/kg), DFC + BCI (tous deux à 10 mg/kg), ou imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (tous deux à 10 mg/kg). Diluer les médicaments en stock dans du PBS 1 x (véhicule) et de leur administrer en leur injectant i.p. 2 fois par jour.
6. Traiter les souris pendant six semaines et déterminer la charge leucémique toutes les deux semaines, jusqu'à huit semaines après la transplantation, comme décrit ci-dessus dans 11,4.

Résultats

Dépendance de l’oncogène a été impliquée dans l’efficacité thérapeutique des inhibiteurs. Cependant, les mécanismes de la dépendance de l’oncogène de conduite ne sont pas comprises. Nous avons effectué plusieurs analyses d’expression de gène impartiale afin d’identifier la composante génétique impliqué dans l’orchestration de la dépendance. Ces analyses ont révélé l’upregulation de trois gènes c-Fos, Dusp1 et Zfp36, dans les cellules cancéreuses qui ne s...

Discussion

La plus grande partie des cellules cancéreuses, la réponse thérapeutique au TKI est médiée par un blocus de tyrosine-kinase-oncoprotéine signaux dont la tumeur est accro. Cependant, relativement peu est connu sur une minorité de cellules cancéreuses contribuant au MRD comment échapper à la dépendance et la thérapie d’oncogène⁴. Des études récentes ont révélé que la signalisation du facteur de croissance Médie pharmacorésistance dans la leucémie et de tumeurs des organes plei...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati