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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Salmonella spp /Shigella spp sont pathogènes courants attribués à la diarrhée. Ici, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.

Résumé

La transmission fécale-orale de gastro-entérite aiguë se produit de temps en temps, surtout quand les personnes qui manipulent les aliments et l’eau sont infectées par Salmonella spp/Shigella spp. La méthode de l’étalon-or pour la détection de Salmonella spp/Shigella spp est culture directe mais c’est long et fastidieux. Nous décrivons ici une plate-forme haut débit pour Salmonella spp/Shigella spp de dépistage, à l’aide de la PCR en temps réel (PCR) combiné avec la culture guidée. Il y a deux grandes étapes : PCR en temps réel et la culture guidée. Pour la première étape (PCR temps réel), nous expliquer chaque étape de la méthode : échantillons de collection, pré-enrichissement, extraction d’ADN et la PCR en temps réel. Si le résultat de la PCR en temps réel est positif, la deuxième étape (culture guidée) est réalisée : la culture sélective, identification biochimique et caractérisation sérologique. Nous illustrons aussi résultats représentatifs générés à partir d’elle. Le protocole décrit ici serait une plate-forme utile pour le dépistage rapide, précise, sensible et haut débit de Salmonella spp /Shigella spp.

Introduction

La diarrhée est toujours un problème de santé courant à forte incidence taux globalement1,2. Bien que la mortalité est relativement faible, certains patients présentent des symptômes divers pendant des semaines (par exemple, molles et aqueuses tabourets, une urgence à aller aux toilettes), qui rendent l’impact socioéconomique très élevé3,4. Plus sérieusement, certains patients peuvent même développer le syndrome du côlon irritable si laissé non traité5. Il existe différents types de bactéries, les virus et les parasites qui peuvent causer la diarrhée6. Salmonella spp /Shigella spp sont parmi les bactéries les plus courantes pour la transmission de la gastro-entérite aiguë7,8,9,10,11. Par conséquent, beaucoup de comtés ont émis des lois ou aux règlements réguliers Salmonella spp /Shigella spp. dépistage parmi les gens qui traiteront de nourriture et eau. Par exemple, le gouvernement chinois ont publié des lois pour obligatoire Salmonella spp /Shigella spp. dépistage une fois par an.

La méthode de l’étalon-or pour Salmonella spp / détection deShigella spp est la culture de bactéries. Par le biais de la culture de bactéries et identification biochimique successive et caractérisation sérologique, nous pouvons identifier les espèces de bactéries, ce qui pourraient faciliter la gestion des épidémies maladie et profilage antimicrobienne pour faciliter le traitement des patients 12. il pourrait aussi aider à remonter à la source de l’infection au cours de la Salmonella spp /Shigella spp éclosion13. Toutefois, cette méthode est fastidieuse (nécessitant une opération manuelle) et beaucoup de temps (prendre plusieurs jours), en particulier pour les essais d’un grand nombre d’échantillons7. En outre, viable mais non cultivable (VBNC) Salmonella spp /Shigella spppeut exister dans certains échantillons de selles14. Compte tenu de ces inconvénients, plusieurs laboratoires ont tenté de développer de nouvelles techniques pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. tous ces méthodes utilisent le test nucléaire acid amplification (TAAN), parmi lesquels la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est le plus fréquent. Une limitation majeure de ces méthodes TAAN basé est que les bactéries mortes, ADN génomique incomplet contenant des débris même bactérienne, pourraient montrer des résultats positifs26, qui peuvent largement influencer le diagnostic précis de maladie. Blanco et coll. ont montré que test moléculaire est très sensible, non seulement viable Salmonella dans les cultures, mais aussi aux génomes partielles et bactéries infections passées ou contamination26morts ou non viables. Donc, les nouvelles technologies devraient être développés.

Ici, nous avons décrit une nouvelle méthode que combine le TAAN base de méthode et culture. Tel qu’illustré à la Figure 1, cette nouvelle méthode s’applique de PCR en temps réel contrôle premier et ensuite les échantillons positifs sont envoyés pour l’identification et de la culture de bactéries.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices établies par le Comité d’éthique de la recherche humaine de Zhuhai International Travel Centre de soins de santé. S’il vous plaît utiliser opération stérile standard pendant l’expérience.

1. préparation et Composition de milieux de Culture

  1. Préparer le bouillon nutritif : Dissoudre 1 % de peptone, 0,3 % d’extrait de boeuf, chlorure de sodium 0,5 %, 0,1 % de glucose en H2O, ajuster le pH à 7,5 et stériliser à 121 ° C pendant 15 min.
  2. Préparer le milieu Selenite Cystine : dissoudre la peptone de 0,5 %, 1 % Na2HCO3, 0,4 % de lactose, 0,4 % de sélénite de sodium hydrogène, 0,001 % L-Cystine en H2O, ajuster le pH à 7.0 et faire bouillir pendant 5 min.
  3. Préparer le Xylose, Lysine, gélose au désoxycholate (XLD) : extrait de levure de dissoudre 0,3 %, 0,5 % L-lysine, xylose 0,375 %, 0,75 % de lactose, 0,75 % de sucrose, 0,5 % de chlorure de sodium, rouge de phénol de 0,008 %, 0,68 % du thiosulfate de sodium, citrate d’ammonium ferrique et 0,08 %, sodium 0,25 % désoxycholate, 1,5 % d’agar en H2O et ajuster le pH à 7,4. Faire bouillir pendant 5 min, puis versez-la dans des plaques de 90 mm.
  4. Préparer la gélose Salmonella -épreuve à développement chromogène : dissoudre 1,5 % d’agar, 0,7 % d’extrait de peptone et levure, 1,29 % réactif sélective en H2O. Faire bouillir pendant 5 min, puis versez-la dans des plaques de 90 mm.
  5. Préparer la plaque de gélose nutritive : dissoudre 1 % de peptone, 0,3 % d’extrait de boeuf, chlorure de sodium 0,5 %, 1,5 % d’agar en H2O et ajuster le pH à 7,3. Puis l’autoclave à 121 ° C pendant 15 min et verser dans des plaques de 90 mm.
  6. Préparer la gélose de MacConkey (MAC) : dissoudre la peptone de 2 %, 1 % de lactose, chlorure de sodium 0,5 %, 0,5 % sels biliaires OX, 0,0025 % rouge neutre, 1,5 % d’agar, 0,0001 % cristal violet en H2O et ajuster le pH à 7,2. Puis l’autoclave à 115 ° C pendant 20 min et verser dans des plaques de 90 mm.

2. Real-time PCR

  1. Prélèvement d’échantillons
    1. Insérer un écouvillonnage rectal dans l’anus du patient 3-5 cm de profondeur et la tourner 360° autour.
    2. Mettre l’Écouvillonnage rectal dans un tube de prélèvement stérile. Marquer le code échantillon.
    3. Envoyer l’échantillon au laboratoire dès que possible.
      Remarque : Les échantillons pourraient être conservés à 4 ° C pendant pas plus de 24 h.
  2. Pré-enrichissement
    1. Ajouter 3 mL de bouillon nutritif dans chaque échantillon dans le tube de prélèvement.
    2. Incuber à 36 ° C pendant 6 h dans un incubateur.
  3. Exemple de mélange (en option)
    1. Collecter 100 µL de chaque culture de pré-enrichissement et mélanger les échantillons de 8-10 de 1 échantillon dans un tube de 1,5 mL s’il n’y a plus de 10 échantillons.
    2. Marquer correctement.
  4. Extraction d’ADN
    1. Centrifuger la culture de pré-enrichissement à 800 g pendant 2 min permettre les grosses particules se calment, et transfert le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant par aspiration.
    2. Ajouter 100 µL de solution d’extraction de l’ADN (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01 % Nonidet P 40 (NP40)) au culot. Vortex vigoureusement pendant 1 min.
    3. Faire bouillir à 100 ° C pendant 5 min sur un bain sec.
    4. Centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min. récupérer le surnageant à l’aide d’un nouveau tube, qui sera le modèle pour l’analyse postérieure de la PCR en temps réel.
  5. PCR en temps réel
    1. Configurer le mélange réactionnel comme suivre : pour chaque échantillon, ajoutez 12,5 µL de 2 x 5 µL du modèle tel qu’établi à l’étape 2.4.4, 0,2 µM de chaque sonde (séquences dans le tableau 1)27, 0,4 µM de chaque amorce, mélange réactionnel et utilisez FD2O pour ajouter jusqu'à 25 µL de total volume.
    2. Configurer le programme de cyclisme comme suit : 95 ° C pendant 3 min, suivie de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 34 s. signaux de fluorescents virés de 6-carboxy-fluorescéine (FAM) et les canaux Hexachlorofluorescein (HEX) à l’étape d’élongation (72 ° C) automatiquement par la machine PCR en temps réel fluorescente.
    3. Effectuer la PCR en temps réel sur une machine PCR en temps réel fluorescente, conformément aux instructions de l’instrument.
    4. Aller directement à l’étape 4 et publier des rapports négatifs en cas de résultats négatifs sur les canaux de FAM/HEX, ce qui signifie que les échantillons sont négatifs pour la Salmonella spp /Shigella spp.
    5. Passez à l’étape 3.1 ou 3.2 Si positif résultats surviennent sur des canaux de l’hexagone ou FAM, ce qui signifie que l’échantillon peut être positif pour Salmonella spp et/ou de Shigella spp., respectivement.
      Remarque : Si le mélange de l’échantillon a été effectuée à l’étape 2.3, puis PCR en temps réel sur des échantillons individuels qui compose l’un positif est souhaitable pour écarter l’échantillon réel positif.

3. guidée Culture

  1. Échantillon positif le PCR Salmonella spp.
    1. Culture dans un milieu sélective
      1. Ajouter 100 µL de la culture de pré-enrichissement dans 5 mL de milieu de sélénite Cystine dans un tube à essai. Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 h dans un incubateur.
    2. Culture sur plaque de séparation
      1. Récupérer une boucle de la culture avec une micro boucle et étalé sur une plaque de XLD ou chromogènes de gélose Salmonella . Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 heures dans un incubateur.
    3. Identification biochimique
      1. Sélectionnez colonies suspectes sur plaque de XLD (colonie rose avec/sans coeur sombre ; sombre colonie colonie jaune avec/sans coeur sombre) ou Salmonella chromogenic agar (colonie pourpre ou prunosus, lisse et rond) (Figure 2).
      2. Objet suspecte colonie pour identification biochimique sur le système automatisé d’identification microbienne, conformément aux instructions de l’instrument.
    4. Caractérisation sérologique
      1. O caractérisation de l’antigène
        1. Ajouter une goutte du sera antigène polyvalent O sur une lame propre.
        2. Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la mouture dans le sérum.
        3. Passez à l’étape de 3.1.4.1.4 si elle ressemble à couler sable, ce qui signifie que la colonie est réactive pour les sérums (Figure 3). Sinon, passez à l’étape 3.1.4.1.5.
        4. Sérums monovalents de l’antigène O permet de répéter les étapes 3.1.4.1.1 à 3.1.4.1.3 jusqu'à ce que l’antigène O spécifique est caractérisée.
        5. Sérums Vi permet de répéter les étapes 3.1.4.1.1 à 3.1.4.1.3. Recueillir ces colonies réactives de sérums de Vi dans un tube et faire bouillir à 100 ° C pendant 5 min dans un bain sec. Centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min. recueillir culot et répétez les étapes 3.1.4.1.1 à 3.1.4.1.4 jusqu'à ce que l’antigène O spécifique est caractérisée.
      2. Caractérisation de l’antigène de H
        1. Ajouter une goutte du sera antigène polyvalent H sur une lame propre.
        2. Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la mouture dans le sérum.
        3. Passez à l’étape de 3.1.4.2.4 si elle ressemble à couler sable, ce qui signifie que la colonie est réactive pour les sérums.
        4. Sérums monovalents de l’antigène H permet de répéter les étapes 3.1.4.2.1 à 3.1.4.2.3 jusqu'à ce que l’antigène H spécifique est caractérisée.
          NOTE : Parfois induction sérum peut être nécessaire pour caractériser l’antigène phase H deuxième. Dans l’affirmative, puis les étapes facultatives suivantes doivent être effectuées.
        5. (Facultatif) Ajouter une goutte de spécifique sera antigène de H sur gélose nutritive. Attendez que tous les sérums sont absorbés.
        6. (Facultatif) Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la propagation sur la plaque où spécifique sera antigène de H est absorbés. Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 heures dans un incubateur.
        7. (Facultatif) Sérums monovalents de l’antigène H permet de répéter les étapes 3.1.4.2.1 à 3.1.4.2.3 jusqu'à ce que la deuxième phase de l’antigène H est caractérisée.
        8. Passez à l’étape 4.
  2. Échantillon positif le PCR Shigella spp.
    1. Culture sur plaque de séparation
      1. Récupérer une boucle de la culture de pré-enrichissement avec une micro boucle et étalé sur une plaque de XLD ou plaque de MAC. Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 h dans un incubateur.
    2. Identification biochimique
      1. Recueillir des colonies suspectes sur plaque de XLD (lisse, rond, colonie transparente et rouge) ou MAC (lisse, rond, colonie transparente et incolore avec 2-3 mm de diamètre ; Shigella sonnei peut être plus grand et se tournent vers la lumière rose comme l’allongement de la durée d’incubation) (Figure 4).
      2. Objet suspecte colonie pour identification biochimique sur le système automatisé d’identification microbienne, conformément aux instructions de l’instrument.
    3. Caractérisation sérologique
      1. Ajouter une goutte des sérums polyvalents de Shigella spp sur une lame propre.
      2. Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la mouture dans le sérum.
      3. Passez à l’étape 3.2.3.4 si elle ressemble à couler sable, ce qui signifie que la colonie est réactive pour les sérums.
      4. Sérums monovalents de Shigella spp. permet de répéter les étapes 3.2.3.1 à 3.2.3.3 jusqu'à ce que des Shigella spp est caractérisée.
      5. Passez à l’étape 4.

4. rapport

  1. Présenter des rapports positifs ou négatifs selon les résultats ci-dessus.

Résultats

Le protocole a été appliqué pour le dépistage des espèces de Salmonella ouShigella spp tabouret anal échantillons de personnes qui traiterait de nourriture et eau.

Dans l’étape PCR en temps réel, comme illustré à la Figure 5A, il y avait une amplification réussie en canal HEX, ce qui signifie que l’échantillon mélangé est positif pour Salmonel...

Discussion

Depuis Salmonella spp /Shigella spp. sont souvent associés aux intoxications alimentaires et transmission fécale-orale de la gastro-entérite aiguë28,29 , et la méthode de routine est beaucoup de travail ou de longue durée 7, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la Salmonella spp / le dépistageShigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Science et technologie Programme de Zhuhai, Chine (subvention numéro 20171009E030064), la Science et technologie Programme de Guangdong, Chine (subvention numéro 2015A020211004) et la Science et technologie Programme de l’Administration générale de la Supervision de la qualité, Inspection et la quarantaine de la République populaire de Chine (numéro grant 2016IK302, 2017IK224).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
TrisSigma10708976001
EDTASigma798681
NP40Sigma11332473001
ddH2OTakara9012
PrimeSTAR HS (Premix)TakaraR040Q
Nutrient BrothLandBridgeCM106
Nutrient agarLandBridgeCM107
Selenite Cystine mediumLandBridgeCM225
XLDLandBridgeCM219
MAC LandBridgeCM908
Salmonella chromogenic agarCHROMagarSA130
Salmonella diagnostic serumTianrunSAL60
Shigella diagnostic serumTianrunSHI54
anal swab (collecting tube plus)Huachenyang
slideMingsheng7102
micro-loopWeierkangW511
incubatorJinghongDNP-9082
autoclaveAULSS-325
dry bathJinghongKB-20
automated microbial identification systembioMérieuxVITEK2other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machineThermoFisherABI7500other equivalent machine could be used

Références

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