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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.

Résumé

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par l’expansion des clones de cellules malignes de B et représente la leucémie la plus courante dans les pays occidentaux. La majorité des patients atteints de LLC montrent une lente évolution de la maladie ainsi qu’un phénotype anergiques de leurs cellules de la leucémie, se référant à un récepteur des cellules B ne répond pas à une stimulation externe. Nous avons récemment démontré que le facteur de transcription NFAT2 est un régulateur crucial d’anergie à CLL. Un défi majeur dans l’analyse du rôle d’un facteur de transcription dans différentes maladies est l’identification de ses gènes cibles spécifiques. Il s’agit d’une grande importance pour l’élucidation des mécanismes pathogéniques et interventions thérapeutiques potentielles. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique classique pour démontrer les interactions protéine-ADN et, par conséquent, permet d’identifier les gènes de la cible directe de facteurs de transcription dans des cellules de mammifères. Ici, ChIP a été utilisée pour identifier LCK comme un gène cible directe des NFAT2 dans les cellules humaines de CLL. L’ADN et protéines associées sont réticulés à l’aide de formaldéhyde et cisaillement par la suite par sonication dans des fragments d’ADN d’environ 200 à 500 paires de bases (bp). Des fragments d’ADN réticulés associés à NFAT2 sont ensuite sélectivement immunoprécipitée des débris de cellules à l’aide d’un anticorps αNFAT2. Après purification, les fragments d’ADN associées sont détectés par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Des séquences d’ADN avec évident enrichissement représentent des régions du génome qui sont ciblées par les NFAT2 en vivo. Tonte appropriée de l’ADN et la sélection de l’anticorps requis sont particulièrement crucial pour l’application de cette méthode. Ce protocole est idéal pour la démonstration des interactions directes de NFAT2 avec des gènes cibles. Sa principale limitation est la difficulté d’employer la puce lors d’essais à grande échelle, analysant les gènes cibles de plusieurs facteurs de transcription dans les organismes intacts.

Introduction

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) représente la leucémie plus courante chez les adultes dans les pays occidentaux, présentant une accumulation distincte de CD19, CD5 et CD23 exprimant B mature cellules1. La plupart des patients présentent une évolution de la maladie indolente, qui ne nécessite pas de traitement spécifique pendant de nombreuses années. En revanche, certains patients montrent une progression rapide nécessitant des interventions thérapeutiques immédiates avec immunitaire-chimiothérapie ou autres thérapies ciblées2,3. Facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) est une famille de facteurs de transcription contrôlant divers du développement et processus d’activation de nombreuses cellules types4,5,6. Nous avons démontré récemment surexpression et activation constitutionnelle de NFAT2 dans les cellules CLL de patients atteints de maladie indolente7. Ici, il règle un État ne répondant pas à la stimulation des récepteurs de cellules de B appelé anergie7. Pour démontrer que les NFAT2 se lie au promoteur lymphocytes spécifiques protéine tyrosine kinase (LCK) et régule l’expression LCK dans les cellules humaines du CLL, une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine spécifiques (ChIP) a été développée et utilisée.

Puce est une des plusieurs techniques pour enquêter sur le rôle des facteurs de transcription à l' expression de gène8. L’expression des gènes est bien orchestrée de façon très complexe par plusieurs organismes de réglementation présentant des facteurs de transcription, en tenant un rôle irremplaçable dans ce processus9,10,11,12. Facteurs de transcription régulant l’expression de gène dans un contexte spatial et temporel ont été identifiés chez de nombreuses espèces (par exemple, pour le développement et la différenciation)13,14,15, 16,17,18. Erreurs dans les mécanismes de contrôle complexes faisant intervenir des facteurs de transcription peuvent conduire à une variété de processus pathologiques, y compris le cancer19,20. Par conséquent, identification des facteurs de transcription et de leurs cibles respectives peut-être offrir nouvelles avenues thérapeutiques21,22. Afin d’étudier ce domaine fascinant, plusieurs méthodes sont disponibles comme puce, analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA), différents dosages d’ADN déroulants et journaliste-essais8,11,12, 23 , 24.

Pour démontrer qu’un certain facteur de transcription interagit avec certaines régions du génome, in vivo, ChIP est une technique idéale de25. À cet effet, ADN et protéines associées dans les cellules vivantes sont réticulées en utilisant l’irradiation UV ou formaldéhyde (puce réticulé, XChIP). Cette étape est omise pour obtenir le meilleur ADN et récupération de protéines dans la dite native de puce (NChIP)26. Par la suite, les complexes de protéines et l’ADN sont cisaillés par sonication en fragments d’environ 200 à 500 paires de bases (PB) et immunoprécipitée des débris cellulaires à l’aide d’un anticorps spécifique contre le facteur de transcription d’intérêt. Les fragments d’ADN associées sont ensuite purifiées et caractérisées par PCR, clonage et séquençage. Techniques alternatives utilisent des puces à ADN (ChIP-on-Chip) ou le séquençage de prochaine génération (ChIP-Seq) pour analyser l’ADN d’immunoprécipitée.

Puce a été introduite par Gilmour et Lis en 1984 quand ils ont utilisé des UV lumière de façon covalente de réticulation ADN et lié des protéines dans la vie des bactéries27. Lors de la lyse cellulaire et immunoprécipitation de la polymérase de l’ARN, des sondes spécifiques de gènes connus ont été utilisés pour cartographier la in vivo la distribution et la densité de l’ARN polymérase. La méthode a été par la suite utilisée par les mêmes chercheurs pour analyser la distribution des eucaryote ARN polymérase II sur les gènes de protéines de choc thermique dans la drosophile28. Le test de XChIP a été affiné par Varshavsky et collègues de travail qui a d’abord été utilisé formaldéhyde de réticulation pour étudier l’association de l’histone H4 avec heat shock protéines gènes29,30. L’approche NChIP, qui comporte l’avantage d’une meilleure récupération de l’ADN et des protéines en raison des épitopes naturellement intactes et, par conséquent, une plus grande spécificité de l’anticorps, a été décrite par Hebbes et collègues 198831.

L’avantage de la puce par rapport à d’autres techniques pour analyser les interactions ADN-protéines est en fait, que l’interaction réelle d’un facteur de transcription peut être étudié in vivo et aucune des sondes ou des conditions artificielles créées par des tampons ou des gels sont employait8,11,12. En combinant puce avec le séquençage de nouvelle génération, plusieurs cibles peuvent être identifiés en même temps.

Les principales limites de cette technique sont son applicabilité limitée aux essais à grande échelle dans les organismes intact25. L’analyse des modèles d’expression différentielle des gènes peut être aussi difficile à l’aide de techniques de puce si les protéines respectifs sont exprimés uniquement à des niveaux bas ou pendant les fenêtres de temps étroit. Un autre facteur potentiellement limitant est la disponibilité d’un anticorps approprié adapté pour puce11.

Le protocole de puce présenté ici peut être employé pour identifier des gènes de cible d’un facteur de transcription in vivo par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Plus précisément, l’objectif était d’identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2 en CLL. Puce a été choisi en raison de son potentiel de démontrer directement la liaison de la NFAT2 pour les régions promotrices des gènes cibles différents dans des conditions naturelles dans des cellules humaines CLL patients.

Protocole

Toutes les expériences menées avec le matériel humain ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Tübingen et consentement éclairé a été obtenu de tous les patients qui ont contribué à cette étude, les échantillons.

1. isolement et Stimulation de Jurkat cellules

Remarque : Pour optimiser le protocole, utilisez la lignée Jurkat dont on sait qu’expriment des niveaux élevés de NFAT2. Toutes les mesures sont effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer 50 mL du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine par ce réchauffement à 37 ° C dans un bain d’eau.
  2. Culture de cellules Jurkat pour 1-2 jours dans un flacon de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2 dans 20 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine à une densité d’environ 2 x 106 cellules/mL (cellules sont comptées avec Trypan coloration bleue et un Chambre de Neubauer au microscope) et leur capture par centrifugation pendant 5 min à 200 x g.
  3. Retirez le surnageant avec une pipette et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine. Par la suite, compter les cellules avec une coloration bleu de trypan conventionnels et d’une chambre de Neubauer sous le microscope.
  4. Centrifuger les cellules de l’étape 1.3 pendant 5 min à 200 x g et éliminer le surnageant par aspiration. Ensuite, remettre en suspension les cellules à une densité de 2 x 107 cellules/mL dans le RPMI 1640 additionné de 10 % FCS et 1 % la pénicilline/streptomycine et transfert 1 mL dans un nouveau tube conventionnel 5 mL de pipetage.
  5. Stimuler les cellules en ajoutant 32,4 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 1 µM ionomycine. Puis incuber les cellules pendant 16 h à 37 ° C et 5 % de CO2 avec le couvercle du tube ouvert (pour éviter toute contamination, un film d’étanchéité perméable à l’air peut être utilisé).

2. isolement et Stimulation des cellules primaires CLL de Patients humains

Remarque : Des échantillons de patients ont été acquis et stimulés comme décrit précédemment7. Toutes les mesures sont effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer le matériel nécessaire pour prélever du sang de patients et d’effectuer une séparation de gradient de densité : 21-G aiguilles, garrot, NH4-héparine-sang seringues de collection (par exemple, monovettes-S), 1 x PBS et milieu de gradient de densité (densité 1,077 g/mL) .
  2. Après ponction veineuse, tirer le sang de patients atteints de LLC (ca. 40 mL de sang par patient) dans les seringues. Alors transférer le sang dans les tubes coniques de 50 mL. Lavez la seringue 10 ml de PBS et mettre en commun la sang-PBS-suspension dans les tubes de 50 mL (ajuster le nombre de tubes pour le volume de sang).
  3. Préparer 15 mL du milieu de gradient de densité dans un tube conique frais 50 mL. Par la suite, la couche 35 mL de sang-PBS-suspension soigneusement sur le milieu de gradient de densité. Pour ce faire, tenir le tube à un angle plat et Pipetter lentement la sang-PBS-suspension contre le mur du fond du tube conique 50 mL. Comme plus de la suspension-PBS-sang s’accumule dans le tube conique de 50 mL, augmenter l’angle du tube jusqu'à un angle droit. Répétez cette étape selon le volume de sang-PBS-suspension.
  4. Effectuer la centrifugation à 560 x g pendant 20 min (sans frein), puis l’extraire de la phase de cellules mononucléées contenant les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC). Pour ce faire, recueillir l’interphase blanc de la séparation de gradient de densité avec une pipette sérologique de 5 mL et le transférer dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  5. Remplir la cellule en suspension dans 50 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 360 x g. Retirez le surnageant par aspiration. Répétez cette étape avec centrifugation pendant 5 min à 275 x g. Ensuite, mettre en commun les cellules d’un patient en 5-10 mL de PBS dans un tube conique de 50 mL.
  6. Compter les cellules comme décrit au point 1.3.
    Remarque : Cela dépend de la proportion de cellules CLL dans les PBMC isolés, si les cellules peuvent être utilisés directement pour cette procédure ou un isolement des cellules de B doit être effectué, par exemple, par l’intermédiaire de cellules magnétiques tri (MACS). L’isolement de cellules B est recommandé, mais peut être omis si la proportion de cellules CLL est supérieure à 95 % des lymphocytes totaux (déterminées par cytométrie en flux). Sang du CLL patients est fixe et lysées selon les instructions du fabricant. Puis un marquage avec des anticorps CD19-FITC et CD5-PE est effectué selon les instructions du fabricant et les cellules sont analysés par cytométrie en flux. Un patient exemplaire est illustré à la Figure 1, dans lequel la proportion de cellules CLL est 89.03 %. Ainsi, un isolement de cellules de B doit être effectué chez cette patiente. La proportion de cellules de B physiologiques est négligeable (3,72 % dans l’exemple).
  7. Laver les cellules avec 10 mL de pré chauffé (37 ° C) RPMI 1640 complétée avec FCS de 10 %, 1 % pénicilline/streptomycine, 100 mM des acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM et 50 mM β-mercaptoéthanol pendant 5 min à 200 x g et éliminer le surnageant par aspiration.
  8. Ajuster les cellules à 2 x 107 cellules/mL dans le RPMI 1640 additionné de 10 % FCS, 1 % pénicilline/streptomycine, des acides aminés non essentiels 100 mM, 1 mM sodium pyruvate et 50 mM β-mercaptoéthanol (37 ° C) et remplissage 1 mL de la suspension de cellules dans un tube de 5 mL.
    Remarque : Le β-mercaptoéthanol est employée pour lutter contre le stress oxydatif.
  9. Stimuler les cellules en ajoutant 32,4 nM PMA et 1 µM ionomycine. Puis incuber les cellules pendant 16 h à 37 ° C et 5 % de CO2 avec le couvercle du tube ouvert (pour éviter toute contamination, un film d’étanchéité perméable à l’air peut être utilisé).
    Remarque : Pour réduire le niveau de stress, les cellules peuvent être reposés pendant 1 h à 37 ° C et 5 % de CO2 dans l’incubateur avant le 16 h de stimulation.

3. fixation, lyse cellulaire et le cisaillement de la chromatine

Remarque : Les échantillons des patients et des cellules Jurkat sont fixes et lysées avec un kit puce commercialement disponible selon les instructions du fabricant avec modifications comme décrit plus haut7. La fixation est réalisée sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer un tube de 1,5 mL avec 1 mL de 37 % de formaldéhyde, un tube de 1,5 mL avec 1 mL de 1,25 M glycine, un tube de 5 mL avec 4 mL de solution 1 PBS x et une boîte avec de la glace pour la fixation des cellules.
  2. Après la stimulation des cellules pour le temps d’incubation respectifs à l’étape 1.5 ou 2,9, tourner les tubes de 5 mL à 200 x g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS dans les tubes de 5 mL.
  3. Ajoutez le 340 µM formaldéhyde (13,5 µL de 37 % de formaldéhyde) aux cellules. Après avoir mélangé brièvement en pipettant également soigneusement, monter et descendre incuber la suspension pendant 2,5 min (cellules Jurkat) ou 5 min (échantillon) à température ambiante.
    NOTE : Temps de fixation prolongée est nécessaire pour les cellules primaires assurer une tonte optimale.
  4. Ajouter une glycine de 125 mM (57 µL de glycine de 1,25 M) pour arrêter la fixation et incuber pendant un autre 5 min. mettre les cellules sur la glace immédiatement après et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant par aspiration.
  5. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS glacée à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant de chaque fois par aspiration.
    Remarque : Après la fixation, le protocole peut être suspendu. Les cellules fixes doivent être conservés à-80 ° C. Pour vérifier, si l’épitope de l’anticorps destiné à utiliser dans le protocole suivant n’est pas masqué par l’intermédiaire de fixation, échantillons supplémentaires peuvent être utilisés pour l’analyse par électrophorèse SDS-PAGE et Western blot. Ces étapes sont effectuées avec 100 µg de protéines selon les instructions du fabricant. Tous les anticorps αNFAT2 sont utilisés à une dilution de 1/1000, l’anticorps GAPDH à une dilution de 1 : 10000. Une image exemplaire d’échantillons fixes de cellules Jurkat avec anticorps appropriés et inappropriés est illustrée à la Figure 2.
  6. Resuspendre le culot cellulaire dans 5 mL de tampon de lyse commercialement disponible 1 par pipetage de haut en bas. Ensuite, placer les échantillons sur la glace sur un agitateur et les incuber pendant 10 min et en agitant.
    Remarque : Avant de lyse, les cellules peuvent être désintégrées pendant 10 s dans l’azote liquide. Ceci est utile pour les cellules Jurkat mais doit être évitée dans les échantillons de patients primaires. Pour la désintégration, placer les tubes de 5 mL pour 5 s dans 5-10 mL d’azote liquide dans un récipient spécifique. Porter des lunettes de protection et des gants de sécurité qui s’imposent.
  7. Par la suite, centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec soin par pipetage.
  8. Homogénéiser les cellules dans 5 mL de tampon de lyse commercialement disponible 2 par pipetage de haut en bas et incuber pendant 10 min sur glace et en agitant. Centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C, puis retirez le surnageant avec soin par pipetage.
  9. Resuspendre le culot dans 500 µL (cellules Jurkat) ou 140 µL (échantillons de patients) de cisaillement tampon 1 contenant 1 x inhibiteur de la protéase (5 µL ou 1,4 µL, respectivement) et incuber le mélange pendant 10 min sur la glace.
  10. Pour la tonte de la chromatine, transférer 140 µL de la suspension de cellules de l’étape 3,9 dans des tubes de sonicateur (éviter les bulles d’air et répéter cette étape si nécessaire en raison du volume de l’échantillon). Placer les tubes dans le sonicateur-ultra ciblée à une température de 7 ° C et de cisaillement pendant 10 min (lignée cellulaire) ou 7,5 min (échantillons de patients) avec une puissance incidente de 9.375 W pour obtenir des fragments d’ADN bp 200-500.
  11. Enfin, centrifuger à 15700 x g pendant 10 min à 4 ° C dans la petite centrifugeuse et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  12. Pour tester les tailles appropriées fragment, analyser 20 µL de la chromatine cisaillée par électrophorèse en gel d’agarose TBE à 1,5 %. Une image exemplaire de la chromatine cisaillée de cellules Jurkat de bonne et de mauvaise qualité est illustrée à la Figure 3. À ce stade, le protocole peut être potentiellement suspendu. La chromatine cisaillée doit être conservée à-80 ° C.

4. immunoprécipitation de la chromatine

Remarque : L’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée avec un kit puce commercialement disponible selon les instructions du fabricant avec modifications7.

  1. Calculer le nombre d’immunoprécipitation (70 µL (cellules Jurkat) ou 15 µL (échantillons de patients) de la chromatine cisaillée plus un anticorps) et préparer 20 µL de perles A enduit protéique par précipitation dans un tube de 1,5 mL. Laver les perles dans 40 µL de 1 x puce mémoire tampon 1 par précipitation de pipetage de haut en bas, laissez les billes reposent dans une grille magnétique pour 1 min et retirer le surnageant de pipetage. Effectuez cette étape quatre fois au total. Par la suite, remettre en suspension les perles dans le volume original avec tampon de puce 1 x 1.
  2. Pour l’immunoprécipitation elle-même, utilisez 10 µg de l’anticorps αNFAT2 (7 a 6) pour capturer NFAT2 avec ses séquences de cible lié. Utiliser 2,5 µg d’un anticorps de type IgG de lapin (DA1E) comme un contrôle des IgG. Préparer les réactions en tubes fraîches 1,5 mL comme indiqué dans le tableau 1.
    Remarque : Il est important d’utiliser un anticorps monoclonal avec une haute affinité dont épitope n’est pas masqué durant la fixation de ce protocole. Des anticorps polyclonaux introduisent un niveau supplémentaire de variation rendant beaucoup plus difficile d’interpréter correctement les résultats acquis.
  3. Incuber le mélange de l’étape 4.2 toute la nuit à 4 ° C sur une roue rotative à 6 tr/min.
  4. Sur la prochaine journée tourner les tubes pendant 5 s au x 7 000 g dans la petite centrifugeuse, les incuber dans un rack magnétique pendant 1 min et retirer le surnageant par aspiration. Laver les billes une fois avec chacune des tampons lavage 1, 2, 3 et 4 consécutivement.
  5. Pour ce faire, remettre en suspension les perles dans 350 µL de tampon de lavage et les incuber pendant 5 min à 4 ° C sur une roue rotative à 6 tr/min.
  6. Par la suite, faire tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse. Ensuite, les placer pendant 1 min dans une grille magnétique, éliminer le surnageant et ajouter le tampon de lavage suivant.
  7. Après le dernier lavage, éliminer le surnageant par pipetage, prendre les perles dans 100 µL de tampon d’élution 1 et les incuber 30 min sur une roue rotative à 6 tr/min.
  8. Faites tourner les tubes peu (5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse) et placez-les dans une grille magnétique pendant 1 min.
  9. Ensuite, transférer le surnageant en pipettant également, dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajouter 4 µL de tampon d’élution 2.
  10. Pour créer le contrôle d’entrée, mélanger 1 µL de la chromatine cisaillée avec 99 µL d’élution tampon 1 et 4 µL de tampon d’élution 2 (dans cette configuration, il y a trois tubes par patient : une entrée de contrôle, un contrôle des IgG et un échantillon de αNFAT2).
  11. Incuber les échantillons pendant 4 heures à 65 ° C et 1300 tr/min dans un shaker de tube de 1,5 mL. Ajouter 100 µL de 100 % isopropanol, vortex et un essorage les échantillons pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse.
  12. Remettre en suspension les billes magnétiques disponibles au fond de Vortex, ajouter 10 µL des perles à chaque échantillon et incuber pendant 1 heure à température ambiante sur une roue rotative à 6 tr/min.
  13. Après l’incubation, tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifuger et placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique. Retirez le surnageant par aspiration.
  14. Remettre en suspension les perles dans 100 µL de tampon de lavage 1. Il faut inverser les tubes pour mélanger et laisser incuber 5 min à température ambiante sur une roue rotative à 6 tr/min.
  15. Faites tourner les tubes pendant 5 s au x 7000 g dans la petite centrifugeuse, placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique et éliminer le surnageant de pipetage. Répétez les étapes 4.13-4.14 avec tampon de lavage 2.
  16. Par la suite, retirer le tampon de lavage par aspiration, remettre en suspension les perles dans 55 µL de tampon d’élution et incuber pendant 15 min à température ambiante sur la roue en rotation à 6 tr/min pour éluer l’ADN précipité. Enfin, faites tourner les tubes pendant 5 s au x 7000 g dans la petite centrifugeuse, placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique et transvaser le surnageant dans nouveaux tubes de 1,5 mL.
    NOTE : Ici le protocole peut être potentiellement suspendu. L’ADN éluée doit ensuite être conservé à-20 ° C.

5. détection de gènes cibles NFAT dans les cellules CLL.

  1. Mener la réaction qRT-PCR en double pour chaque échantillon, comme indiqué dans le tableau 2.
    Remarque : Pour la détection des gènes cibles un Real-time PCR quantitative (qRT-PCR) est pratiquée au moyen d’un mélange de qRT-PCR disponibles dans le commerce avec un appareil de PCR en temps réel.
  2. Plaques 96 puits réaction d’utilisation blanc pour les réactions et l’instrument de RT-PCR. Les conditions de cyclisme sont comme suit : 95 ° C pendant 30 s, [95 ° C pendant 5 s, 60 ° C pendant 30 s] x 40 cycles.
    Remarque : Une dilution en série de l’entrée (pur ou dilué 01:10, 1/100 et 1/1000 dans de l’eau exempte de nucléase) sert à calculer l’enrichissement relatif. Dans les cellules Jurkat, IL-2 a été utilisé comme un contrôle positif de32. CD40L, un objectif bien connu de NFAT2 dans les cellules de B, a été utilisé comme témoin positif dans les cellules CLL et LCK à titre d’exemple pour un gène de la nouvelle cible de NFAT2 en CLL33,,34. Les amorces pour la région du promoteur CD40L, l’il-2 et LCK sont décrites dans le tableau des réactifs spécifiques et du matériel.

6. normalisation et analyse des données

Remarque : L’enrichissement relatif pour les régions promotrices des intérêts (IL-2, CD40L ou LCK) est calculé en utilisant le contrôle des IgG normalisation.

  1. Tout d’abord, déterminer des valeurs de Ct (cycle seuil) pour la dilution en série d’entrée, IL-2, CD40L et la région du promoteur LCK via le logiciel d’évaluation de données qRT-PCR.
  2. Définir une courbe d’étalonnage pour les concentrations par l’intermédiaire de la dilution en série de l’entrée. Avec cette courbe d’étalonnage, calculer la concentration de l' IL-2, CD40L et la région du promoteur LCK chaque duplicata de chaque échantillon.
  3. Puis, calculez la moyenne des doublons. Ensuite, définissez l’échantillon d’immunoprécipitation IgG comme référence. Qualifier l’enrichissement relatif à cet exemple 1.0 et comparer l’autre échantillon (à partir de l’immunoprécipitation de la NFAT2) à cette référence.
  4. Enfin, calculer l’enrichissement relatif en divisant la concentration des échantillons par la concentration de la référence d’IgG.

Résultats

La figure 1 montre une analyse en cytométrie en flux exemplaire d’un patient CLL effectué après le marquage avec des anticorps CD19-FITC et CD5-PE. Figure 1 a montre le blocage des lymphocytes, représentant la majorité des cellules dans le sang des patients atteints de LLC. Figure 1 b montre la proportion de CD19+/CD5+ CLL cellules, qui représentent 89.03 % des lymphocyt...

Discussion

Les étapes cruciales d’effectuer une analyse réussie de la puce sont la sélection d’un anticorps approprié et l’optimisation de la chromatine processus25de cisaillement. La sélection de l’anticorps αNFAT2 s’est avérée particulièrement difficile lors de l’élaboration du présent protocole. Bien qu’il existe plusieurs anticorps αNFAT2 disponibles dans le commerce et la majorité de ces oeuvres fines pour éponger occidental et d’autres applications, clone 7 a 6 a été le ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la DFG accorder MU 3340/1-1 et la Deutsche Krebshilfe accordent 111134 (tous deux attribués à M.R.M.). Nous remercions Elke Malenke excellente assistance technique).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyde p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Sample BufferThermo ScientificB0007
Anti-NFAT2 antibodyAlexis1008505Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibodyCell Signaling8032SClone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP GradeAbcamab2796Clone 7A6
big CentrifugeEppendorf5804RCan be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-humanBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburCan be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Gel Transfer DeviceThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular sizeThermo ScientificIB23001
iDeal ChIp-seq kit for HistonesDiagenodeC01010059
Ionomycin calcium saltSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mgLI-COR Biosciences925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging SystemLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche4729692001Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 AFA-grade waterCovaris520101
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Magnetic rack, DynaMag-15 MagnetThermo Scientific12301DCan be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100XThermo Scientific11140050
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Neubauer improved counting chamberKarl Hecht GmbH &            Co KG40442012Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
Nuclease-free waterPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-wellThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicillin/Streptomycin 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor region forwardSigma Aldrich5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forwardSigma Aldrich5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forwardSigma Aldrich5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverseSigma Aldrich5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype ControlCell Signaling# 3900SClone DA1E
Real-time PCR instrumentRocheLightCycler 480Can be substituted with similar instruments
Roller mixersPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Can be substituted with similar instruments
small CentrifugeThermo ScientificHeraeus Fresco 17Can be substituted with similar instruments
Sodium PyruvateThermo Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling#12498
Trypan Blue solutionSigma Aldrich93595-50ML

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