Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Résumé

En raison de la teneur élevée en lipides, le tissu adipeux a été difficile à visualiser à l’aide des méthodes histologiques traditionnelles. Adipo-Clear est un tissu technique qui permet l’étiquetage robuste et une imagerie de fluorescence volumétrique du tissu adipeux de compensation. Nous décrivons ici les méthodes de préparation des échantillons, prétraitement, la coloration, la compensation et montage pour l’imagerie.

Résumé

Le tissu adipeux joue un rôle central dans l’homéostasie énergétique et la thermorégulation. Il est composé de différents types d’adipocytes, comme précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, fibroblastes, les vaisseaux sanguins et les projections nerveuses. Bien que le contrôle moléculaire de précision du type de cellule et de l’interaction de ces cellules ont été délimitées de plus en plus, une compréhension plus approfondie de ces cellules résidentes adipeux est possible en visualisant leur distribution et leur architecture tout au long du tissu entier. Approches existantes d’immunohistochimie et immunofluorescence pour analyser l’histologie adipeuse s’appuient sur des coupes minces de paraffine. Toutefois, des coupes minces ne capturent qu’une petite partie du tissu ; en conséquence, les conclusions peuvent être biaisées par quelle partie du tissu est analysée. Nous avons donc développé un technique de compensation Adipo-Clear, afin de permettre une visualisation en trois dimensions complète des modèles moléculaires et cellulaires dans les tissus adipeux tout le tissu adipeux. Adipo-Clear est une adaptation d’iDISCO / iDISCO +, avec des modifications spécifiques apportées à supprimer complètement les lipides stockés dans les tissus tout en préservant la morphologie tissulaire native. En combinaison avec la microscopie en fluorescence lumière-feuille, nous démontrons ici l’utilisation de la méthode Adipo-Clear pour obtenir des images haute résolution volumétriques d’un tissu adipeux ensemble.

Introduction

Jusqu'à tout récemment, le tissu adipeux a été conçu comme une collection amorphe de cellules graisseuses. Dans les dernières décennies, notre compréhension s’est développée plus sophistiquée, avec de la graisse, maintenant reconnue comme un organe complexe contenant différents types d’adipocytes, ainsi que les précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, les fibroblastes, la vascularisation et projections nerveuses. Interactions entre ces cellules résidentes adipeux ont des effets marqués sur le tissu adipeux et organismique physiologie et physiopathologie¹. Bien que les nouvelles études ont démêlé importants mécanismes moléculaires de certaines interactions, une compréhension plus globale requiert un profilage structurelle fiable du tissu tout en trois dimensions (3D).

Nos connaissances actuelles de la morphologie du tissu adipeux est largement basée sur l’analyse histologique des sections minces (5 μm) avec l’imagerie relativement fort grossissement (plus de 10 X)^2,3. Toutefois, cette approche présente plusieurs limites importantes. Tout d’abord, complexes de structures filamenteuses comme les nerfs sympathiques et le système vasculaire, qui sont connus pour jouer un rôle important dans le tissu adipeux fonction^4,5,6,7, sont difficiles à évaluer par le biais de coupes minces. Deuxièmement, en raison de sa forme apparemment amorphe et le manque d’unités structurales représentatifs de se concentrer sur, il est difficile d’apprécier le tissu adipeux structures basées uniquement sur la section coloration. En troisième lieu, le tissu adipeux a une teneur très élevée en lipides, en créant des défis dans l’obtention des coupes sériées cohérentes qui se prêtent à une reconstruction anatomique 3D, une méthode conventionnelle utilisée pour étudier le cerveau entier morphologie⁸. Compte tenu de ces facteurs, il y a un grand besoin d’une approche toute monture qui peut fournir une visualisation 3D d’un dépôt de tissu adipeux ensemble tout en permettant la résolution cellulaire.

L’imagerie volumétrique 3D d’un organe entier est difficile en raison des effets masquant des nuages de points lumineux. Une source majeure de facteur de diffusion dans les tissus biologiques provient d’interfaces lipide aqueux. Bien que les efforts pour éliminer les nuages de points en supprimant les lipides ont été en cours pendant plus d’un siècle, on a un grand nombre de ces dernières innovations⁹. Une de ces méthodes nettoyage des tissus nouvellement développée est imagerie 3D compatible immunomarquage des organes cote de solvant (iDISCO / iDISCO +)^10,11. Cependant, le tissu adipeux représente un défi particulier compte tenu de son niveau élevé de lipides et par conséquent, des modifications supplémentaires à l’iDISCO / iDISCO + protocole sont requis pour extraire complètement les lipides tout en protégeant le tissu de s’effondrer. Le protocole modifié, que nous avons mis au point, maintenant appelé Adipo-Clear, emploie méthanol/à base de dichlorométhane délipidation du tissu adipeux à une transparence optimale convenant à haute résolution d’imagerie volumétrique¹². Parce que la délipidation étape désaltère exprimés en grande partie les protéines fluorescentes comme GFP et DP, visualisation de ces protéines doit être atteint par immunomarquage. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué pour étudier l’organisation tissulaire au niveau des cellules résidentes adipeux, traçage de la lignée de cellules progénitrices adipocytaire et morphogenèse adipeuse au cours du développement.

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Protocole

Expérimentation et protection des animaux ont été réalisés selon les procédures approuvées par la Commission institutionnelle animalerie et utilisation à l’Université Rockefeller.

1. préparation du tissu

1. Effectuer une perfusion intracardiaque standard avec environ 20 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C jusqu'à ce que le sang est complètement retiré du tissu.
2. Lancez le perfusat à ~ 20 mL de solution de fixation (4 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x) à 4 ° C jusqu'à ce que le cou et la queue ont considérablement durcie.
   ATTENTION : PFA est toxique. Éviter tout contact avec la peau, des yeux et des muqueuses. Solutions se référera à l’intérieur d’une hotte aspirante.
3. Disséquer les coussinets adipeux d’intérêt soigneusement pour retirer le coussin de graisse entière sans l’endommager. Utiliser les pinces émoussé-terminée afin d’éviter le coincement ou l’écrasement le tissu. Éviter de contaminer le tissu découpé avec une fourrure.
4. Fixer le tissu en 4 % PFA dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C. Pour chaque grosse garniture, fixer avec environ 10 mL de solution de fixation dans un tube conique de 15 mL.
5. Laver le tissu 3 fois (1 h) avec du PBS 1 x à température ambiante (RT).
6. Stocker les tissus pour à court terme (jusqu'à 2 semaines) dans du PBS 1 x à 4 ° C et l’abri de la lumière. Pour le stockage à long terme (p. ex., 1-2 ans), placez-vous dans la mémoire tampon 1 x PBS avec 0,05 % d’azide de sodium (comme agent de conservation).
   ATTENTION : L’azoture de Sodium est très toxique si ingéré par voie orale ou absorbé par la peau. Concentré d’azide de sodium (à 5 % ou plus) des solutions doivent être manipulées sous une hotte aspirante.

2. délipidation et perméabilisation

Calendrier: 1-2 jours

1. Préparer les 20 %, 40 %, 60 % et 80 % méthanol gradient avec tampon B1n (tableau 1) (v/v), par exemple, pour le tampon de 20 % de méthanol/B1n, mélangent 20 mL de méthanol et 80 mL de tampon B1n. Stocker tous les tampons à 4 ° C. Cristaux de glycine précipitera de tampons de méthanol/B1n 60 % et 80 % en raison de la saturation. Éviter de supprimer les cristaux ; utiliser la solution liquide pour les lavages suivants.
   ATTENTION : Le méthanol est volatile, inflammable et irritant. Éviter le contact cutané ou oculaire.
2. Retirez doucement les cheveux de l’échantillon sous un microscope à dissection. Tout cheveux, peluches ou des débris, jointe à l’échantillon entraînera des ombres au cours de l’imagerie. Transférer l’échantillon nettoyé dans un nouveau tube.
3. Exécutez toutes les étapes suivantes sur la glace ou à 4 ° C sauf indication contraire. Pour petits échantillons (par exemple, postérieurs coussinets adipeux sous-cutané/perigonadal des jeunes souris maigres), utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de la solution. Pour les grands échantillons ou échantillons avec teneur élevée en lipides (par exemple, les coussinets adipeux chez des souris obèses), utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de la solution.
   1. Placer les tubes contenant les échantillons horizontalement dans un agitateur orbital à ~ 100 tr/min. Veillez à ce que les échantillons peuvent circuler librement à l’intérieur du tube.
4. Déshydrater l’échantillon dans une série graduée de 20 %, 40 %, 60 %, 80 % et 100 % méthanol/B1n tampon pour l’heure indiquée (tableau 2). Minimiser la solution de report.
5. Delipidate l’échantillon avec 100 % de dichlorométhane (DCM) (3 fois), chacune avec le temps d’incubation indiqués dans le tableau 2. L’échantillon doit couler au fond du tube à la fin des deuxième et troisième DCM lavages. Si non, prolonger le temps d’incubation pour assurer la délipidation complet (par exemple, s’étendent de 30 min à 1-2 h).
   ATTENTION : DCM devrait être manipulé à l’intérieur d’une hotte aspirante. Utilisez des récipients de verre pour tubes de microcentrifuge de stockage et de qui sont faits de polypropylène pour des incubations. Les tubes de microcentrifuge ne doivent pas être utilisés pour le stockage à long terme de DCM. Boîtes de Pétri et pipettes sérologiques qui sont faits de polystyrène ne sont pas compatibles avec du DCM. DCM est très volatil. Transférer l’échantillon dans une solution fraîche rapidement pour éviter la dessiccation.
6. Laver deux fois avec 100 % de méthanol pour l’heure indiquée (tableau 2).
7. Facultatif : Si l’échantillon n’est pas bien irrigué, la couleur de l’hémoglobine des globules rouges restants risquent fort autofluorescence. Eau de Javel 5 % H₂O₂ dans le méthanol (1 volume de 30 % H₂O₂ à 5 volumes de méthanol) durant la nuit à 4 ° C.
8. Réhydrater l’échantillon dans une série de tampons de méthanol/B1n inversé : 80 %, 60 %, 40 %, 20 % méthanol/B1n et 100 % B1n tampon (2 fois) pour l’heure indiquée (tableau 2).
9. Laver l’échantillon avec tampon de PTxwH (tableau 1) pendant 2 h à température ambiante.
10. Conserver l’échantillon délipidée dans PTxwH tampon à 4° C (jusqu'à 1 an) ou procéder immédiatement à l’étape de l’immunohistochimie.

3. toute monture Immunostaining

Calendrier: 8-10 jours

Remarque : Toutes les étapes suivantes devraient être effectué à ta sauf indication contraire, avec agitation et de la protection contre la lumière. Pour petits échantillons, utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de solution. Pour les grands échantillons, utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de solution. Il est recommandé de d’abord valider les anticorps sur des petits morceaux du tissu ou des sections de tissu imprégnées par le méthanol.

1. Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de PTxwH à la concentration recommandée. Centrifuger la solution d’anticorps dilué à ~ 20 000 x g pendant 10 min empêcher la présentation précipités anticorps ou agrégations.
2. Incuber l’échantillon délipidée avec la solution d’anticorps primaire pour l’heure indiquée (tableau 2).
3. Laver l’échantillon avec le tampon de PTxwH dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h et Pendant la nuit.
4. Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de PTxwH à la concentration recommandée. Centrifuger la solution d’anticorps dilué à ~ 20 000 x g pendant 10 min empêcher la présentation précipités anticorps ou agrégations.
   Remarque : Pour éviter de fond élevé causé par autofluorescence tissu, Anticorps secondaires conjugués avec des fluorophores qui émettent de la lumière dans les régions rouges et rouge sombre sont recommandés. Selon le nombre de lignes laser disponibles sur un microscope, jusqu'à 3-4 marqueurs peut être photographiée simultanément sur un seul échantillon.
5. Incuber l’échantillon avec la solution d’anticorps secondaire pour l’heure indiquée (tableau 2).
6. Échantillon de lavage avec PTxwH tampon non contrôlé dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h et Pendant la nuit.
7. Facultatif : Pour les types de tissus qui sont fragiles, fixez le tissu taché avec 4 % PFA en solution 1 PBS x nuit à 4 ° C pour aider à préserver la morphologie tissulaire.
   Remarque : Cette étape peut augmenter fond d’imagerie. Il n’est pas nécessaire d’effectuer cette étape pour le tissu adipeux.
8. Laver l’échantillon avec du PBS 1 x dans une série d’étapes d’incubation : 5 min, 10 min et 30 min.
9. Retirez délicatement les peluches de l’échantillon sous un microscope à dissection.

4. tissu Clearing

Calendrier: 1-2 jours

1. Facultatif : Intégrer l’échantillon dans l’agarose pour faciliter le montage des échantillons pour la microscopie de lumière-feuille.
   Remarque : Cette étape est fortement recommandée pour les tissus adipeux afin de stabiliser sa forme en imagerie.
   1. Préparer la solution encastrement avec 1 % d’agarose dans 1 x PBS (p/v). Refroidir la solution encastrement à ~ 40 ° C pour éviter d’exposer l’échantillon à une chaleur excessive.
   2. Placer l’échantillon nettoyé dans un moule(par exemple, boîte de Pétri ou pesage bateau) et l’arranger dans la position souhaitée. Éviter tout report de liquide. Verser doucement la solution encastrement sur l’échantillon. Éviter les bulles d’air.
   3. Laissez l’agarose entièrement solidifier à RT. Cut out un bloc contenant l’échantillon.
      Remarque : Toutes les étapes suivantes, y compris des incubations durant la nuit devraient être exécuté à RT, et à secouer et protection contre la lumière. Pour petits échantillons, utiliser des tubes de microcentrifuge de 2 mL avec 1,6 mL de solution. Pour les grands échantillons, utiliser des tubes de 5 mL avec 4 mL de solution.
2. Déshydrater l’échantillon en gradient de méthanol avec H₂o : 25 %, 50 %, 75 % et 100 % (3 fois) pour l’heure indiquée (tableau 2).
   Remarque : Échantillon peut être laissé toute la nuit à l’étape de 100 % de méthanol.
3. Incuber l’échantillon dans DCM de 100 % pendant 1 h avec agitation (3 fois). Échantillon doit couler au fond du tube à la fin de chaque lavage de DCM. Si ce n’est pas le cas, prolonger le temps d’incubation pour assurer l’élimination complète du méthanol. Échantillon peut être laissé toute la nuit à l’étape de DCM 100 %.
4. Incuber pendant la nuit l’échantillon dans l’éther de dibenzyle (DBE) sous agitation légère pour atteindre correspondant à l’indice de réfraction.
   Remarque : Échantillon finira par devenir transparent de lumière visible.
   ATTENTION : DBE est dangereux. Eviter tout contact avec la peau. Le manipuler à l’intérieur d’une hotte avec des gants double couche. Jeter les gants dès qu’il est contaminé par DBE. Utilisez des récipients de verre pour le stockage et microcentrifugeuse tubes (polypropylène) pour des incubations. Les tubes de microcentrifuge ne doivent pas être utilisés pour le stockage à long terme de la deb. Boîtes de Pétri et pipettes sérologiques qui sont faits de polystyrène ne sont pas compatibles avec deb. Nettoyer tout déversement avec 100 % d’éthanol.
5. Incuber l’échantillon avec DBE fraîche légère secousse pendant 2 h. magasin l’échantillon à la droite dans l’obscurité ou passer directement à l’imagerie.
   Remarque : Les échantillons sont recommandés pour être photographié dans un mois. Bien que certains fluorophores sont plus stables que d’autres, un stockage à long terme des échantillons à ce stade n’est pas recommandé.

5. microscopie

1. Création d’images avec un microscope de lumière-feuille qui est compatible avec deb.
   Remarque : Seuls les objectifs qui sont approuvés pour l’imagerie à base de solvants organique et mis en correspondance avec l’indice de réfraction de la deb utilisable comme trempage objectifs en imagerie DBE immergés.
   1. Monter l’échantillon d’agarose incorporés sur un support qui peut empêcher tout mouvement pendant la formation image. Plongez l’échantillon dans une chambre remplie de DBE.
   2. Recueillir une z-pile couvrant l’ensemble de l’échantillon (par exemple, un grossissement de X 1-2) pour obtenir l’ensemble des tissus/structure de distribution du marqueur d’intérêt.
   3. Basculer vers un objectif avec un grossissement supérieur (p. ex., un grossissement de X 4-12) pour zoomer sur les régions d’intérêt à l’image des structures détaillées.
      Remarque : Le collagène est un contributeur majeur à la matrice extracellulaire du tissu adipeux, qui entoure les cellules graisseuses¹³. Collagène a un spectre d’émission typique allant vers 400 nm et 550 nm¹⁴. Imagerie de l’échantillon avec la ligne 488 laser (verte) et la collecte de la lumière émise à une plage de longueur d’onde qui se situe dans le spectre d’émission du collagène (p. ex., 525-550 nm) donnera le signal d’autofluorescence tissu, qui a déjà été démontré à délimiter le contour adipocyte et globale d’architecture tissulaire¹².
2. L’imagerie avec une inversée confocale ou un microscope biphotonique.
   1. Place l’échantillon d’agarose incorporé dans une diapositive de chambre avec un fond de verre sans toucher les pièces en plastique (ou autre chambre d’imagerie DBE-compatible qui peut sceller). Assurez-vous que DBE ne fuit pas.
   2. Choisissez des objectifs avec des distances de travail plus longues pour atteindre une pénétration plus profonde.
      Remarque : Imagerie devrait être fait avec un microscope confocal ou deux photons inversé à travers le fond de verre de la diapositive de la chambre. Évitez tout contact direct entre l’échantillon et le trempage des objectifs qui ne sont pas suggérés pour imagerie DBE.

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Résultats

Adipo-Clear préparé toute graisse tampons peuvent être photographiées en 3D pour analyser comment les interactions de tissu cellulaire et de morphologie sont affectées dans les États de maigres et obèses. Cette méthode peut être facilement appliquée pour analyser la structure adipeuse générale en recueillant le tissu autofluorescence signal dans le canal vert. Nous avons montré précédemment que l’autofluorescence signal en superpositions adipeuses favorablement avec peril...

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Discussion

Adipo-Clear est une méthode simple et robuste pour dégager le tissu adipeux, qui peut être facilement effectué dans une configuration de laboratoire réguliers. En comparaison avec d’autres méthodes de nettoyage à base de solvants tels qu’iDISCO / iDISCO +^10,11,12, Adipo-Clear est particulièrement optimisé pour dégager le tissu adipeux et autres tissus à haute teneur en matières grasses. L’étape de délipidatio...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270991
Hydrogen peroxide 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzyl ether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Sodium azide	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1	R&D Systems	AF3628	Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber	ibidi	80287
Light sheet microscope	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Imaging software	LaVision BioTec	Imspector software
Microscopy visualization software	Bitplane	Imaris