Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

Résumé

Nous présentons ici les protocoles utilisant les insectes cellulaire et baculovirus protein expression pour produire de grandes quantités de protéines végétales sécrétée de cristallisation de protéines. Un vecteur d’expression baculovirus a été modifié par GP67 ou peptide signal hemolin insectes pour expression plante de sécrétion des protéines dans des cellules d’insecte.

Résumé

Il a été un défi pour les scientifiques exprimer les protéines eucaryotes sécrétoires recombinantes pour les études structurales et biochimiques. Le système d’expression baculovirus insectes cellulaire est l’un des systèmes utilisés pour exprimer les protéines sécrétoires eucaryotes recombinantes avec quelques modifications post-traductionnelles. Les protéines sécrétoires doivent être acheminés à travers les voies sécrétrices de la glycosylation des protéines, la formation de liaisons disulfure et autres modifications post-traductionnelles. Pour améliorer l’expression cellulaire insectes existants des protéines végétales sécrétoire, un vecteur d’expression baculovirus est modifié par l’ajout de soit un GP67 ou une séquence de peptide signal de hemolin entre le promoteur et le clonage de plusieurs sites. Ce système nouvellement conçu vecteur mis à jour le produit avec succès un rendement élevé de protéines réceptrices plante sécrétées recombinantes solubles d’Arabidopsis thaliana. Deux des protéines végétales exprimées, les domaines extracellulaires de récepteurs de la membrane plasmique d’Arabidopsis TDR et PRK3, ont été cristallisés pour les études de diffraction des rayons x. Le système mis à jour le vecteur est un outil amélioré qui est potentiellement utilisable pour l’expression de protéines recombinantes de sécrétion dans le règne animal ainsi.

Introduction

Il est impératif pour un laboratoire de recherche être capable de produire de grandes quantités de protéines recombinantes homogènes pour les caractérisations biochimiques et biophysiques, surtout pour les études de diffraction des rayons x. Il existe plusieurs systèmes d’expression hétérologue bien établies telles que Escherichia coli, levure, cellules d’insectes, des cellules de mammifères, les cellules végétales, etc. , parmi eux, le système d’expression baculovirus insectes cellulaire est un des plus couramment utilisé des techniques pour produire de grandes quantités de structurellement pliés grosses eucaryotes protéines recombinantes pour la cristallisation de protéines¹.

Les vecteurs d’expression du système baculovirus expression sont conçus pour contenir un polyédrine fort ou un promoteur de P10 pour produire un rendement élevé de protéines intracellulaires recombinantes^2,3. Pour faire un baculovirus recombinant, le gène d’intérêt est cloné dans un insecte vecteur contenant le locus polyédrine (Paolo) du génome Autographa californica multi-nucleopolyhedroviral. La construction qui en résulte est ensuite séquencée et son cadre de lecture ouvert correcte (ORF) est vérifié. La construction correcte est ensuite introduite dans la cellule d’insecte hôte à travers le processus de la transfection. Le gène d’intérêt est inséré dans le génome viral par recombinaison homologue. Cet événement donne lieu à la production du génome viral recombinant, qui réplique puis sur produire recombinant ont bourgeonné de particules de virus¹.

Les cellules d’insectes qui sont plus couramment utilisés dans le système d’expression sont des cellules (Hi5) cinq Sf9 et haute. Les cellules SF9 sont un isolat clonal de Sf21, dérivé des pupes cellules ovariennes de Spodoptera frugiperda, et Hi5 cellules sont un isolat clonal dérivé le parental Trichoplusia ni cellules ovariennes ligne TN-368^4,5. Transfections Co, amplification des virus et des essais de plaque sont menées sur les cellules Sf9, tandis que les cellules de Hi5 sont typiquement pour produire des quantités plus élevées de protéines recombinantes⁶. Il est à noter que les cellules de Hi5 ne conviennent pas pour la génération et l’amplification des descendances de virus à cause de leur tendance à produire des virus mutants. Traditionnellement, une plage de température de 25-30 ° C est considérée comme bonne pour la culture de cellules d’insectes. Toutefois, il a été signalé que les 27-28 ° C est la température optimale pour la cellule insectes croissance et infection^7,8.

L’introduction d’une séquence signal fort qui précède le gène est nécessaire pour la forte expression des protéines sécrétées. La séquence signal guideraient efficacement la protéine recombinante traduite dans le réticulum endoplasmique pour la sécrétion de protéines et de modifications post-traductionnelles nécessaires à repliement adéquat et de stabilisation³. Séquences de peptide signal, tels que le baculovirus enveloppe protéique GP64/67, abeille mélittine et autres, ont été choisis pour faciliter l’expression de protéines recombinantes sécrétrices dans le systèmes de médiation baculovirus expression³. L’introduction du peptide signal de GP67 s’est avérée d’améliorer le rendement de l’expression d’une protéine recombinante sécrétée, en comparaison à l’aide du peptide signal intrinsèque du gène cible⁹. Hemolin est une protéine de l’hémolymphe de la teigne de soie géante Hyalophora cecropia, induite à bactéries infection¹⁰. En raison du niveau relativement élevé d’expression induite, la séquence de peptide signal du gène peut être utilisée à la médiation de l’expression de la sécrétion des protéines recombinantes dans le système baculovirus-insecte cellule.

L’Arabidopsis trachée élément différenciation inhibitrice facteur du récepteur (TDR) et Pollen Receptor Kinase 3 (PRK3) tous deux appartiennent à la famille de répétition comme récepteur Kinase (LRR-RLK) plante riche en Leucine de protéines^11,12 . Afin d’étudier la structure et la fonction de cette famille de récepteurs des protéines végétales, aussi bien pour en faciliter la caractérisation structurale et biochimique des autres protéines végétales sécrétée, le système d’expression baculovirus-insecte cellule a été modifié à améliorer le rendement de qualité et de la production de protéines. Les domaines extracellulaires de TDR et PRK3 ont été exprimés avec succès dans le système d’expression baculovirus-insect cell à l’aide de deux vecteurs d’expression mis à jour le. Les deux domaines extracellulaires de TDR et PRK3 protéines ont été cristallisés. Cet article rend compte de l’expression et purification de grandes quantités de protéines recombinantes végétale sécrétée avec vecteurs d’expression baculovirus modifié deux en incorporant un GP67 ou une séquence de signaux de hemolin entre le promoteur et le clonage à des fins multiples sites.

Protocole

NOTE : Un système de cellule/baculovirus insectes avec des vecteurs d’expression modifiées pour l’expression de la protéine sécrétoire plante et cristallisation est utilisé.

1. modification d’un vecteur d’Expression Baculovirus avec le Peptide Signal GP67 pour Expression de sécrétion des protéines végétales

1. Synthétiser un fragment d’ADN contenant un 5' BglII coupe site¹³, la séquence de signaux de sécrétion GP67 et un site multi clonage avec NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI et XhoI (Figure 1 a).
   NOTE : Puisque les BglII et BamHI digéré ADN a permis aux mêmes fins adhésifs, le vecteur linéarisé peut ligaturer pour le fragment d’ADN digéré, tandis que les sites BamHI tant BglII dans la séquence de ligature recuite vont être mutés à une séquence qui n’est pas CLIVABLES par BglII ou BamHI¹⁴.
2. Digest 4 µg d’ADN avec BglII et XhoI et 4 µg d’un vecteur d’expression ADN avec BamHI et XhoI¹⁴. Mélanger 10 unités de chaque enzyme de restriction avec l’ADN dans un 1 x tampon de réaction de concentration (acétate de potassium 50 mM, 20 mM Tris-acétate, acétate de magnésium de 10 mM et 100 µg/mL de BSA, pH 7,9 à 25 ° C) et laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 4 h.
   1. Purifier le fragment d’ADN excisé et le vecteur linéarisé ADN par un ADN gel extraction kit¹⁵.
3. Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant 1 x tampon de réaction T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl₂, ATP 1 mM et 10 mM DTT, pH de 7,5 à 25 ° C) et de 5 unités d’ADN T4 ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.
4. Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α suite à un protocole de transformation standard, puis sélectionnez les colonies qui en résulte sur une plaque de gélose LB ampicillin¹⁶. Prendre 5-10 colonies et grandir chaque colonie dans 2 mL de milieu LB contenant 100 ampicilline µg/mL à 220 tr/mn et 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 16 h.
5. Extraire chaque ADN plasmidique avec un DNA miniprep kit¹⁷ et confirmer les clones par séquençage de l’ADN d’une amorce de AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
6. PCR-amplifier le gène TDR a. thaliana fragment encodage résidus 30-642 d’un gène synthétique de TDR construire (avant apprêt : CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, apprêt inverse : GC GGATCC LTC GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplifier l’ADN pour 30 cycles dans un tampon de réaction de polymérase d’ADN contenant un mélange dNTP de 0,5 mM, 0,2 µM élémentaires, 0,1 µg d’ADN, 0,4 mM MgCl₂et 1 unité de réaction de l’ADN polymérase.
   1. Pour les étapes du cycle de PCR, définir la dénaturation initiale à 95 ° C pendant 30 s et puis 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, recuit à 55 ° C pendant 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 1 min, avec une extension finale à 72 ° C pendant 5 min.
7. Digérer le fragment PCR tant le vecteur mis à jour l’avec NotI et BamHI enzymes endonucléases de restriction. Ligaturer le fragment de gène avec le vecteur linéarisé. Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant du tampon de réaction T4 DNA ligase et 5 unités de T4 DNA ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.
8. Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α suite à un protocole de transformation standard, puis sélectionnez les colonies qui en résulte sur une plaque de gélose LB ampicillin¹⁶. Confirmer les clones correctes par séquençage de l’ADN.

2. modification d’un vecteur d’Expression Baculovirus avec le Peptide Signal Hemolin insectes pour Expression de sécrétion des protéines végétales

1. Synthétiser un fragment d’ADN contenant un 5' BglII coupe site¹³, la séquence de signaux de sécrétion insectes hemolin et un site multi clonage avec NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI et XhoI (Figure 1 b).
2. Digest 4 µg d’ADN avec BglII et XhoI et 4 µg d’un vecteur d’expression ADN avec BamHI et XhoI¹⁴. Mélanger 10 unités de chaque enzyme de restriction avec l’ADN dans un 1 x tampon de réaction de concentration (acétate de potassium 50 mM, 20 mM Tris-acétate, acétate de magnésium de 10 mM et 100 µg/mL de BSA, pH 7,9 à 25 ° C) et laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 4 h.
   1. Purifier le fragment d’ADN excisé et le vecteur linéarisé ADN par un ADN gel extraction kit¹⁵.
3. Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant 1 x tampon de réaction T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl₂, ATP 1 mM et 10 mM DTT, pH de 7,5 à 25 ° C) et de 5 unités d’ADN T4 ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.
4. Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α, puis sélectionnez les colonies sur une gélose au ampicilline LB. Prendre 5-10 colonies et grandir chaque colonie dans un milieu LB de 2 mL contenant 100 µg/mL d’ampicilline à 220 tr/mn et 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 16 h.
5. Extraire l’ADN de plasmide avec un DNA miniprep kit¹⁷ et confirmer les clones par séquençage de l’ADN d’une amorce de AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
6. PCR-amplifier a. thaliana Pollen Receptor Kinase 3 (PRK3) fragment du gène codant des résidus 20-237 d’un synthétique PRK3 gène chimère (avant apprêt : CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, apprêt inverse : CGC GGATCC LTC GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplifier l’ADN pour 30 cycles dans un tampon de réaction de polymérase d’ADN contenant un mélange dNTP de 0,5 mM, 0,2 µM élémentaires, 0,1 µg d’ADN, 0,4 mM MgCl₂et 1 unité de réaction de l’ADN polymérase.
   1. Pour les étapes du cycle de PCR, définir la dénaturation initiale à 95 ° C pendant 30 s et puis 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, recuit à 55 ° C pendant 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 30 s au sein de chaque cycle et l’extension finale à 72 ° C pendant 5 min.
7. Digérer le fragment PCR tant le vecteur mis à jour l’avec NotI et BamHI enzymes endonucléases de restriction. Ligaturer le fragment de gène avec le vecteur linéarisé. Mélanger 100 ng du vecteur ADN linéarisé avec 400 ng d’ADN digéré fragment dans un mélange de réaction de ligature de 10 µL contenant du tampon de réaction T4 DNA ligase et 5 unités de T4 DNA ligase. Incuber le mélange réactionnel à 16 ° C pendant 16 h.
8. Transformer 5 µL du mélange ligature dans 100 µL de cellules capables de DH5α suite à un protocole de transformation standard, puis sélectionnez les colonies qui en résulte sur une plaque de gélose LB ampicillin¹⁶. Confirmer les clones correctes par séquençage de l’ADN.

3. la production et l’Amplification de Baculovirus construit nourrissait la Cassette d’Expression de protéine recombinante

1. Utilisez 100 ng de plasmide construct de transformer 40 µL de cellules capables de DH10Bac selon le protocole du système baculovirus expression¹. La transformation incuber à 37 ° C pendant 48 h.
2. Ramasser les deux colonies blanches de chaque plaque de transformation, inoculer chaque colonie dans 2 mL de milieu LB contenant 50 µg/mL kanamycine, gentamicine 7 de µg/mL et 10 tétracycline µg/mL. Suivre le protocole du système expression baculovirus¹ d’extraire et de vérifier la bacmid ADN. Aliquote chaque ADN dans deux tubes avec 20 µL de chaque et stockez les tubes à-20 ° C.
   Remarque : Les étapes suivantes nécessitent une opération aseptique.
3. Atteindre une monocouche de cellules Sf9 dans les antibiotiques pénicilline-streptomycine de milieux de culture avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) à 27 ° C 80 % confluent en une plaque 6 puits. Estimer le pourcentage de confluence basée sur le pourcentage de surface couverte sur la plaque de culture de tissus.
4. Préparer les solutions suivantes dans deux tubes à centrifuger de 1,5 mL stérile.
   1. Tube 1 : Pour chaque transfection, diluer 20 µL de bacmid ADN dans 100 µL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques. Mélanger doucement la dilution en effleurant la paroi du tube.
   2. Tube 2 : Pour chaque transfection, diluer 8 µL de réactif de transfection de lipides dans 100 µL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques. Bien mélanger la dilution par pipetage de haut en bas pour 6 x.
5. Combiner les deux solutions, mélangez-les délicatement en pipettant également lentement de haut en bas pour x 3 et les incuber pendant 20 à 40 minutes à température ambiante.
6. Lavez chaque puits de la monocouche Sf9 cellules 2 x avec 3 mL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques. Pour chaque transfection, ajouter 0,8 mL de milieu de culture cellulaire sans additifs Sf9 sans antibiotiques dans chaque tube contenant le mélange de lipides-ADN. Mélanger doucement le contenu des tubes de pipetage lentement de haut en bas pour 3 x. Aspirer les médias de lavage des plaques et superposer les échantillons avec le mélange de transfection.
7. Après l’ajout du mélange transfection, incuber la plaque transfectée pendant 5 h à 27 ° C. Remplacer les médias de transfection avec le milieu de culture de cellules Sf9 complet contenant 10 % FBS et 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) antibiotiques pénicilline-streptomycine. Incuber la plaque transfectée à 27 ° C, pendant 4 jours.
8. Récolter et amplifier le baculovirus recombinant.
   1. Recueillir le liquide surnageant de la plaque infecté dans un tube conique stérile de 15 mL après 4 jours d’incubation. Faites tourner le surnageant à 1010 x g pendant 5 min éliminer les débris cellulaires. Ignorer le culot et éliminer le surnageant dans un tube propre et conserver à 4 ° C pendant 1 an.
      NOTE : Ceci est le virus P0. Il peut être aliquotés et congelés à-80 ° C pour une plus longue période de temps.
   2. Pour amplifier chaque virus recombinant, poussent une monocouche de cellules Sf9 sur un plat de 150 millimètres au confluent de 80 %. Aspirer les médias de la plaque, ajouter 2 mL du virus P0 à l’adhérent de cellules à la plaque et incuber la plaque dans une étuve à 27 ° C pendant 1 heure. Balancer la plaque toutes les 15 min pour mélanger le milieu avec les cellules.
      1. Ajouter 25 mL de médias de Grace complet contenant 10 % FBS et 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) antibiotiques pénicilline-streptomycine. Incuber les plaques pendant 3 jours dans une étuve à 27 ° C pour obtenir le virus de passage de P1.
   3. Recueillir le liquide surnageant de la plaque infecté dans un tube conique stérile de 50 mL et un essorage à 1010 x g pendant 5 min éliminer les débris cellulaires. Décanter le liquide surnageant dans un tube propre et conserver à 4 ° C pendant 1 an.
      Remarque : Le virus P1 peut être aliquotés et congelés à-80 ° C pour une plus longue période de temps.
   4. Pour amplifier le virus de P1 à P2 passage, cultiver une monocouche de cellules Sf9 sur un plateau de 150 mm à 90 % confluence, aspirer les médias de la plaque, ajouter 2 mL du virus P1 à la plaque et il incuber pendant 1 heure dans une étuve à 27 ° C.
   5. Répétez les étapes 3.8.2 et 3.8.3 pour obtenir les passages P2 et P3 des virus. Ne stockez pas le virus P3 pendant plus de 2 mois.

4. protein Expression, Purification avec NiNTA et cristallisation

1. La culture 1 L de Hi5 cellules d’insectes dans les antibiotiques pénicilline-streptomycine de milieux de culture avec 100 µg/mL (ou 100 UI/ml) à une densité de 2 x 10⁶ à 100 tr/min dans un shaker incubateur de 27 ° C. Tournez en bas les cellules à 570 x g pendant 5 min, éliminer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 20 mL du virus P3 fraîchement produit et gardez-le à température ambiante pour 1 h. agiter doucement le flacon de spin pour remettre en suspension les cellules 1 x toutes les 15 min.
2. Les cellules de transfert à 1 L d’antibiotiques pénicilline-streptomycine 100 µg/mL (ou 100 UI/ml), les milieux de culture, la culture des cellules à 100 tr/min dans un shaker incubateur de 27 ° C pendant 72 h. Spin down les cellules à 1 010 x g pendant 5 min et recueillir le surnageant.
3. Indicateur de pH d’utilisation des bandes pour ajuster le pH du liquide surnageant à 8.0 en ajoutant 0,1 M HCl ou NaOH 0,1 M et ajouter le tampon de liaison à une concentration finale, contenant un tampon Tris 20 mM à pH 8,0, 100 mM NaCl et imidazole de 5 mM. Ajouter une certaine quantité de résine NiNTA (10 à 40 mL) basée sur le rendement estimé de la protéine recombinante His-tag.
   1. Mélanger la solution sur une agitation magnétique avec une vitesse réduite à 4 ° C pendant 1 h. lavage la résine et Éluer la protéine liée suivant le protocole de purification standard NiNTA¹⁸.
4. Sous réserve de la protéine purifiée de l’échange d’ions et la chromatographie par filtration, mais aussi d’autres méthodes de purification des protéines, pour obtenir un échantillon homogène de gel.
   Remarque : Pour le TDR ectodomaine, Tris, 20 mM, pH 8, 100 mM NaCl étaient utilisés comme tampon de gel filtration. Pour l’ectodomaine PRK3, 20 mM bis-Tris, pH 6, 100 mM NaCl servaient de tampon préféré gel filtration.

Résultats

Comme illustré à la Figure 1, deux vecteurs d’expression baculovirus mis à jour le pFastBac1 ont été utilisés pour exprimer les protéines sécrétées avec le GP67 ou la séquence signal hemolin pour remplacer la séquence signal intrinsèque du gène cible. Le GP67 virale et les gènes hemolin insectes ont été démontrés d’avoir des niveaux d’expression de sécrétion élevée dans les cellules. Protéines de fusion avec ou l’autre de ces d...

Discussion

Compte tenu de la diversité dans la taille et de la stabilité des milliers de protéines présentes dans les systèmes biologiques, il est souvent empirique pour une recherche laboratoire de décider quel système d’expression hétérologue doit être choisi pour l’expression d’une protéine spécifique. Le système d’expression e. coli est souvent le premier choix pour l’expression de la protéine en raison du cycle de vie court de la bactérie, le faible coût des milieux de culture et assez facile...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator shaker	VWR	Model Excella E25	27 oC
Incubator	VWR	Model 2005	27 oC
Centrifuge	BECKMAN	Model J-6	with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51	For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler	BIO-RAD	Model C1000 Touch	For PCR amplification of DNA
Incubator shaker	New Brunswick Scientific	Model I 24	For growing baceria culture
Customer DNA synthesis	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Restriction Endonuclease
BglII	New England Biolabs	R0144S	Restriction Endonuclease
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriction Endonuclease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose	Thermo Fisher Scientific	15510-019	For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell	Invitrogen	18-258-012	For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotics
Tetracycline	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotics
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells	Thermo Fisher Scientific	10361-012	For making bacmid DNA
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Baculorirus expression vector
Sf9 cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 monolayer cells
Hi5 cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
FBS Certified	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
6-well plates	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	Flat-bottom
150 mm plates	Thermo Fisher Scientific	353025	100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1475-0511	25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1500-1211	25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA resin
pH-indicator strips	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14