Modèle de rat de capsulite rétractile de l’épaule

Résumé

Ce protocole présente un modèle de rat in vivo de capsulite rétractile. Le modèle inclut une fixation interne de la gléno-humérale conjointe avec fixation de la suture extra-articulaires pendant une période prolongée, aboutissant à une plage de pivotement une diminution de mouvement (ROM) et une augmentation de raideur articulaire.

Résumé

Cette proposition vise à créer un modèle de rat in vivo de capsulite rétractile visant à étudier les options possibles de traitement pour cette condition et d’autres étiologies d’arthrofibrose comparable. Le modèle comprend fixation extra articulaire de l’épaule en rats via scapulaire à suturer humérale, ce qui entraîne une contracture secondaire sans envahir l’espace intra-articulaire et résultant en une diminution ROM rotationnelle et articulation accrue raideur.

Nous avons utilisé 10 rats Sprague-Dawley aux fins de cette étude. Mesures de ROM de base ont été prises avant l’immobilisation de la gléno-humérale. Les rats ont été soumis à 8 semaines d’immobilisation avant que les sutures de fixation ont été retirés et les changements dans la ROM et raideurs articulaires ont été évalués. Pour évaluer si l’immobilisation a entraîné une réduction significative dans la ROM, variations dans la cinématique ont été calculées. ROM a été mesurée à chaque instant dans la période de suivi et a été comparé aux mesures ROM de référence internes et externes. Afin d’évaluer la rigidité, la cinétique conjointe ont été calculés en déterminant les différences dans le couple (t_ext et t_int ) nécessaires pour atteindre la première rotation externe de 60 ° et rotation interne initiale de 80 °.

Après la suppression de la fixation de suture extra-articulaires suivi jour 0, nous avons constaté une baisse de 63 % en ROM total par rapport au niveau de référence. Nous avons observé une amélioration continue jusqu'à la semaine 5 du suivi, avec la progression ralentir autour d’une restriction de 19 %. Semaine 8 du suivi, il y avait encore une restriction de 18 % des Romains en outre, le suivi jour 0, nous avons trouvé le couple a augmenté de 13,3 Nmm par rapport au niveau de référence. Semaine 8, le couple total a été mesuré à 1,4 ± 0,2 Nmm supérieure à des mesures initiales. Cet ouvrage présente un modèle de rat de capsulite épaule avec une durée réduite de ROM et de la rigidité accrue.

Introduction

Capsulite rétractile de l’épaule est souvent appelée épaule gelée ou contracture de l’épaule. Elle est caractérisée par le mouvement restreint gléno-humérale et de la douleur, sans doute en raison de la fibrose avancée et contracture mixte^1,2,3. La condition implique le recrutement de cellules fibroblastes et myofibroblastes avec une matrice de collagène dense qui en résulte (types I et III) dans le mixte capsule^2,3. Il y a de nombreux facteurs de risque possibles pour développer une contracture commune, y compris entre les sexes, diabète, hyperthyroïdie, lésions traumatiques et immobilisation prolongée^4,5,6.

Options thérapeutiques efficaces font défaut et surtout comprennent la physiothérapie, avec intervention sous la forme d’une libération chirurgicale dans des cas extrêmes qui n’ont pas amélioré avec soin conservateur. La meilleure méthode de traitement reste indéterminée et a été un sujet de grand intérêt pendant des années dans le domaine médical^7,8. Développement de nouvelles options thérapeutiques nécessitera un modèle animal reproductible pour la condition qui ne s’appuie pas sur le traumatisme induit intra-articulaire. Le modèle optimal de capsulite rétractile devrait impliquer les deux principales caractéristiques de la maladie : contracture de la capsule de l’épaule et une réduction prolongée dans l’amplitude du mouvement (ROM). Schollmeier et al. ⁹ décrit l’un des premiers modèles de contracture mixte en utilisant un casting pour développer l’épaule contracture en canines. Ils ont également signalé que des changements de pression ROM et intra-articulaires retournés à des niveaux normaux après l’arrêt de l’immobilisation⁹. Toutefois, une limitation importante mentionnée dans l’étude est la variation de position de la branche entre animaux à cause de l’utilisation d’une technique de coulée. Afin d’obtenir un modèle plus reproductible, Kanno et al. ¹⁰ a par la suite présenté un modèle de rat de capsulite rétractile à l’aide d’une fixation rigide interne de l’épaule. Cependant, bien qu’ils ont atteint une réduction significative de la ROM avec leur modèle, ils ne précisaient pas si ces changements sont temporaires ou de longue durée. Le but de notre étude était de créer un approprié en vivo épaule contracture modèle de rat en étudiant l’effet d’immobilisation commune prolongée extra-articulaires gléno-humérale sur ROM et raideur articulaire.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité de l’urbanisme au Beth Israel Deaconess Medical Center et d’institutionnels animalier. A pris soin d’éviter l’anesthésie prolongée inutile et aussi pour éviter l’hypothermie. Animaux ont été pondérées à chaque session de mesure ROM et surveillé pour perdre du poids.

1. sujets de l’étude

1. Utiliser 10 rats Sprague-Dawley qui ont 13 semaines au moment de la chirurgie et qui vont de 250 à 300 g de poids corporel.

2. opération chirurgicale

1. Sous anesthésie et avant immobilisation chirurgicale, mesurer le couple de référence en fonction de l’angle de rotation entre 60° de rotation externe et 80° de rotation interne (voir étape 5).
2. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % par inhalation dans une chambre d’induction et ensuite soutenir avec 2 % isoflurane grâce à un cône de nez tout au long de la chirurgie.
   1. Utilisez un élément de chauffage à base d’eau sous l’animal pour maintenir la température corporelle pendant l’anesthésie.
   2. Aux fins de contrôle de la douleur, administrer soutenir-libèrent la buprénorphine par voie sous-cutanée à la dose de 1,2 mg/kg selon le poids corporel de la rat.
3. Immobiliser la gléno-humérale gauche d’articulations à un angle de 60 ° d’abduction (l’angle entre la tige humérale et l’épine scapulaire)^{10 , 11}.
   1. Commencer la procédure chirurgicale par une incision longitudinale postérieure, parallèle à la tige humérale. Faire l’incision de la peau juste en dessous de la gléno-humérale conjointe et s’étendent sur environ 3 cm.
   2. 2 sutures (polyester tressé) permet d’immobiliser l’articulation scapulo-humérale, en perçant à travers le bord latéral de l’omoplate et près du deux tiers distal de la tige humérale et ensuite serrer comme illustré dans la Figure 1 a. Prendre un effort supplémentaire pour éviter la constriction des structures critiques tels que l’artère brachiale.
      Remarque : La technique chirurgicale a l’avantage de pouvoir limiter l’articulation scapulo-humérale à 60° d’abduction (Z) sans affecter les autres régimes (X & Y). En plaçant les sutures autour de l’humérus et par le bord latéral de l’omoplate, un rapprochement des deux structures est atteint et maintenu sur le plan de la lame scapulaire. Après avoir serré les sutures, le bras est fixé à la position de repos lors de l’examen des plans X et Y et à 60° d’abduction quand plan Z est considéré. Ceci est pensé pour limiter la variabilité entre les animaux qui pourraient provenir de l’échec de peaufiner la position commune dans les trois plans.

3. fermer l’Incision

1. Après hémostase correcte, fermer l’incision de la peau à l’aide de clips de la peau.
2. Cessez l’anesthésie et permettre à l’animal de récupérer sous surveillance dans un environnement chaleureux. Après que l’animal reprend conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal, renvoyez-le vers sa cage.
3. Immédiatement après l’intervention, que les animaux puissent retourner à une activité normale. Que les animaux puissent se déplacer sans restriction, en s’appuyant principalement sur des sutures internes à la difficulté de l’articulation scapulo-humérale.
4. Pour surveiller une éventuelle infection, inspecter les sites d’incision quotidiennement durant la première semaine post-opératoire.
5. Retirez les clips de blessure le 10^e jour après la chirurgie.
   Remarque : Il n’y avait pas de manipulation des muscles au cours de la procédure, et la technique ne portait pas sur n’importe quel traumatisme intra-articulaire, préservant ainsi la continuité capsulaire et articulaire et l’intégrité anatomique. Aucune limitation restrain, ni activité externe a été suivie dans notre protocole.
6. Fournir analgésie à l’aide de soutenir-libèrent la buprénorphine, injecté par voie sous-cutanée à la dose de 1,2 mg/kg à partir d’induction de l’anesthésie et répété toutes les 72 h si nécessaire.

4. suture enlèvement 8 semaines après immobilisation

1. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % par inhalation dans une chambre d’induction, puis maintenue à l’isoflurane 2 % grâce à un cône de nez tout au long de la chirurgie. Aux fins de contrôle de la douleur, administrer soutenir-libèrent la buprénorphine par voie sous-cutanée à la dose de 1,2 mg/kg selon le poids corporel de la rat.
2. Faites une incision sur le dessus de la cicatrice de la procédure précédente.
3. Couper les sutures et retirer de l’humérus et l’omoplate.
4. Refermer l’incision avec des clips de la plaie.
5. Examiner le site d’incision quotidiennement durant la première semaine pour détecter tout signe d’infection. Surveiller la douleur et la détresse aussi bien.
6. Retirez les clips de blessure le 10^e jour après la chirurgie.

5. gamme de mouvement et les mesures de la raideur articulaire

1. Mesurer la mécanique de l’épaule ROM et passive avant et après l’immobilisation en utilisant un dispositif personnalisé composé d’une attache de bras, un ensemble de capteur et un d’essieu pivotant¹¹. Cette opération est effectuée pré-opératoire (de base) et en continu après l’ablation de suture.
   1. Mesure ROM immédiatement après le retrait de suture (suivi jour 0) et par la suite deux fois par semaine.
   2. Réduire les mesures une fois par semaine, à moins de 10 % d’enregistrement modifier depuis le précédent point de temps.
      Remarque : Après avoir testé ROM pendant des semaines, la ROM de chaque animal n’a pas changé radicalement entre essais points dans le temps (modifiez les moins de 10 %). La ROM semblait plateau à ce stade, c’est pourquoi, nous estimions qu’il était suffisant de diminuant la fréquence test de deux fois par semaine à une fois par semaine.
2. Effectuer des mesures sous anesthésie à l’aide d’isoflurane via vaporisateur de précision à 5 % pour l’induction et 2 % pour l’entretien de toute la longueur de la procédure (environ 5 minutes), afin de faciliter les mesures efficacement. Utilisez un élément de chauffage à base d’eau sous l’animal pour maintenir la température corporelle pendant l’anesthésie.
3. Placez l’animal correctement pour ROM mesure à l’aide d’un laser de guidage. Position de la patte antérieure sur l’attache bras en flexion vers l’avant 90°, avec l’axe de détection aligné avec l’axe longitudinal de l’humérus. Fixer la patte antérieure par le poignet et le coude, comme illustré dans la Figure 1 b.
4. Contrôle rotation passive membre antérieur par un moteur pas à pas pour évaluer la ROM et le couple de façon cohérente. Commande du moteur pas à pas avec un microcontrôleur. Utiliser les entrées de l’inclinomètre, conjointement avec ceux d’un capteur de couple pour indiquer le début et la fin des mesures.
5. Connectez le microcontrôleur à un ordinateur et un contrôle à l’aide d’un code interne de MATLAB développé.
6. Pour les mesures de base cycle seulement, l’ensemble du capteur 3 fois entre 60° de rotation externe et 80° de rotation interne afin d’obtenir des mesures de couple initial (externe : t_ext et internes : t_int) pour comparaison ultérieure.
7. Pour les mesures de ROM, utilisez les valeurs de couple de chaque animal à leurs propres mesures de référence (t_ext et t_int) comme variables d’entrée prédéfinies dans le programme pour détecter des changements dans la rotation ROM. utiliser les mesures de base comme un comparatif s’arrêtant point de mesures ultérieures de ROM. Des changements ont été détectés avec une résolution de 0,2 °.
8. Pour les mesures de rigidité, utiliser les angles de rotation initial de rotation externe de 60° et 80° rotation interne comme entrée prédéfinie dans le programme afin de détecter des changements dans le couple. Des changements ont été détectés avec une résolution de 0,01 Nmm.
9. Peser les animaux sur le même jour que chaque évaluation ROM. Placer les animaux sur des échelles et noter leurs masses. Ces données ont servi comme l’un des outils pour évaluer le statut zoosanitaire au cours de l’étude.
10. Après reprise, regagner leurs cages de rats et de surveiller les signes de douleur ou de détresse. Tout au long de ce test, aucun animal n’est laissé sans surveillance, jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
    NOTE : Mesures de ROM et le couple ont été réalisées avec un dispositif sur mesure, signalé auparavant par notre groupe {Villa-Camacho 2015}. L’appareil est un jig sur mesure qui se compose d’un axe de rotation de moteur pas à pas et contrôlée par un script MATLAB personnalisé. Un capteur de couple et l’unité de mesure inertielle sont utilisées pour capturer le couple et positionner des données durant l’articulation du spécimen.

6. post-mortem immunohistologiques analyse

1. À la fin de la période de 8 semaines mesure ROM, euthanasier des rats avec une exposition au CO₂ .
2. Disséquer les deux gauche (immobilisé), épaules (contrôle sain) à droite de disarticulating de l’humérus de l’ulna et en sectionnant l’omoplate de la clavicule et la cavité thoracique.
3. Difficulté les épaules excisées dans une solution de formol tamponné neutre de 10 % pendant 3 jours, suivie d’une décalcification dans une solution de tétraacétique (EDTA) l’acide 10 % à un pH de 7,4 pour encore 2 mois.
4. Au cours de ce processus, placer les échantillons dans un agitateur dans un cycle d’agitation douce et conserver à 4 ° C. Surveiller le détartrage de la gléno-humérale en collaboration avec l’hebdomadaire microcomputed (uCT) tomodensitométrie.
   Remarque : L’EDTA est un chélateur qui lie les ions calcium de la surface extérieure du cristal d’apatite, réduire progressivement le cristal taille^12,13,14. Ce processus est très lent et doux, et il est utilisé pour détecter des éléments spécifiques de tissus qui doivent être préservés pour des techniques telles que l’immunohistochimie (IHC). Le taux auquel l’EDTA décalcifier l’échantillon dépend du pH et la concentration de la solution. En termes de pH, il peut varier de 7 à 7.4, avec des solutions alcalines plus accélérer la vitesse de décalcification. Cependant, des solutions avec les niveaux de pH plus élevés peuvent endommager les éléments principaux tissus. En outre, la concentration d’EDTA habituelle pour de telles expériences se situe entre 10 et 14 %, mais il est très important de se rappeler que l’agent actif s’épuise une fois qu’il adhère au calcium, donc cela nécessite un remplacement du fluide détartrage au moins 3 à 4 fois par semaine¹⁵.
5. Une fois que le processus de décalcification a été conclu, monter les articulations gléno-humérale en piles de paraffine pour les coupes histologiques. Orienter les échantillons permettant de tranches coronales. Tranches a obtenu 50 % des profondeurs de la tête humérale (au centre, milieu-du) sont indiquées dans la Figure 1. Effectuer la coloration immunohistochimique utilisant la méthode de peroxydase-anti-peroxydase pour désigner la présence de tissu fibreux de l’articulation. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Effectuer la recherche d’antigène par irradiation micro-ondes en immergeant les diapositives à une coloration en plastique dans une solution de tampon citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 6,0 préchauffé pendant 5 min à 95-100 ° C) et à placer dans un four à micro-ondes régulier pendant 10 minutes à puissance moyenne. Laisser les lames refroidir pendant 30 minutes à température ambiante.
7. Effectuer le blocage avec sérum de chèvre pendant 30 min et incuber les échantillons avec un anticorps mono-clonale de souris primaire (dilution 1 : 400) à la fibronectine durant la nuit à 4 ° C.
8. Après incubation avec l’anticorps primaire, laver deux fois avec du PBS des spécimens (0,5 µg/mL) pendant 10 minutes ; et incuber avec un anticorps secondaire, Conjugué IgG-peroxydase de le chèvre anti-souris (dilution 1 : 400) pendant 30 minutes.
9. Laver les spécimens deux fois avec du PBS (2,5 µg/mL) sur un agitateur pendant 10 minutes et exposer à 3,30-diaminobenzidine tétrahydro-chlorure et 30 % peroxyde d’hydrogène dans l’obscurité pendant 10 min. contre-colorant à l’hématoxyline Carazzi.

Résultats

Amplitude de mouvement

Suivi jour 0, nous avons constaté une baisse de 63 % en ROM total par rapport au niveau de référence (P <.001. Nous avons observé une amélioration progressive du ROM jusqu'à la semaine 5 du suivi, lors de la progression s’est arrêté à la restriction de 19 % (P < 0,001). La restriction reste, 18 % du total ROM, ressortait toujours à 8 semaines de suivi (P < 0,001).

Discussion

Cette étude présente un modèle de rat de capsulite rétractile de l’épaule par le biais de la fixation interne de l’articulation gléno-humérale. En outre, il montre une réduction prolongée de ROM total pendant au moins 8 semaines après le retrait de la fixation. Afin de calculer les altérations dans la ROM à des moments différents, des mesures ont été comparés aux animale planifications spécifiques. À l’inverse, Kanno et al. ¹⁰ utilisé un couple standardisé pour t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus