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Résumé

O9-1 est une lignée de cellules multipotentes souris crête neurale. Nous décrivons ici des protocoles détaillés étape par étape pour mise en culture des cellules O9-1, différencier les cellules O9-1 dans les types spécifiques de cellules et manipuler génétiquement cellules O9-1 à l’aide de précipitation induite par le siARN ou CRISPR-Cas9 génome édition.

Résumé

Cellules neurales de crête (CNC) Effectuez la migration des cellules souches multipotentes qui peuvent se différencier en divers types de cellules et donnent lieu à de multiples tissus et organes. La lignée cellulaire O9-1 est dérivée de l’endogène CNC embryonnaires de souris et maintient ses multipotentialité. Toutefois, dans des conditions de culture spécifique, cellules O9-1 peuvent se différencier en divers types de cellules et être utilisés dans un large éventail d’applications de recherche. Récemment, avec la combinaison des études sur les souris et O9-1 cellule études, nous avons montré que l’hippopotame effecteurs de la voie de signalisation Yap et Taz jouent des rôles importants en développement craniofacial dérivé de crête neurale. Bien que le processus de culture de cellules O9-1 est plus compliqué que celle utilisée pour les autres lignées cellulaires, la lignée cellulaire O9-1 est un modèle puissant pour l’étude in vitrode la CNC. Nous présentons ici un protocole pour la culture de la lignée cellulaire O9-1 afin de maintenir ses stemness, mais aussi des protocoles permettant de différencier les cellules O9-1 dans différents types de cellules, telles que les cellules musculaires lisses et des ostéoblastes. En outre, les protocoles sont décrits pour effectuer des études de perte de fonction de gènes dans les cellules O9-1 l’utilisation CRISPR-Cas9 suppression et petit parasite-mediated RNA knockdown.

Introduction

Cellules neurales de crête (CNC) sont des cellules souches multipotentes avec une remarquable capacité migratoire et l’existence transitoire durant le développement embryonnaire. Comités nationaux sont créés entre l’ectoderme de surface et le tube neural et migre vers d’autres parties de l’embryon au cours du développement embryonnaire1. Se fondant sur leurs domaines fonctionnels, CNC peut être classées en plusieurs types différents, y compris crânienne, le tronc, vagal, sacrée et CNC cardiaque. De plus, CNC peut se différencier en plusieurs lignées cellulaires, tels que les cellules musculaires lisses, cellules osseuses et les neurones et donner lieu à divers tissus2,3. Le développement des CNC se caractérise par une série complexe d’événements morphogénétiques qui sont affinés par divers signaux moléculaires. Compte tenu de la réglementation complexe des CNC et leur importante contribution aux nombreuses structures, la dérégulation du développement NCC peut entraîner communément congenital malformations congénitales, qui représentent près de 30 % de tous les défauts de naissance humaines congénitales. Anomalies au cours du développement de la crête neurale peuvent conduire à une fente labiale/palatine, viciée nez formation, syndromes, les défauts comme une sortie du cardiaques défectueux, ou même mortalité1,4,5, 6 , 7. comprendre les mécanismes moléculaires du développement de la NCC est important pour développer des traitements pour les maladies causées par des défauts dans le développement de la NCC. Avec l’utilisation de divers in vitro et in vivo des approches8,9,10,11,12,13,14 ,15, des progrès considérables accomplis dans la recherche de la NCC. In vivo, des modèles animaux, y compris les poulets, amphibiens, poissons zèbres et la souris, ont été utilisés pour étudier le CNC1. En outre, des embryons humains ont été utilisés pour étudier le processus de migration de NCC en début de développement embryonnaire humain16. In vitro, des modèles de cellules pour les comités nationaux, tels que CNC humaine qui proviennent de la graisse sous-cutanée patiente, ont été utilisés pour étudier la maladie de Parkinson,17. La ligne O9-1 NCC, qui était à l’origine de cultures de massives des CNC endogène isolé de E8.5 souris embryons18, est un modèle cellulaire puissant pour étudier NCCs. ce qui est important, dans des conditions de culture non-différencier, cellules O9-1 sont comités nationaux de la tige-comme multipotentes. Cependant, dans diverses conditions de culture, cellules O9-1 peuvent être différenciées dans les types de cellules distingués, tels que les cellules musculaires lisses, ostéoblastes, les chondrocytes et les cellules gliales18. Compte tenu de ces propriétés, cellules O9-1 ont été largement utilisés pour les études relatives au NCC, telles que l’enquête sur le mécanisme moléculaire de défauts crânien-facial19,20.

Ici, les protocoles détaillés sont fournis pour maintenir les cellules O9-1, DIFFERENCIATION O9-1 cellules en différents types cellulaires et manipuler des cellules O9-1 en effectuant des études de perte de fonction de gènes avec CRISPR-Cas9 génome d’édition et de petits ARN interférents (siARN)- véhiculée par les technologies knockdown. Comme un exemple représentatif, l’utilisation des cellules O9-1 d’étudier Yap et Taz perte de fonction est décrite. Yap et Taz sont les effecteurs en aval de l’hippopotame, signalisation, qui joue un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, la différenciation et l’apoptose. La voie Hippo a aussi démontrée être important dans le développement et l’homéostasie de plusieurs différents tissus et organes, ainsi que dans la pathogenèse des maladies différentes20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Les composants principaux d’Hippo signalisation comprennent les kinases de 20 comme stérile du suppresseur tumeur Mst1/2, protéine d’échafaudage Salvador contenant du domaine WW et les kinases de homologue (Lats1/2) de suppresseur de tumeur grande. Hippo la signalisation inhibe l’activité de Yap et Taz et favorise leur dégradation dans le cytoplasme. Sans répression de Hippo, Yap et Taz peuvent effectuer des transferts en noyaux et fonction transcriptionnelles activateurs Co. Nous avons récemment démontré que spécifiquement inactivant l’hippopotame effecteurs Yap et Taz en souris CNC de signalisation à l’aide de la Wnt1cre et Wnt1Cre2SOR pilotes ont abouti à une létalité embryonnaire à E10.5 avec sévère Craniofacial défauts20. Nous avons également réalisé des études utilisant des cellules O9-1 pour enquêter sur le rôle de Yap et Taz en CNC. Pour étudier la fonction Yap et Taz dans le NCC prolifération et la différenciation, Yap et Taz knockdown cellules ont été générés dans les cellules O9-1 à l’aide de siARN, et cellules Ko Yap ont été générés en utilisant CRISPR-Cas9 génome édition. Les mêmes stratégies de perte de fonction de gène peuvent être appliqués aux gènes cibles différentes dans d’autres voies. En outre, gain de fonction des études et des essais de transfection peuvent également être appliqués aux cellules O9-1 pour étudier la régulation et la fonction du gène. Les protocoles décrits ici sont destinés à être utilisés par les enquêteurs comme guides pour la culture des cellules O9-1 pour maintenir stemness multipotentes, afin de différencier les cellules O9-1 dans les autres types de cellules dans des conditions de culture différente et pour étudier la fonction des gènes et les mécanismes moléculaires du CNC.

Protocole

1. préparation avant O9-1 Cell Culture

NOTE : Milieux de base utilisés pour la culture cellulaire O9-1 doit ont été conditionnés par Sandos consanguines souris thioguanine / l’ouabaine-résistant (STO) souris fibroblastes cellules ; par conséquent, les cellules STO doivent être obtenus et préparé comme indiqué ci-dessous avant de commencer la culture cellulaire O9-1.

  1. Culture de cellules active STO
    1. Préparer les médias cultivant des cellules actives de STO en faisant de Dulbecco complet modifiés des médias de l’aigle (DMEM) avec 7 % sérum fœtal (SVF) (grade de culture de cellules souches embryonnaires), 100 U/mL la pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 2 mM de L-glutamine (concentration finale sont indiqués).
      Remarque : Le milieu de la STO est utilisé pour la culture de cellules de conducteur actifs STO. La pénicilline, la streptomycine et la L-glutamine peuvent former des précipitations dans un entrepôt ; dissoudre complètement en pipettant également, avant de l’utiliser.
    2. Recouvrir une plaque de culture de cellules standard 100 mm avec 0,1 % de gélatine pendant 30 min à température ambiante. Après la période d’incubation, aspirer la gélatine supplémentaire. Utilisez la plaque immédiatement après enduit.
      Remarque : Vous pouvez également couvrir la plaque avec les médias de la STO et laisser la plaque dans un incubateur humidifié pour éviter l’assèchement de la plaque (c’est destiné uniquement pour le stockage à court terme et ne pas pour le stockage des plaques prêtes à l’emploi).
    3. Décongeler les cellules STO rapidement dans un bain d’eau de 37 ° C ; Essuyez le cryovial avec l’éthanol à 70 % avant ouverture et transférer immédiatement le flacon entier de cellules dans un tube à centrifuger.
    4. Les médias de la STO, ajouter quelques gouttes dans le tube à centrifuger ; le rapport de volume des cellules aux médias est 01:10.
    5. Centrifuger les cellules à 180 x g pendant 3 min à température ambiante.
    6. Mélanger en douces cellules pipetage et transfert sur la plaque de gélatine-enduit.
    7. Permettre aux cellules STO à croître pendant 24 h dans un incubateur standard (37 ° C, 5 % de CO2).
    8. Changer le milieu (seulement après que les cellules adhèrent) 24 h après l’ensemencement et de jeter le vieux support.
    9. Vérifier les cellules STO chaque jour sous un microscope et le passage à la confluence de 80 %.
      1. Avant de commencer le passage de cellule STO, enduire plaques avec de la gélatine de 0,1 % (volume de gélatine est égale à la moitié du volume de support de croissance pour ce navire) pendant 30 min à température ambiante.
      2. Pour le passage des cellules de la STO, aspirer les milieux de croissance et laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois (Ajouter PBS dans un volume égal de milieux de culture).
      3. Aspirer les PBS et ajouter 0,25 % de trypsine-EDTA (régler le volume selon la taille des navires) ; puis, incuber à 37 ° C pendant 5 min.
        Remarque : Pour une plaque de 100 mm, utiliser 10 mL de milieu de culture et 3 mL de solution de trypsine. Pour une plaque de 150 mm, utiliser 20 mL de milieu de culture et 8 mL de solution de trypsine. Le volume de tampon de lavage utilisé est égal au volume de milieux de culture.
      4. Inactiver la trypsine avec un volume égal de médias STO. Cellules STO de semences de nouvelles plaques avec un ratio de 1:3 à 01:10.
        Remarque : Un régime commun de l’expansion est à décompresser dans un cryovial dans une plaque de 100 mm, puis sur une plaque de 150 mm, puis quatre plaques de 150 mm et enfin à 16 plaques de 150 mm.
  2. Inactivation et la congélation des cellules de la STO
    1. Pour préparer 2 x gel médias, ajoutez le code suivant aux médias STO (concentrations finales sont indiquées) : 20 % FBS, 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO).
    2. Après avoir mélangé, filtre stériliser le 2 x gel médias (pore taille 0,22 µm) et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Faire 2 x gel médias le jour même du utiliser et jeter les médias gel non utilisé.
    3. Préparer la solution de la mitomycine C dans du PBS à une concentration de 0,5 mg/mL. Pour dissoudre la mitomycine C dans du PBS, ruban adhésif la bouteille sur un vortexer et vortex faible réglage pendant environ 45 min pour dissoudre les particules complètement.
      Remarque : La mitomycine C est clair sensible et difficile à dissoudre.
      ATTENTION : La mitomycine C est très toxique et peut provoquer le cancer. Traiter qu’avec un équipement de protection personnels.
    4. Inactiver les cellules de la STO en ajoutant une concentration finale de mitomycine C de la 0,01 mg/mL dans les médias existants. Incuber pendant 2 h à l’intérieur d’un incubateur standard (37 ° C, 5 % de CO2).
    5. Laver les plaques (150 mm) avec 20 mL de PBS deux fois après inactivation avec la mitomycine C.
    6. Aspirer la solution de PBS, dissocier les cellules à l’aide de 8 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA et incuber pendant 5 min à l’intérieur d’un incubateur humidifié standard (37 ° C, 5 % de CO2).
    7. Inactiver la trypsine avec 8 mL de médias STO.
    8. Transférer la solution de cellules dans un tube à centrifuger. Combiner plusieurs plaques dans un tube à centrifuger de gagner du temps. Centrifuger 5 min à 180 g.
    9. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS.
    10. 10 µL de la solution de la cellule permet de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Compter les cellules sur la place centrale de maille et de multiplier le nombre obtenu par 104 pour déterminer le nombre de cellules / mL 1. Comptez deux fois et la moyenne des deux nombres pour obtenir l’estimation finale du nombre de cellules par millilitre.
    11. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 180 g.
    12. Aspirer les PBS et ajouter 1:1 (en volume) STO médias et 2 x gel au culot cellulaire. Ajuster le volume pour une concentration cellulaire finale du 4 x 106 cellules/mL (ce montant est bon pour une plaque de 100 mm).
      NOTE : par exemple, de quatre plaques de 150 mm ce qui donne un total de 60 x 106 cellules, geler 4 x 106 cellules / cryovial, avec chaque cryovial contenant 1 mL de solution de la cellule. Quatre plaques produisent environ 15 cryovials (60/4 = 15). Ajouter 7,5 mL de médias STO et 7,5 mL de 2 x gel médias au culot, remettre et partie aliquote 1 mL dans chaque cryovial.
    13. Remettre en suspension par pipetage lentement congélation médias avec culot cellulaire. Transférer 1 mL de solution de cellule dans chaque cryovial et étiqueter en conséquence.
    14. Placer cryovials à l’intérieur d’une boîte à couvercle en polystyrène (Ceci fournit un taux de refroidissement lent, ce qui améliore la survie des cellules). Transférer la boîte dans un congélateur-80 ° C pendant au moins 24 h avant de transférer le cryovial dans l’azote liquide.
      Remarque : Pour de meilleurs résultats, minimiser la cellule de comptage de temps, ainsi que le temps entre l’ajout de 2 x gel médias aux cellules et de transfert des flacons à-80 ° C.

2. O9-1 Cell Culture

  1. Préparer le milieu de base pour culture cellulaire O9-1 en ajoutant ce qui suit en DMEM (concentrations finales sont indiquées) : 15 % FBS, 0,1 mM minimum essentiel médiatique (MEM) des acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM, 55 mM bêta-mercaptoéthanol, 100 U/mL de pénicilline, 100 U/mL streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 103 unités/mL facteur inhibiteur de leucémie (LIF ; ajouté immédiatement avant utilisation, ne pas ajouter à la solution concentrée) et 25 des fibroblastes ng/mL de facteur de croissance de base (bFGF ; ajouté immédiatement avant utilisation, ne pas ajouter à la solution concentrée).
  2. Filtre à stériliser le milieu de base (pore taille 0,22 µm) et envelopper dans du papier aluminium pour protéger de la lumière.
  3. Recueillir les milieux basales conditionnés de cellules STO inactivés.
    Remarque : Ne passez qu’après l’obtention de cellules STO inactivés. O9-1 milieux de base provenant de plaques cellulaires STO est ci-après dénommé milieux basale conditionnés.
    1. Dégel inactivé cellules STO rapidement tel que décrit ci-dessus (un cryovial contenant 4 x 106 cellules est bon pour une plaque de 100 mm et donne environ 100 mL conditionnée de milieu basal après 10 jours de collecte). Semences inactivé cellules STO à la plaque de gélatine-enduit à l’aide de médias STO. Permettre aux cellules d’attacher une nuit dans un incubateur humidifié standard (37 ° C, 5 % de CO2).
    2. 24h après décongélation des cellules de la STO, jeter les médias existants de la STO et le remplacer avec le milieu de base.
      Remarque : N’ajoutez pas de FRV et bFGF à inactivé récipients de culture de cellules STO ; Ajouter uniquement pour récipients de culture cellulaire O9-1.
    3. Toutes les 24 h, changer les médias en utilisant des milieux de base O9-1 et recueillir les médias basales de plaques cellulaires STO dans une bouteille. Envelopper le flacon contenant les milieux basales conditionnés dans du papier pour protéger de la lumière. Stocker tous les médias collectés à 4 ° C.
      NOTE : Parce que les cellules étaient inactivés, ils peuvent ne pas apparaître comme sains comme ils le faisaient après plusieurs jours de collecte ; Cela doit être prévu.
    4. Éventuellement, pour vérifier la contamination, recueillir le milieu de base pour chaque jour de la collection de tubes différents (au lieu d’une bouteille) enveloppé dans une feuille. À l’aide d’une plaque 24 puits, 1 mL de médias de chaque jour dans chaque puits et incuber pendant la nuit dans un incubateur standard pour vérifier la contamination bactérienne sous le microscope.
      Remarque : Les médias reste une couleur rouge s’il n’y a aucune contamination mais des changements au jaune si la contamination bactérienne est présente.
    5. Après avoir recueilli conditionné médias basale pendant 10 jours, jetez les cellules de la STO. Moissonneuse-batteuse (le cas échéant) tous recueillis milieux de base conditionnelle et stériliser de filtration (pores taille 0,22 µm) dans un flacon stérile. Enrouler la bouteille en aluminium pour protéger de la lumière. Garder les milieux basale conditionnés filtrée à 4 ° C pendant un maximum d’un mois à compter de la date de filtre.

3. maintenir les cellules O9-1

NOTE : Travailler O9-1 milieux de base est filtre stérilisé conditionné de milieu de base, à laquelle FRV (concentration finale 103 unités/mL) et bFGF (concentration finale 25 ng/mL) sont immédiatement ajoutées à la boîte de Petri de cellule avant de l’utiliser. Ce support doit être protégé de la lumière et stockés à 4 ° C.

  1. Récupération des cellules O9-1
    1. Dégeler lentement la solution concentrée de la matrice de la membrane basale (p. ex., Matrigel) à 4 ° C à préparer des aliquotes, du jour au lendemain.
    2. Ajouter 5 mL de DMEM avec 10 % FBS à 5 mL de la membrane de matrice stock membrane basale. Mélangez bien en pipettant également, avec des pointes de pipette froid à-20 ° C. Garder les lampes originales de bouteille et partie aliquote sur la glace. Geler les aliquotes dans différents volumes (aliquots de 0,5 mL ou 1 mL) selon les besoins de l’expérience. Évitez de gel-dégel membrane basale matrice plusieurs fois.
      NOTE : la matrice de la membrane basale se polymérise rapidement à température ambiante ; utiliser des pointes de pipette froid et garder les tubes froid quand on travaille pour éviter une polymérisation accidentelle.
    3. Décongeler une partie aliquote de la matrice de la membrane basale à 4 ° C ou sur la glace 2 h avant de commencer l’expérience. Ne rangez pas la matrice à 4 ° C pendant une période prolongée.
    4. Utilisez stérilisée par filtration DMEM avec 10 % FBS pour diluer la matrice de la membrane basale à une concentration finale de 0,5 mg/mL pour recouvrir les plaques. Plaques de couche avec la matrice de la membrane basale (0,5 mg/mL) à température ambiante pendant 1 h. s’assurer qu’il couvre entièrement la plaque (comme illustré à la Figure 1).
    5. Inclinez la plaque quand vous aspirer la matrice de la membrane basale pour éviter de toucher la surface collante ; plaques sèches à 37 ° C pendant 30 min. Ne pas trop sécher les plaques revêtues.
      Remarque : Passez seulement quand tous les milieux et réactifs sont prêts à l’emploi (conditionné basal media, stérile filtré 10 % FBS DMEM, FRV et bFGF).
    6. Récupérer rapidement les cellules O9-1 en plaçant le cryovial dans un bain d’eau de 37 ° C ; lentement, agiter le flacon jusqu'à la solution complètement se transforme en liquide et procéder immédiatement à l’étape suivante.
    7. Transférer toute la solution de la cellule de le cryovial (environ 1 mL) dans un tube à centrifuger 15 mL. Ajouter 5 volumes de DMEM avec 10 % SVF (filtre stérilisé avec une taille de pore de filtre de 0,22 µm) et remettre en suspension.
    8. Centrifuger pendant 3 min à 180 g. Aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Resuspendre le culot cellulaire (en tapotant) dans conditionné milieu de base additionné de FRV et bFGF. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
      Remarque : Conditionné milieu de base additionné de FRV et bFGF est essentiel pour maintenir la multipotentialité d’une lignée cellulaire O9-1. Faire attention à ajouter le support approprié pour éviter la différenciation cellulaire involontaire.
    9. Cellules de semences de 10 000 à 15 000 cellules/cm2 pour une plaque 6 puits. Permettent d’attacher et de grandir dans un incubateur de culture cellulaire standard (37 ° C, 5 % de CO2), les cellules pendant la nuit avant de changer les médias.
    10. S’assurer que les cellules sont attachés avant de procéder au changement des médias (cellules attachées sain ressembler à celles indiquées à la Figure 2).
    11. Toujours changer des milieux de culture le lendemain après la récupération des cellules O9-1 (utiliser les milieux basale conditionnés complétée avec FRV et bFGF).
  2. Passage des cellules O9-1
    1. Quand les cellules O9-1 atteignent 80 % confluence, décongeler la matrice de la membrane basale et préparer une plaque de matrice recouvertes de membrane basale, tel que décrit ci-dessus. Ajouter conditionné milieu de base additionné de FRV et bFGF au navire. Vous pouvez également ajouter DMEM sans FBS pour garder la matrice de la membrane basale de l’évaporation et rangez-les dans un incubateur humidifié standard pour pas plus de 3 jours.
    2. Rincez les puits contenant O9-1 (plaque 6 puits) avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) deux fois et Pipetez doucement pour éviter de perdre des cellules.
    3. Dissocier les cellules avec 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 3 min. neutraliser la trypsine avec une quantité égale de DMEM avec 10 % FBS. Pipette à plusieurs reprises le liquide sur toute la surface du puits de dissocier autant de cellules de la plaque que possible.
      NOTE : Concentration de la trypsine est de 0,05 % au lieu de 0,25 %. Diluer de la solution concentrée avec du SPD.
    4. Éviter de générer des bulles quand la dissociation des cellules de la plaque.
    5. Transférer tous les cellule solution dans un tube à centrifuger et centrifuger pendant 3 min à 180 g. Aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Resuspendre le culot cellulaire dans le tube à centrifuger de pipetage douce en conditionné milieu de base additionné de FRV et bFGF.
    6. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre total de cellules tel que décrit ci-dessus. Cellules de semences (10 000 à 15 000 cellules/cm2) sur la plaque de revêtement préparé comme décrit aux points 3.1.4 à 3.1.8. Un puits d’une plaque de 6 puits nécessiterait 100 000 cellules aux semences.
    7. Permettre aux cellules d’attacher et de grandir dans un incubateur de culture cellulaire standard (37 ° C, 5 % de CO2). Toujours changer des milieux de culture le lendemain après le passage de cellules O9-1.
  3. Congélation des cellules O9-1
    1. Pour préparer 2 x gel milieux pour cellules O9-1, diluer ce qui suit en DMEM (concentrations finales sont indiquées) : 40 % FBS et 20 % DMSO.
    2. Filtre stériliser 2 x support de congélation et le conserver à 4 ° C. 2 x gel médias s’imposent sur la journée, qu'il est utilisé. Jeter tous les médias inutilisés de congélation.
      NOTE : Geler O9-1 cellules à confluence de 80 %.
    3. Puits de rinçage avec SPD deux fois ; pipette doucement pour éviter de perdre des cellules.
    4. Dissocier les cellules avec 0.05 % trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 3 min, puis neutraliser la trypsine avec une quantité égale de 10 % BF en DMEM. Pipette à plusieurs reprises le liquide sur toute la surface du puits de dissocier autant de cellules de la plaque que possible.
    5. Transférer tous les contenus de la plaque dans un tube à centrifuger et centrifuger pendant 3 min à 180 g. Aspirer le surnageant et ajouter 2 mL de PBS et remettre en suspension en tapotant.
    6. 10 µL de solution de cellule permet de compter les cellules en utilisant un hémocytomètre comme décrit ci-dessus.
    7. Centrifuger solution cellulaire pendant 3 min à 180 g. Aspirer le surnageant et ajustez la quantité de milieu de base nécessaires ; Ensuite, ajouter une quantité égale de 2 x gel médias.
      Remarque : Les cellules sont gelés à une concentration de 1 x 106 cellules/mL (1 mL / cryovial).
    8. Cellules de transfert de cryovials et étiqueter en conséquence. Placer cryovials à l’intérieur d’une boîte à couvercle en polystyrène pour un taux de refroidissement lent à-80 ° C pendant au moins 24 h avant de les transférer à l’azote liquide.
      Remarque : Pour de meilleurs résultats, minimiser la cellule de comptage de temps et le temps entre l’ajout de 2 x support de congélation et transfert des flacons à-80 ° C.

4. manipulation des cellules O9-1

  1. Effectuant le knockdown de siARN dans les cellules O9-1
    1. Décongeler et recouvrir une plaque 24 puits avec matrice de la membrane basale, tel que décrit ci-dessus (mesures 3.1.4–3.1.8) avant de commencer l’expérience. Récupérer et cellules O9-1, ce qui leur permet de croître de 60 % à 80 % confluency de graines.
    2. Liposomes diluées dans des milieux sans sérum selon le volume bien approprié. SiARN diluée dans des milieux sans sérum pour la finale. Ajouter siARN dilué aux liposomes dilués dans un ratio recommandé par le fabricant. Bien mélanger en pipetage et incuber.
      Remarque : Suivez le guide du fabricant sur le volume utilisé, la durée et la température d’incubation.
    3. Ajouter un volume approprié de siARN-lipide complexe aux cellules selon les recommandations du fabricant.
    4. Incuber les cellules pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire standard (37 ° C, 5 % de CO2). Effectuez des opérations en aval comme approprié (extrait RNA, extrait de protéines, coloration, etc..)
      Remarque : les concentrations et les siARN knockdown fois peuvent varier selon l’expérience individuelle.
  2. Effectuer des Knock-out du gène dans les cellules O9-1 l’utilisation CRISPR-Cas9 génome édition
    Remarque : Se référer au protocole déjà publié pour l’utilisation de CRISPR-Cas9 dans des cellules de mammifères lignes29. Condition, voici une description simplifiée de CRISPR-Cas9 génome d’édition et de mesures connexes.
    1. Obtenir sgRNA séquences à l’aide d’un outil de conception de sgRNA.
    2. Ligaturer le sgRNA à pSpCas9 (bb) - 2 a - GFP vecteur30.
    3. Transfecter O9-1 cellules avec le vecteur en utilisant un protocole standard lipofection selon les recommandations du fabricant.
    4. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire standard à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 24 h.
    5. Effectuer la cellule activée par fluorescence triant (FACS) issu des GFP/7-AAD. Semences GFP + cellules individuelles en plaques 96 puits.
    6. Cultiver les cellules dans un incubateur pour une période supplémentaire de 4 jours. Jeter tous les puits qui ont plus d’une colonie.
    7. Effectuer des PCR avec des amorces conçues pour détecter la suppression. Après les PCR, exécuter des produits PCR sur gel d’agarose pour évaluer la taille de la bande. Valider l’efficacité de l’élimination directe obtenue en utilisant CRISPR-Cas9 editingby spectacle Western Blot (un exemple des résultats Ko Yap est illustré à la Figure 3).

5. la différenciation cellulaire O9-1

  1. Différenciation des cellules O9-1 en ostéoblastes
    1. Pour préparer les médias de différenciation ostéogénique, diluer ce qui suit en alpha-MEM (concentrations finales sont indiquées) : dexaméthasone 0,1 mM 100 mM 10 b-glycérophosphate, 10 %, 50 µg/mL d’acide ascorbique, le protéine morphogénétique osseuse ng/mL 2 (BMP2) FBS, 100 U/mL la pénicilline et la streptomycine 100 mg/mL.
    2. Détecter le marqueur ostéoblastique ostéocalcine, en ostéoblastes différenciés par immunomarquage tel qu’illustré à la Figure 4.
      NOTE : La différenciation ostéogénique aussi peut être évaluée qu’en utilisant les autres marqueurs des ostéoblastes ou avec la coloration de la solution d’alizarine ou coloration de la phosphatase alcaline.
  2. Différenciation des cellules O9-1 en chondrocytes
    1. Pour préparer les médias de différenciation de chondrocytes, diluer ce qui suit en alpha-MEM (concentrations finales sont indiquées) : sérum de veau foetal de 5 % (FCS), 1 % d’insuline-transferrine-sélénium (ITS), 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine, transformation de 10 ng/mL facteur de croissance bêta (TGF-b3), acide ascorbique 50 mg/mL, 10 ng/mL BMP2, dexaméthasone 0,1 mM et pyruvate de sodium 1 mM.
    2. Première culture un monocouche de O9-1 cellules ostéogéniques médias pendant 3 jours puis trypsinize et la culture comme un format micromass dans les médias de différenciation de chondrocytes pour une période supplémentaire de 7 jours.
    3. Différenciation des ânes chondrogéniques avec une coloration bleu Alcian ou marqueurs des chondrocytes.
  3. Différenciation des cellules O9-1 dans les cellules musculaires lisses
    1. Pour préparer les milieux de la différenciation de cellules musculaires lisses, diluer ce qui suit en DMEM (concentrations finales sont indiquées) : 100 U/mL pénicilline 100 µg/mL de streptomycine et 10 % FBS.
    2. Différenciation des cellules musculaires lisses ânes avec immunofluorescence souillant en utilisant des anticorps contre les marqueurs des cellules musculaires lisses, tels que l’actine muscle lisse (SMA), montré en exemple dans la Figure 5.
  4. Différenciation des cellules O9-1 dans les cellules gliales
    1. Pour préparer les médias de la différenciation de cellules gliales, diluer ce qui suit en DMEM/F12 (les concentrations finales sont indiquées) : 1 x Supplément B-27, 2 mM de L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine, FRV de 50 ng/mL et 1 % inactivés par la chaleur FBS.
    2. Évaluer la différenciation des cellules gliales en effectuant l’immunofluorescence souillant avec des anticorps dirigés contre des marqueurs de cellules gliales comme protéine acide gras 7 (FABP7).

Résultats

Nos expériences défiant et knock-out visait à étudier les effets de Yap et Taz perte de fonction dans les cellules O9-1. Avant les expériences défiant et knock-out, nous devons assurer qui préparent pour le milieu de base et des cellules de culture O9-1 tel que décrit ci-dessus (par exemple, la membrane basale matrice doit couvrir la plaque entière tel qu’illustré à la Figure 1et O9-1 cellules récupérées de l’azote liquide ...

Discussion

La CCN est un collaborateur polyvalent et clé aux différents tissus et organes au cours de la morphogenèse embryonnaire. La lignée cellulaire O9-1 maintient son potentiel à se différencier en plusieurs types de cellules différents et imite les caractéristiques in vivo des CNC, ce qui en fait un outil utile en vitro pour étudier la fonction des gènes et régulation moléculaire en CNC. Les différents statuts des cellules O9-1 peut correspondre à différents crête neurale progéniture en ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nicole Stancel, Ph.d., ELS, des Publications scientifiques de l’Institut de cardiologie de Texas, fourni un soutien éditorial. Nous remercions également les sources de financement suivantes : subvention de développement de l’American Heart Association nationale Centre scientifique (14SDG19840000 à J. Wang), le 2014 Lawrence Research Award de le Rolanette et Berthiaume Laurent osseuse maladie programme du Texas (à J. Wang ) et les instituts nationaux de santé (DE026561 et DE025873 J. Wang, DE016320 et DE019650 à R. Maxson).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

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