Des gènes induite par le vecteur de la thérapie génique des hépatocytes Ex Vivo pour Transplantation autologue chez le porc

Résumé

Ce protocole vise à décrire l’isolement et ex vivo livraison de gène porcin hépatocytes pour guérir des modèles de maladies métaboliques par autogreffe de cellules. Bien que ce modèle particulier bénéficie d’avantages uniques qui favorisent une thérapie réussie, l’application est une base pertinente pour traiter les indications et autres maladies.

Résumé

La thérapie génique est un choix idéal pour soigner les nombreuses erreurs innées du métabolisme du foie. Ex vivo, vecteurs LENTIVIRAUX ont été utilisées avec succès dans le traitement de nombreuses maladies hématopoïétiques chez l’être humain, car leur utilisation offre l’expression TRANSGENIQUE stable en raison de la capacité du vecteur d’intégrer dans le génome hôte. Cette méthode illustre l’application de la thérapie génique ex vivo des hépatocytes à un grand modèle animal de la tyrosinémie héréditaire de type I. Ce processus se compose de 1) isolation des hépatocytes primaires de l’animal donneur/receveur autologue, 2) ex vivo la livraison de gène par l’intermédiaire de transduction d’hépatocytes avec un vecteur lentiviral et greffe 3) autologue des hépatocytes corrigés via portail injection de la veine. Succès de la méthode s’appuie généralement sur une suppression efficace et stérile de la résection hépatique, prudente, manipulation de l’échantillon excisé, isolation des hépatocytes viables permettant de re-après, le pourcentage élevé de transduction des cellules isolées, et procédures chirurgicales aseptiques partout pour prévenir l’infection. Une défaillance technique à n’importe lequel de ces étapes se traduira par le faible rendement des hépatocytes de transduite viables pour greffe autologue ou infection de l’animal donneur/receveur. Le modèle de cochon de tyrosinémie héréditaire de type humain 1 (HT-1) choisi pour cette approche est particulièrement favorable à une telle méthode, car même un faible pourcentage de prise de greffe de cellules corrigées conduira au repeuplement du foie avec des cellules saines, basés sur un puissant avantage sélectif sur les hépatocytes natif-malades. Bien que cette sélection de croissance ne sera pas vraie pour toutes les indications, cette approche est une Fondation pour l’expansion dans d’autres indications et permet pour la manipulation de cet environnement pour traiter des maladies supplémentaires, tant à l’intérieur du foie et au-delà, tout en contrôle d’exposition aux vecteurs viraux et possibilité de toxicité hors cible et de la tumorigénicité.

Introduction

Erreurs innées du métabolisme du foie sont une famille de maladies génétiques affectant collectivement autant que 1 dans 800 naissances vivantes¹. Nombre de ces maladies sont monogéniques défauts² et peuvent être fonctionnellement guéries en introduisant une seule copie corrigée du gène affecté dans un nombre suffisant d’hépatocytes³. Le pourcentage réel d’hépatocytes qui doit être corrigée varie selon la maladie⁴ et est largement tributaire de la nature de la protéine qu'il encode, par exemple, les protéines sécrétoires versus cytoplasmique. Dans la plupart des cas, l’efficacité d’un traitement pour une maladie métabolique est facilement dosée par la présence de biomarqueurs souvent disponibles dans la circulation.

HT-1 est une erreur innée du métabolisme du foie qui résulte d’un défaut de fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)⁵, la dernière étape enzymatique dans le métabolisme de la tyrosine⁶. Carence en FAH mène à l’accumulation de métabolites toxiques dans le foie qui peut causer la mort et insuffisance hépatique aiguë ou dans la forme chronique de la maladie peut provoquer une cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Cliniquement, la maladie est gérée par l’administration de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inhibiteur d’une enzyme en amont de FAH dans le métabolisme de la tyrosine de petite molécule. La maladie fournit un environnement idéal permettant de tester les méthodes de thérapie génétique, comme correction réussie de même un petit nombre des hépatocytes entraînera finalement le repeuplement du foie entier avec cellules corrigées dans des modèles animaux petits et grands ^{7 , 8}. cela se produit car le corrigé, les cellules ont un avantage de survie profond sur des cellules non corrigés en raison de l’accumulation de métabolites toxiques dans ce dernier. La perte des hépatocytes non corrigés permet une expansion sélective des hépatocytes corrigées compatible avec la capacité de régénération du foie. Traitement peut être facilement suivie en mesurant la diminution des taux de tyrosine et succinylacetone TRANSPLATATION circulants.

Afin de justifier le caractère invasif de la procédure, qui comprend une hépatectomie partielle, l’objectif de cette approche doit être un remède durable. Vecteurs LENTIVIRAUX incompétent de réplication ne sont donc utilisés parce qu’ils intégreront stablement dans l’hépatocyte génome⁹. assurer la prestation du gène a été corrigé à toutes les cellules de fille comme le foie se développe et s’agrandit pour remplacer la perte rapide de cellules non corrigés. C’est avantageux sur les vecteurs viraux adéno associé (AAV), qui existe principalement extrachromosomale ne pouvant être transmises à une seule cellule fille au cours de la mitose¹⁰ , perdant ainsi tout effet de la thérapie en quelques semaines.

Bien qu’un nombre croissant de publications prend en charge la sécurité des lentivirus¹¹, préoccupations sur événements génotoxiques sont atténués en limitant la transduction des cellules de l’hôte dans un environnement contrôlé en vitro . Vecteur libre n’est jamais systémique introduit à l’hôte lorsque cette méthode est exécutée, limiter l’exposition aux hépatocytes qui sera réintroduit avec greffe autologue via la veine porte.

Ce rapport décrit la méthode de l’intervention chirurgicale et ex vivo les procédures utilisées pour isoler les hépatocytes pour la thérapie génique ex vivo et transplantation autologue ultérieure de¹² pour le traitement de la HT-1 cochon⁸. Le processus complet comprend 1) une hépatectomie partielle qui sert de source d’hépatocytes et une stimulation de la croissance pour du foie de l’hôte, 2) isolation des hépatocytes du foie excisés suivie ex vivo correction de gène et enfin 3) la réintroduction de la hépatocytes corrigés de nouveau dans l’hôte. La méthode décrite est applicable à tous les grands modèles animaux avec quelques modifications, mais seulement la FAH-deficient cochon¹³ aura l’avantage du milieu sélectif pour les hépatocytes corrigées.

Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices et ont été revus et approuvés par le Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier avant étude conduite. Procédures décrites ici ont été réalisées sur des porcs mâles et femelles grande ferme blanche (bagage génétique de Piéride du chou Landrace/50% 50 %) vers le haut à 3 mois d’âge qui sont réputées être sain et adapté à la chirurgie.  Animaux est logés socialement moins considérés comme incompatibles par le personnel de soins vétérinaires.  Animaux sont nourris des niveaux appropriés de chow deux fois quotidienne et observé des signes cliniques par le personnel de soins au moins une fois par jour.

1. préparation pour la chirurgie

1. Administrer 5 mg/kg telazol et xylazine 2 mg/kg par voie intramusculaire pour induire la sédation. Administrer la buprénorphine SR par voie sous-cutanée à une dose de 0,18 mg/kg pour l’analgésie postopératoire (prévoit une analgésie de cette dose sera jusqu'à 72 h). Vérifier manuellement l’animal pour les réponses vérifier la sédation.
2. Une fois sous sédation, insérer un cathéter intraveineux dans une veine périphérique oreille pour accès pharmacologique.
3. Administrer la céfazoline 25 mg/kg par voie intraveineuse et intramusculaire 5 mg/kg du ceftiofur pré-opératoire.
   1. Administrer le sérum physiologique par voie intraveineuse pour maintenir la pression artérielle et fréquence cardiaque dans les limites physiologiques normales pendant toute la procédure.
4. Placer un tube orogastrique pour décompresser l’estomac. Effectuer une intubation endotrachéale avec une sonde endotrachéale Fluxsol, vérifier le placement correct en comprimant la poitrine manuellement pour détecter l’exhalation et ensuite mécaniquement ventiler l’animal à l’isoflurane 1 à 3 %.
5. Placer le conduit de l’électrocardiogramme (ECG), brassard de tensiomètre, sonde de température et oxymètre de pouls à surveiller et enregistrer les signes vitaux. Placer l’animal dans une position en décubitus dorsal, frottez l’abdomen de la cage thoracique pour bassin avec betadine et drapé de sterilely.
6. Ventilez sujet à l’isoflurane 1 à 3 % au cours de la procédure pour maintenir un plan chirurgical de l’anesthésie. Continuer à surveiller les signes vitaux des changements et ajuster l’isoflurane en conséquence pour maintenir la fréquence cardiaque au niveau de l’incision avant si la pression artérielle diminue considérablement, réduire l’isoflurane et initier les agents approuvés sur le plan institutionnel pour restaurer la vitalité, tels que adrénaline par voie intraveineuse.
   1. Enregistrer la fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, la pression artérielle et la température corporelle sur un enregistrement de l’intervention chirurgicale pour suivre et maintenir le bien-être des animaux conformément à la politique propre à l’institution pour assurer la conformité avec les normes de bien-être animal grand.

2. laparoscopique hépatectomie partielle

1. Effectuer la première entrée de site en utilisant une technique de Hassen ouverte céphalique de l’ombilic. Lorsque péritoine est visualisé, sans risque d’introduire un trocart de 12 mm dans la cavité abdominale. Passer un 5 mm, 30°, portée par ce port.
2. Insuffler l’abdomen avec du CO₂ à 15 mmHg. Sous visualisation directe avec la caméra laparoscopique, placez deux ports supplémentaires 5 mm triangulation sur le lobe latéral gauche du foie. L’emplacement exact des ports dépendra de la taille et l’anatomie de l’animal.
   1. À ce stade, placez le laparoscope dans les ports de 5 mm.
3. Identifier le segment latéral gauche du foie au moment de la fissure majeure du lobe gauche. Cette fissure sépare les segments latéraux gauche et médicales. Sécuriser les structures portails ainsi que la veine hépatique le long de cette fissure à l’aide d’une agrafeuse chirurgicale (voir Table des matières). Transect le parenchyme par cette fissure à l’aide de tirs séquentiels de l’agrafeuse à l’aide de 60, 45 ou les charges de temps vasculaire de 30 mm.
   1. Lors de la résection parenchymateuse est terminée, évaluer le foie reste pour assurer l’hémostase suffisante. Contrôle des saignements du parenchyme avec cautérisation ou suture.
4. Récupérer la section du foie à l’aide de cautères endoscopiques et un sac de récupération de tissus endoscopique.
5. Supprimer les ports et refermer l’incision de port de 12 mm en trois couches avec suture interrompu taille 0 pour le carénage de la ligne médiane, une suture de 2-0 en cours d’exécution pour la couche dermique profond et une suture de 4-0 en cours d’exécution pour la couche sous-cuticulaires. Les ports de 5 mm peuvent être fermés en une seule couche avec 2-0.
6. Placer un pansement stérile sur les incisions (voir Table des matières).
7. Lorsque les cellules sera prêts en moins de 4 heures, maintenir les animaux sous anesthésie générale après l’opération jusqu’au moment de l’autogreffe.
8. Alternativement, si des manipulations de cellules nécessitent de plus longues périodes (par exemple pour permettre la formation de sphéroïdes hépatocytes ou de plus longues périodes de transduction/sélection basées sur des demandes individuelles de cette méthode) permettent à l’animal récupérer de l’anesthésie et répéter le étapes de l’induction anesthésique avant autogreffe quand les cellules sont prêtes.

3. isolement de l’hépatocyte

1. Raccorder une pompe péristaltique avec perfusion réglée pour délivrer des solutions chaudes de dispersion (conservées dans le bain d’eau de 43 ° C) des cathéters à placer dans les gros vaisseaux exposés de la section du foie, telle que la température de la solution est de 38 ° C lors de l’introduction au tissu. Tous les tuyaux, l’équipement et des solutions doivent être maintenues stériles pour s’assurer que les cellules ne conviennent pas à la transplantation.
   1. Amorcez la pompe et la tuyauterie avec par II jusqu'à un robinet placé pour passer par I et par II livraison au tissu. Basculer le robinet vers le rap j’ai positionner et amorcer le reste de la tubulure, remplissant un barboteur en ligne complètement pour éviter que l’introduction de bulles d’air dans le tissu.
2. Préparer une propre transversale coupée perpendiculairement à la circulation hépatique pour révéler les coupes des branches de la veine porte et les veines hépatiques au cathétérisme.
3. Section les veines apparentes disponibles avec un cathéter ajustés pour éviter les fuites du perfusat. Canule dans au moins 1 portail et 1 veine hépatique pour assurer une perfusion suffisante du tissu.
   1. Veiller à ce que les catheter(s) est pas apprêtée / d’air avant de placer le cathéter dans une veine.
4. Perfuse avec accueil chaleureux Per I à 100 mL/min, passer le tuyau de sortie de veine à veine toutes les 30 secondes à 1 min. de Cycle dans toutes les veines disponibles pendant 15 à 20 min. Pendant Per I infusion, mettre un tube d’évacuation de vider le bac de procédure dans un conteneur de déchets sous vide.
5. Basculez vers par II à 100 mL/min, vélo à travers les veines comme avec Per I, pour un total de 30 min. Par seconde, utilisez une pompe de retour à recycler par II vers le réservoir pour la remise en application conserver la préparation de l’enzyme active. Mettre la pompe de retour à moins que la pompe d’écoulement (c.-à-d. 94 mL/min), en veillant à ne pas revenir trop d’air dans la bouteille de la source.
   1. Si la capsule du foie se casse, ce temps peut être réduit.
   2. Si le foie n’est pas entièrement digéré (ne reste pas alvéolée par légère pression focale) une perfusion supplémentaire de 5 min peut être effectuée.
6. Parfois (environ toutes les 5 minutes) document de température de surface du barboteur et/ou foie pour assurer les hépatocytes ne reçoivent pas froids. Si le foie fait froid (< 35 ° C) augmenter la chaleur de l’eau du bain pour rétablir la température du foie plus près à 38 ° C. Le foie doit blanche à mesure que progresse la perfusion.
7. Retirez le foie à plaque stérile ou boîte de Pétri pour le transport à la hotte de la culture cellulaire. Couvrir un champ stérile avec un drap stérile pour maintenir l’intégrité lors du traitement de l’hépatocyte.
8. La section du foie de drap stérile et submerge le foie avec les médias de lavage froid hépatocytaire (HWM). Perturber la capsule en faisant glisser les ciseaux sur le dessus. Porter des gants stériles, massez délicatement le foie pour libérer les hépatocytes dans le milieu.
9. Filtrer la HWM contenant des hépatocytes à travers une gaze stérile dans des bouteilles de centrifugeuse grand (~ 200 mL). Lavez les hépatocytes par le biais de la procédure suivante en trois exemplaires, combinant le culot cellulaire des bouteilles multiples après la première remise en suspension (le cas échéant) :
   1. Centrifuger à 50 x g, 5 min, 4 ° C.
   2. Aspirer et resuspendre dans 150 mL d’HWM.
   3. Laisser le diabolo dans HWM après le lavage 3^rd .
10. Compter la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou tout autre dispositif, selon la disponibilité. Ces cellules sont maintenant prêts pour ex vivo manipulation intéressants, notamment la thérapie génique, cellulaire tri ou autre spécialisation avant autogreffe. Un volume final de HWM est réglable pour cibler une concentration spécifique (cellules/mL).

4. hépatocyte Transduction

1. Remettre en suspension les hépatocytes dans les médias (milieu d’eagle modifié de Dulbecco [DMEM], 10 % sérum de veau fœtal [BF], pénicilline-streptomycine, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic l’acide [HEPES], dexaméthasone, facteur de croissance épidermique [EGF] et NTBC) à 1 – 2 millions de cellules / mL dans un tube conique sur la glace.
2. Décongeler le vecteur lentiviral à température ambiante et ajouter dans un tube conique sur glace à multiplicité 20 cible d’infection (MOI) pour lier les cellules. Faire pivoter les cellules à 4 ° C à 10 tr/min pendant 90 min lier les vecteurs viraux à la surface des cellules.
3. Transférer les tubes à 37 ° C pendant 30 à 40 min. inverti de mélanger toutes les 5 minutes pour faciliter le vecteur transduction les cellules liées.
4. Centrifuger les cellules à 50 g à 4 ° C pendant 4 min. remettre culot dans une solution saline à la concentration désirée sur la glace. Répétez ce lavage pour garantir l’élimination de tout vecteur non lié de la préparation.
5. Si possible, la plaque des aliquotes suffisantes de cellules (par exemple, 500 000 cellules par puits dans un 6 bien plaque de culture cellulaire) pour vérifier la viabilité, l’efficacité de la transduction, adhérence, etc.
   Remarque : Il n’est souvent pas possible d’évaluer ces paramètres avant autogreffe, surtout pour les procédures du même jour. Par exemple, la procédure décrite dans les présentes employé un cDNA Fah non balisé sous le contrôle de l’alpha-1 antitrypsine foie spécifiques promoteur, qui n’était pas facilement vérifiable dans les hépatocytes avant la greffe. Cependant, ces cellules plaqués peuvent être dosés à la suite de l’autogreffe comme indicateur de la réussite de la transduction (c.-à-d., par Western Blot) ou un prédicteur de la réussite générale de la procédure.

5. hépatocyte Transplantation

1. Identifier la veine porte par ultrasons à l’aide d’un transducteur de 2 à 5 MHz. Diriger un 18 G, 5inch aiguille vers la veine porte principale proximale à sa bifurcation.
2. Commencer la perfusion manuelle lente du haut 1 x 10⁹ hépatocytes (environ 10 g) à l’aide d’une seringue. Mesurer des pressions portails au cours de la transplantation à l’aide d’un cathéter de perfusion.
   1. Si pressions portails une augmentation de plus de 8 mmHg au-dessus de base, faire une pause infusion et laissez la pression revenir à des niveaux de référence.
   2. Si la pression portale de ne pas retourne au niveau de référence après une pause infusion pendant cinq minutes, interrompre la perfusion.
3. Après la transplantation et le retrait du cathéter, utiliser l’échographie pour évaluer la présence d’accidents thrombotiques et transmettre le flux dans la veine porte.

6. maintenance et récupération post-opératoire

1. Se déplacer sous réserve d’une zone de récupération adéquate et observer jusqu'à ce que l’animal soit entièrement ambulatoire, monitoring cardiaque, saturation en oxygène et la température corporelle chaque 15 à 30 min. température corporelle maintenir avec couvertures chaudes ou un enveloppement d’air chauffé, selon les besoins.
2. Administrer l’omeprazole 1 mg/kg par voie orale tous les jours (jusqu'à la fin de l’étude) afin de réduire les chances de l’ulcère gastrique qui peut se produire avec des épisodes d’inappétence.
3. Après l’opération, l’animal est suivie de près par le laboratoire et le personnel vétérinaire et généralement ne nécessite pas d’analgésiques supplémentaires distincts de la dose de buprénorphine préopératoire.  Si on observe des signes de détresse/douleur par le personnel qualifié de soins vétérinaires (incision gardiennage, inappétence, léthargie), agents anti-inflammatoires (c.-à-d. Carprofen) peuvent être administrés.

7. recettes

1. Voir le tableau 1 pour les recettes utilisées dans le présent protocole.

Réactif	LIGNE DES HAUTES EAUX	Réactif	Per I (x 10)	Par II (x 10)
Williams-E poudre (g/L)	10,8	NaCl (g/L)	83	39
NaHCO3 (g/L)	2.2	KCl (g/L)	5	5
HEPES (g/L)	2.6	HEPES (g/L)	24	240
Stylo/Strep (100 x, mL/L)	10	EGTA (g/L)	9.5	-
Sérum de veau fœtal (mL/L)	100	N-acétyl-L-cystéine	8	8
pH	7.3	(N-A-C, g/L)
		Nitroglycérine (mL/L)	5	5
		CaCl2 2 H2O (g/L)	-	7
		Collagénase D (mg/mL)	-	0,2
		pH	7.4	7.6

Tableau 1 : Recettes pour les Solutions utilisées hépatocytes isolés de Sections du foie.

Résultats

La résection du foie et transplantation autologue sont représentés schématiquement à la Figure 1. Dans une cohorte représentative de 5 porcs qui a subi une résection hépatique, la plupart avaient des rendements de > 1 x 10⁹ hépatocytes avec environ 80 % de viabilité (tableau 2), offrant beaucoup de cellules de n’importe quel type de désiré des manipulations, y compris le gène thérapie. Culture subséquente de la por...

Discussion

Le présent rapport décrit une approche ex vivo gène autologue thérapie pour guérir un modèle porcin de HT-1. Il s’agit d’une hépatectomie partielle, suivie par ex vivo d’isolement de l’hépatocyte et transduction d’hépatocytes isolés avec lenti virus transportant le transgène correctif. Corrigée des hépatocytes autologues sont alors transplantés vers l’animal déficient FAH par l’intermédiaire de la veine porte⁸. Bien que la méthode décrite est appli...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314