Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez Escherichia coli

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli en exprimant conjointement un ARN chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt à un échafaudage viroïde et une usine ligase d’ARNt. Le produit principal est une molécule circulaire qui facilite la purification jusqu'à homogénéité.

Résumé

Avec un intérêt croissant dans biologie des ARN et de l’utilisation de molécules d’ARN dans des applications biotechnologiques sophistiquées, les méthodes pour produire de grandes quantités d’ARN recombinant sont limités. Nous décrivons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli , basé sur la co-expression de molécule chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt dans un échafaudage viroïde et une usine de ligase d’ARNt. Viroïdes sont relativement petites, non codante, fortement couplé base ARN circulaire qui est infectieux aux plantes supérieures. L’hôte plante tRNA ligase est une enzyme recrutée par les viroïdes qui appartiennent à la famille Avsunviroidae, tels que l' aubergine viroid latent (ELVd), comme médiateur circularization RNA lors de la réplication viroïde. Bien que ELVd ne se répliquent pas dans e. coli, un précurseur ELVd est efficacement transcrits par l’ARN polymérase d’e. coli et traité par les ribozymes hammerhead embarqués dans des cellules bactériennes et les monomères résultants sont prospectés par la ligase d’ARNt exprimée conjointement pour atteindre une concentration remarquable. L’insertion d’un ARN d’intérêt dans l’échafaudage ELVd permet la production de dizaines de milligrammes de recombinant RNA par litre de culture bactérienne dans des conditions de laboratoire réguliers. Une fraction principale du produit RNA est circulaire, une fonctionnalité qui facilite la purification de l’ARN recombiné à l’homogénéité de virtuelle. Dans le présent protocole, un ADN (cDNA) complémentaire correspondant à l’ARN d’intérêt est inséré dans une position particulière du cDNA ELVd dans un plasmide d’expression qui est utilisé, le long du plasmide d’exprimer conjointement aubergine ligase d’ARNt, pour transformer les e. coli. La co-expression de ces deux molécules sous le contrôle des promoteurs constitutifs fortes mène à la production de grandes quantités de l’ARN recombiné. L’ARN recombiné peut être extrait des cellules bactériennes et séparé de la majeure partie des ARN bactérien en profitant de sa circularité.

Introduction

Contrairement à l’ADN et les protéines, les protocoles pour simple, efficace et rentable de production de grandes quantités d’ARN ne sont pas abondantes. Cependant, recherche et industrie demande augmentant les montants de ces biomolécules pour étudier leurs propriétés biologiques uniques¹ou devant être utilisés dans sophistiquée des applications biotechnologiques, y compris leur utilisation comme aptamères hautement spécifiques ², agents thérapeutiques³ou pesticides sélectifs⁴. Transcription in vitro et synthèse chimique sont couramment utilisés en recherche pour produire des RNA. Cependant, ces méthodes entraînent des limitations importantes lorsque de grandes quantités de produits sont nécessaires. L’alternative logique consiste à utiliser la machinerie de transcription endogène des cellules vivantes, suivie d’un processus de purification pour séparer les compagnons cellulaires de l’ARN d’intérêt. Suite à cette stratégie, des méthodes ont été développées pour produire des ARN recombinants dans des cellules bactériennes, telles que le laboratoire de l’environnement Escherichia coli⁵ ou la marine violet phototrophe alpha-protéobactérie Rhodovolum sulfidophilum ⁶. la plupart des méthodes pour produire des ARN recombiné dans les bactéries s’appuient sur l’expression d’un échafaudage de RNA extrêmement stable indigène, tels qu’un ARNt ou un ARNr, dans lequel l’ARN d’intérêt est inséré⁷. Cela impose la nécessité de libérer l’ARN d’intérêt hors de la molécule chimérique, si la présence d’ARN supplémentaire est un problème pour les applications en aval à⁸. Un autre concept en recombinant biotechnologie RNA est la production des complexes ribonucléoprotéiques recombinant qui peut être le produit désiré en soi ou utilisés comme une stratégie de protection pour augmenter la stabilité de l’ARN d’intérêt^{9, 10}. De même, la production d’ARN circulaire a également été suggérée comme une stratégie visant à générer la plus stable de produits¹¹.

Nous avons récemment développé une nouvelle méthode pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans e. coli qui participe à trois des concepts ci-dessus : l’insertion de l’ARN d’intérêt dans un échafaudage de RNA circulaire très stable et la co-expression de la ARN recombiné avec une protéine d’interaction pour produire probablement un complexe ribonucléoprotéique stable qui s’accumule en quantités remarquables dans bacterial cells¹². Par contraste avec les développements précédents, nous avons utilisé un échafaudage de RNA totalement étranger à e. coli, à savoir un viroïde. Viroïdes sont un type très particulier d’agents infectieux des plantes supérieures qui sont exclusivement constitués par une relativement petite (nt 246-401) fortement couplé base circulaire RNA¹³. Fait intéressant, les viroïdes sont non-coding RNAs et, sans aide de leurs propres protéines, ils sont capables de remplir des cycles complexes infectieuses dans les hôtes infectés¹⁴. Ces cycles incluent la réplication de l’ARN-à-ARN dans les noyaux ou les chloroplastes, selon la famille du viroïde —Pospiviroidae ou Avsunviroidae, respectivement — mouvement à travers la plante infectée et l’évasion de la réponse défensive de l’hôte. Viroïdes doivent être classés parmi les ARN plus stables dans la nature, par suite d’avoir un ARN circulaire nue et devoir survivre dans l’environnement hostile des cellules végétales infectés. Cette propriété peut rendre les viroïdes particulièrement adapté comme les échafaudages pour stabiliser recombinant RNA dans les approches biotechnologiques. En outre, la nouvelle méthode s’inspire de la co-expression de l’échafaud viroïde avec une interaction protéine végétale. Viroïdes se répliquent via un mécanisme de cercle roulant dans quel hôte enzymes sont recrutés pour catalyser les différentes étapes du processus. Notamment certains viroïdes, plus particulièrement ceux qui appartiennent à la famille Avsunviroidae¹⁵contiennent des ribozymes également impliqués dans la réplication. Selon l’espèce viroïde, transcription du viroïde RNAs est médiée par l’hôte de l’ARN polymérase II ou le chloroplaste codées ARN polymérase (NEP). Traitement du viroïde RNA semble être catalysée par un hôte type III RNase, bien que dans les viroïdes ribozymes ARN oligomériques intermédiaires cleave automatique lors de la réplication. Enfin, les monomères viroïde qui en résultent sont prospectés, selon la famille du viroïde, par la hôte DNA ligase 1 ou l’isoforme chloroplastique de tRNA ligase^16,17. Cette dernière enzyme est impliquée dans la ligature des formes monomères des viroïdes appartenant à la famille Avsunviroidae, tels que l' aubergine viroid latent (ELVd)¹⁸.

Dans le cadre d’un travail d’analyser les exigences structurelles et séquence de ELVd qui déterminent la reconnaissance de l’aubergine (Solanum melongena L.) ligase d’ARNt, nous avons mis en place un système expérimental basé sur la co-expression de ces deux molécules chez e. coli ¹⁹. nous avons remarqué que transcriptions ELVd plus-que-unit cleave automatique efficacement dans les cellules d’Escherichia coli par les ribozymes hammerhead incorporé et que les résultante monomères viroïde avec 5'-hydroxyle et 2', 3'-phosphodiester termini était prospectés efficacement par la ligase d’ARNt aubergine conjointement exprimé. Plus encore, l’ARN viroïde circulaire qui en résulte atteint une concentration élevée inattendue chez e. coli, supérieures à celles de l' endogène rRNA¹². Absence d’intermédiaires de réplication a indiqué manque d’amplification ELVd ARN-à-ARN dans ces cellules bactériennes. Fait intéressant, insertion de RNAs hétérologues dans une position particulière de la molécule du viroïde avait un effet modéré sur l’accumulation de l' ARN circulaire viroïde dérivés¹². Ces observations nous a fait imaginer une méthode pour produire de grandes quantités de recombinaison ARN chez les bactéries. Dans cette méthode, l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt sont insérés dans le cDNA ELVd et l’ARN chimérique qui en résulte est exprimée chez e. coli par un promoteur constitutif fort. Pour le système fonctionne, e. coli doit être transformé conjointement avec un plasmide d’exprimer la ligase tRNA aubergine. La transcription de plus-que-unit ELVd-dérivé est traitée par les ribozymes hammerhead embarqués et les monomères qui en résulte avec la termini appropriée sont reconnus et prospectés par la ligase tRNA conjointement exprimé. De cette façon, l’ARN d’intérêt est insérée dans un échafaudage circulaire très stable composé de la molécule circulaire viroïde. Cet ARN chimérique recombinant est très probablement encore stabilisé à l’intérieur des cellules d’Escherichia coli par la formation d’un complexe grâce à l’interaction avec la ligase d’ARNt ribonucléoprotéique. En utilisant cette méthode (voir le protocole ci-dessous), RNA aptamères, hairpin RNAs et autres ARN structurés ont été produites en quantités de dizaines de milligrammes par litre de culture d’e. coli dans des conditions de laboratoire réguliers et purifiée jusqu'à homogénéité prenant facilement avantage de circularité¹².

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Protocole

1. Construction de plasmide

1. Amplification par PCR (ou par transcription inverse PCR si partant d’un modèle de RNA) l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt en utilisant des amorces avec extension de 5' pour permettre à l’Assemblée dans le plasmide d’expression. Pour éviter des mutations indésirables, utilisez une ADN polymérase haute fidélité.
   1. Pour insérer l’ADNc dans le plasmide d’expression par Gibson Assemblée²⁰, ajoutez les extensions suivantes 5' pour les amorces PCR : vers l’avant, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; inverse, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X représente les nucléotides homologues aux extrémités terminales de l’ARN d’intérêt.
   2. Incuber pendant 30 s à 98 ° C, suivi de 30 cycles de 10 s à 98 ° C, 30 s à 55 ° C et 30 s à 72 ° C et une extension finale de 10 min à 72 ° C.
2. Digest 100 ng de plasmide pLELVd-BZB avec 10 U de l’enzyme de restriction de type IIS Bpi j’ai pendant 1 h à 37 ° C dans une réaction de 20 µL dans un 0,5 mL tube dans un tampon G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL de BSA).
   Remarque : Tous les plasmides sont disponibles sur demande à l’auteur correspondant. BPI J’ai équivaut à Bbs je.
3. Séparer les produits de la digestion et PCR par électrophorèse sur un gel d’agarose de 1 % dans un tampon TAE (40 mM Tris, 20 mM d’acide acétique, EDTA 1 mM, pH 7,2). Souillez le gel pendant 15 min en secouant dans 200 mL 0,5 µg/mL de bromure d’éthidium. Visualiser l’ADN à l’aide d’un Transilluminateur UV et couper les bandes correspondant à l’ADNc amplifié et le Bpi j’ai digéré plasmide (bp 2046) à l’aide d’une lame de bistouri.
   Remarque : BPI J’ai la digestion des pLELVd-BZB libère également un produit bp 528 correspondant au journaliste LacZ bleu-blanc.
4. Éluer les ADN des fragments gel à l’aide de colonnes de gel de silice (gel kit de récupération d’ADN dans la Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN par analyse spectrophotométrique.
5. Mettre en place une réaction de l’Assemblée de Gibson à l’aide de l’ADNc amplifié et le plasmide digéré. Utiliser un excès molaire 3 voies de l’insert par rapport à vecteur²⁰. Incuber pendant 1 heure à 50 ° C et purifier les produits de la réaction à l’aide d’une colonne de gel de silice (ADN propre & kit de concentrateur dans la Table des matières).
6. Utiliser les produits purifiés de la réaction de l’Assemblée de Gibson à oligonucléotides compétente e. coli DH5α cellules. À l’aide de cuves d’électroporation de 1 mm, appliquer les paramètres suivants : 1 500 V et 5 Mme incuber pendant 1 h à 37 ° C dans la bouillon super optimisé avec la répression catabolique (SOC ; tryptone 20 g/L, extrait de levure 5 g/L, 0,5 g/L de NaCl, KCl, 10 mM MgCl₂ 2,5 mM 20 mM de glucose, pH 7,0) milieu liquide et puis propagation sur Luria-Bertani (LB, tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L, 10 g/L de NaCl) plaques contenant 50 ampicilline de µg/mL de gélose (1,5 %).
   1. Pour dépister les colonies correspondant à transformé e. coli clones qui probablement constituée de l’insert, 15 min avant l’électroporation des cellules, de placage diffuser 30 µL de 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) dans diméthylformamide. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C.
7. Choisissez plusieurs colonies blanches et se développer pendant une nuit à 37 ° C dans un milieu liquide LB. Purifier les plasmides en utilisant un miniprep kit (voir Table des matières) et analyser leurs tailles par électrophorèse sur un gel d’agarose de 1 % dans un tampon TAE.
8. Sélectionnez le plasmide recombinant probablement basé sur la migration électrophorétique par rapport au contrôle pLELVd-BZB. Confirmer la séquence du plasmide sélectionné par séquençage à l’aide d’amorces 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' et 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' qui flanquent la cassette d’expression tout en pLELVd-BZB.
   Remarque : N’oubliez pas que ce plasmide contienne un polylinker bp 528 avec le marqueur LacZ qui est remplacé par le cDNA d’intérêt. Cartographie de restriction peut aider à sélectionner les plasmides recombinants droite.

2. Expression de l’ARN

1. Co-electroporate (voir conditions au point 1.6) le certains e. coli souche (e. coli BL21 ou un dérivé BL21) avec le pLELVd-BZB-dérivé qui contient l’ADNc correspondant à l’ARN d’intérêt et le plasmide p15LtRnlSm exprimer conjointement le aubergine ligase d’ARNt. Utiliser les e. coli HT115(DE3), qui manque de RNase III²¹, pour exprimer RNAs avec régions de long double-brin.
   Remarque : Les deux l’ARN d’intérêt et la ligase tRNA ARNm sont transcrits par l’ARN polymérase d’e. coli . Aucun lysogène DE3 à express ARN polymérase T7 n’est requise dans la souche e. coli , bien que la présence de cette lysogène n’a aucun effet nuisible.
2. Après 1 h d’incubation à 37 ° C dans un milieu liquide SOC, plaque électroporation de bactéries dans le milieu solid LB contenant 50 µg/mL ampicilline et 34 chloramphénicol µg/mL. Incuber une nuit à 37 ° C.
3. Prélever une colonie et ensemencer un 1 L dérouté erlenmeyer de 250 ml de liquide bouillon formidable (TB) milieu (12 g/L tryptone, 24 g/L extrait de levure, 0,4 % de glycérol, 0,17 M KH₂PO₄et 0,72 M K₂HPO₄), contenant 50 ampicilline µg/mL et 34 µg/mL au chloramphénicol. Incuber à 37 ° C sous agitation vigoureuse à 180 tours / minute (tr/min). Récolter des bactéries entre 12 et 16 h après l’inoculation de la culture.

3. purification et Extraction de l’ARN

1. À des fins analytiques, prendre 2 ml de la culture aux points temps désiré et centrifuger à 14 000 x g pendant 2 min. jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 et 1 mM EDTA) au vortex.
   1. Ajouter un volume (50 µL) d’un mélange de 1:1 (v/v) de phénol (saturé d’eau et équilibrées à pH 8.0 avec Tris-HCl, pH 8,0) et le chloroforme. Briser les cellules au vortex vigoureux et séparer les phases aqueuses et organiques par centrifugation pendant 5 min à 14 000 x g.
   2. Soigneusement récupérer les phases aqueuses (en haut) qui contient de l’ARN bactérien total.
      Remarque : Les préparations peuvent être stockées à-20 ° C pour une analyse ultérieure.
2. Fins préparative, versez la culture dans un flacon de 250 mL Centrifugeuse et la centrifuger les cellules à 14 000 x g pendant 10 min. jetez surnageant. Laver les cellules par resuspendant dans 30 mL d’eau. Transférer dans un tube à centrifuger et faire tourner les cellules à nouveau dans les mêmes conditions.
3. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon par chromatographie (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0. 2 mM EDTA) au vortex.
   Remarque : En ce moment, les cellules peuvent être congelés à-20 ° C à procéder à la purification à tout autre moment.
4. En utilisant une préparation bactérienne fraîche ou décongelée, briser les cellules en ajoutant 1 volume (10 mL) de phénol : chloroforme (Voir l’étape 3.2) et mélangé au vortex vigoureusement.
5. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 x g, récupérer la phase aqueuse et réextraire et 1 volume (10 mL) de chloroforme dans les mêmes conditions.
   Remarque : La préparation d’ARN peut être stockée à-20 ° C à ce stade.
6. Encore purifier l’ARN bactérien total par chromatographie échangeuse d’anions. Filtrer la préparation d’ARN grâce à une seringue-filtre m 45 et la charge sur une colonne de diethylethanolamine (DEAE) de 1 mL.
   1. Pour la purification par chromatographie, utilisent un système de chromatographie en phase liquide à un débit de 1 mL/min. Avant l’échantillon de chargement, équilibrer la colonne avec 10 mL de tampon par chromatographie (Voir l’étape 3.3 pour la composition).
   2. Charger l’échantillon et laver la colonne avec 10 mL de tampon par chromatographie. Éluer RNA avec 20 mL de tampon d’élution (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0. 2 mM EDTA) et recueillir des aliquotes de 1 mL.
      Remarque : RNA élué rapidement dans les fractions initiales. La colonne peut être réutilisée pour plus amples des purifications. Pour cela, laver la colonne avec 10 mL d’eau et conserver à 4 ° C à 20 % d’éthanol.
7. Depuis la majeure partie de la recombinaison que RNA s’accumule chez e. coli dans une forme circulaire, cette propriété peut être profitée pour la purification d’homogénéité¹². Séparer les ARN circulaires les homologues linéaires par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à deux dimensions (PAGE 2D) combinant non dénaturants et dénaturation (8 M urée) conditions^12,22.

4. analyse de l’ARN

1. Préparer un gel de polyacrylamide de 5 % (37.5:1 acrylamyde :N, N'- methylenebisacrylamide, rapport de masse) en TBE tampon (89 mM Tris, d’acide borique 89 mM, 2 mM EDTA) contenant 8 M urée.
2. Mélanger 20 µL de préparations d’ARN et 1 volume (20 µL) de chargement d’un tampon (98 % formamide, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, bleu de bromophénol 0,0025 % et 0,0025 % de xylène cyanol), incuber pendant 1,5 minutes à 95 ° C dans un bloc chauffant et snap refroidir sur glace.
3. Charger les échantillons dans le gel de polyacrylamide et exécuter l’électrophorèse à des conditions appropriées en fonction des dimensions de gel (par exemple, exécutez 140 x 130 x 2 mm gels pour 2,5 h à 200 V). Souillez le gel pendant 15 min dans le bromure d’éthidium 0,5 µg/mL, laver avec de l’eau et visualiser les RNA sous la lumière UV.

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Résultats

Pour produire le recombinant RNA chez e. coli en utilisant le système dérivé de ELVd¹², l’ARN d’intérêt est greffée sur un échafaudage ELVd ARN. Cet ARN chimérique est exprimé conjointement le long de la ligase d’ARNt aubergine chez e. coli. Une fois traitées, clivés et prospectés, l’ARN circulaire chimérique, qui dépasse de l’ARN d’intérêt, constitue sans doute une ribonucléoprotéine complexe avec l’enzyme aubergin...

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Discussion

Tout en cherchant la séquence ELVd et exigences de structure impliquées dans la reconnaissance de la ligase tRNA aubergine, nous avons remarqué que la co-expression de chacune des molécules dans les non-hôtes de e. coli a conduit à une accumulation importante inattendue du viroïde circulaire formules dans les cellules bactériennes,¹⁹. Nous avons compris que la grande accumulation du viroïde RNA chez e. coli est très probablement la conséquence d’exprimer conjointemen...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G