JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans cet article, nous décrivons les protocoles de détermination d’expression, purification, la cristallisation et la structure de la protéine du domaine N-terminal du récepteur à la ryanodine de teigne des crucifères (Plutella xylostella).

Résumé

Développement des insecticides puissants et efficaces ciblant les récepteurs de la ryanodine insectes (RyRs) a été d’un grand intérêt dans le domaine de la lutte contre les parasites agricoles. A ce jour, plusieurs diamide insecticides ciblant les ravageurs que ryrs ont été commercialisés, qui génèrent un revenu annuel de 2 milliards de dollars US. Mais la compréhension du mode d’action des insecticides RyR ciblage est limitée par le manque d’informations structurelles concernant les insectes RyR. Ceci limite à leur tour comprendre le développement de la résistance aux insecticides de ravageurs. La teigne des crucifères (DBM) est un ravageur dévastatrice, détruisant les crucifères cultivées dans le monde entier, qui a également été signalé à montrer aux diamide insecticides. Par conséquent, il est d’une grande importance pratique pour développer de nouveaux insecticides ciblant le RyR DBM, ciblant plus particulièrement une région différente de l’accepteur diamide traditionnels. Nous présentons ici un protocole afin de caractériser structurellement le domaine N-terminal de RyR de DBM. La structure cristalline a été résolue par le remplacement moléculaire à une résolution de 2,84 Å, qui montre un motif de bêta-trefoil pliable et une accompagnement hélice alpha. Ce protocole peut être adapté pour l’expression, de purification et de caractérisation structurale des autres domaines ou des protéines en général.

Introduction

Récepteurs de la ryanodine (RyRs) sont des canaux ioniques spécifiques qui négocient la pénétration des ions Ca2 + à travers les membranes du réticulum sarcoplasmique (RS) dans les cellules musculaires. Par conséquent, ils jouent un rôle important dans l’excitation contraction processus de couplage. Dans sa forme fonctionnelle, RyR assemble comme un homo-tétramère ayant une masse moléculaire de > 2 MDa, avec chaque sous-unité comportant des résidus d’acides aminés ~ 5000. Chez les mammifères, il existe trois isoformes : RyR1 - type de muscle squelettique, le muscle cardiaque type de RyR2 - et RyR3-ubiquitaire exprimés dans différents tissus1.

Chez les insectes, il y a qu’un seul type de RyR, qui s’exprime dans le tissu musculaire et nerveuse2. RyR insecte est plus proche de mammifères RyR2 avec une identité de séquence d’environ 47 %3. Diamide insecticides ciblant RyR de lépidoptères et coléoptères ont été développés et commercialisés par grandes entreprises telles que Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) et Syngenta (cyantraniliprole). Depuis sa création relativement récente, diamide insecticides sont devenus un de la classe plus forte croissance d’insecticides. Actuellement, les ventes de ces trois insecticides par an ont franchi les 2 milliards de dollars avec un taux de croissance de plus de 50 % depuis 2009 (Agranova).

Des études récentes ont signalé l’apparition d’une résistance chez les insectes après quelques générations d’utilisation de ces insecticides4,5,6,7,8. Les mutations de résistance dans le domaine transmembranaire de RyRs de la teigne des crucifères (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) et aux emplacements correspondants à la mineuse de la tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) montrent que la région pourraient être impliqués dans la liaison de diamide insecticides comme cette région est connue pour être critique pour le processus de blocage du canal4,8,9. Malgré des recherches approfondies dans ce domaine, les mécanismes moléculaires exacts de diamide insecticides demeurent insaisissables. En outre, on ignore si les mutations de résistance influent sur les interactions avec les diamides directement ou de façon allostérique.

Des études antérieures ont révélé la structure de plusieurs domaines de RyR d’espèces de mammifères et la structure de RyR1 mammifères pleine longueur et RyR2 par cristallographie aux rayons x et microscopie de cryo-électronique, respectivement10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Mais jusqu’ici, aucune structure d’insecte RyR n’a été signalée, qui nous interdit de saisir la complexité moléculaire de la fonction des récepteurs ainsi que les mécanismes moléculaires d’action insecticide et le développement de la résistance aux insecticides.

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole généralisé pour la caractérisation du domaine β-trefoil N-terminale du récepteur à la ryanodine de la teigne des crucifères, un ravageur qui infectent les crucifères cultivées dans le monde entier22. La construction a été conçue selon le lapin publiées RyR1 NTD crystal structures23,24et la cryo-EM modèles structuraux16,17,18,19, 20 , 21. il s’agit de la première structure à haute résolution pour insecte RyR, qui révèle le mécanisme de blocage du canal et fournit un modèle important pour le développement des insecticides spécifiques à l’aide de conception de médicaments basée sur la structure. Pour l’élucidation de la structure, nous avons utilisé la cristallographie aux rayons x, qui est considérée comme le « gold standard » pour la détermination de structure de protéine à près de résolution atomique. Bien que le processus de cristallisation est imprévisible et demande beaucoup de travail, le présent protocole étape par étape aidera les chercheurs à exprimer, de purifier et de caractériser les autres domaines d’insecte RyR ou tout autres protéines en général.

Protocole

1. clonage de gènes, Expression de la protéine et de Purification

  1. PCR amplification ADN correspondant à la protéine d’intérêt (résidus 1-205 de DBM RyR, Genbank ACC. no. AFW97408) et le clone en pET-28 a-HMT vecteur de clonage de ligature indépendante (LIC)25. Ce vecteur contient une étiquette histidine, tag MBP et un site de clivage de protéase TEV à l’extrémité N-terminale15.
    1. Concevoir des amorces LIC pour l’amplification du gène cible avec extensions 5' LIC-compatibles :
      Notions fondamentales de la LIC vers l’avant :
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Notions fondamentales de la LIC inverse :
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
    2. Combiner les éléments de réaction (50 μL) : 1 μL de matrices d’ADN (100 ng/μL), 1 μL d’apprêt avant (10 μM), 1 μL d’apprêt inverse (10 μM), 0,5 μL de l’ADN polymérase (NEB), 5 μL de réaction 10 x buffer, 1 μL de dNTP (25 mM) , 40,5 μL de RNase libre ddH2O.
      1. Placer le mélange réactionnel dans une machine PCR et exécuter le programme suivant.
      2. Incuber à 95 ° C pendant 3 min, et puis exécutez 30 cycles de (95 ° C pendant 30 s, 58 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 1 min). Incuber à 72 ° C pendant 5 min et puis maintenez à 4 ° C.
      3. Exécuter le mélange toute réaction (50 μL) sur un gel d’agarose à 2 % et extraire avec un Kit d’Extraction de Gel. Suivre le protocole du fabricant.
    3. Clonage de ligature indépendante (LIC)
      1. Effectuer la digestion SspI (60 μL) : 20 μL de vecteur ADN (50 ng/μl), 6 μL de 10 x tampon de réaction, 4 μL de SspI et 30 μL de ddH2O. Incuber à 37 ° C pendant 3 h exécuter la réaction toute mélanger sur gel d’agarose à 1 % et extraire avec un Kit d’Extraction de Gel. Suivre le protocole du fabricant.
      2. Effectuer un traitement T4 ADN polymérase du vecteur et insérer l’ADN. Combinez ce qui suit : 5 μL d’ADN vecteur ou insert (50 ng/μl), 2 μL de tampon de l’ADN polymérase 10 x T4, 1 μL de dGTP (25 mM) pour les vecteurs ou/et 1 μL de dCTP (25 mM) pour l’insert d’ADN, 1 μL de TNT (100 mM), 0,4 μL de T4 ADN polymérase (LIC-qualifié) et 9,6 μL de ddH2O. Incuber réactions à température ambiante pendant 40 min. chaleur-inactiver les enzymes à 75 ° C pendant 20 min.
        Remarque : Le vecteur LIC et insérer l’ADN doivent être traités dans les réactions distinctes.
      3. Effectuer la LIC recuit de réaction. Combinez ce qui suit : 2 μL d’ADN insert imprégnées de T4, 2 μL de LIC traités T4 vecteur ADN. Incubez la réaction à température ambiante pendant 10 min.
  2. Transformer BL21 (DE3) e. coli cellules avec ce plasmide recombinant.
    1. Décongelez les cellules compétentes (50 μL en micro-centrifuge tube) sur la glace.
    2. Ajouter environ 1 μL (50 ng) du plasmide dans le tube. Mélanger les cellules et l’ADN de chiquenaude doucement le tube de 2 à 3 fois. Placer le tube sur la glace pendant 20 min.
    3. Chauffer choc à 42 ° C pendant 40 s. Place le tube sur la glace à nouveau pendant 2 min. Ajouter 1 mL de température ambiante LB médias au tube.
    4. Placer le mélange dans le shaker 250 tr/min à 37 ° C pendant 45 min. diffuser 150 – 200 µL du mélange sur les plaques de sélection. Retournez la plaque et incuber une nuit à 37 ° C.
  3. Choisir une seule colonie et la culture des cellules dans un milieu de 2YT de 100 mL contenant 50 kanamycine µg/mL à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain matin, inoculer 1 L 2YT milieu contenant 50 kanamycine µg/mL avec 10 mL d’une culture et incuber à 37 ° C un incubateur shaker à 250 tr/min, jusqu'à ce que l' OD600 atteint 0,6 ~. Par la suite induire la culture avec l’IPTG à une concentration finale de 0,4 mM et se développer pendant un autre 5 h à 30 ° C.
  4. Récolter les cellules par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 ° C, de recueillir les cellules et de resuspendre chaque cellules de 10 g dans 40 mL de tampon de lyse (10 mM HEPES pH 7,4, KCl 250 mM, 10 mM β-mercaptoéthanol, lysozyme du 25 μg/mL, 25 μg/mL DNase PMSF 1 mM).
    1. Il perturber par sonication à 65 % amplitude pendant 8 min avec 1 s s 1 sur off. Enlever les débris de cellules par centrifugation à 40 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. Filtrer le liquide surnageant en passant par 0,22 μm filtre et chargez-le dans la boucle d’échantillonnage.
  5. Purifier la protéine de fusion, Cliver la balise et re-purifier la protéine cible.
    1. Purifier la protéine de fusion à l’aide de colonne Ni-NTA (tampon de liaison : 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl ; tampon d’élution : 10 millimètres HEPES pH 7,4, KCl, imidazole de 500 mM à 250 mM) et purifier par un système de purification, avec un dégradé linéaire de l’imidazole de 20 à 250 mM.
    2. Fendre la protéine éluée cible avec la protéase TEV (01:50 ratio) durant la nuit à 4 ° C.
    3. Purifier le mélange réactionnel de clivage à l’aide de la colonne de résine d’amylose (tampon de liaison : 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl ; tampon d’élution : 10 millimètres HEPES pH 7,4, KCl, maltose de 10 mM à 250 mM) et Ni-NTA colonne pour supprimer la balise et la protéase TEV. La protéine cible sera la fraction intermédiaire de ces deux colonnes.
    4. Dialyser l’échantillon contre tampon de dialyse (10 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM β-mercaptoéthanol pour réduire la concentration de sel. Purifier l’échantillon sur une colonne échangeuse d’anion (tampon de liaison : 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM β-mercaptoéthanol ; tampon d’élution : pH 10 mM Tris-HCl 8.8, KCl, 10 mM β-mercaptoéthanol 1 M) par un dégradé linéaire de 20 à 500 mM KCl dans le tampon d’élution.
    5. Comme dernière étape dans le processus de purification, concentrer la protéine à l’aide de concentrateur centrifuge (10 kDa MWCO) et injecter dans une colonne de gel filtration Superdex 200 26/600 pour vérifier l’homogénéité.
  6. Examiner la pureté de la protéine en l’exécutant sur une PAGE de la SDD 15 %.
    Remarque : Toutes les colonnes sont en cours d’exécution sur un système de purification de protéine avec un débit de liaison de 2 mL/min et une vitesse d’écoulement d’élution de 4 mL/min, à l’exception de la gel-filtration à 1 mL/min.

2. cristallisation et préparation de protéines

  1. Concentrer l’échantillon protéique purifié à 10 mg/mL à l’aide de concentrateur centrifuge (10 kDa MWCO) et l’échange tampon tampon de cristallisation avant de le stocker à-80 ° C.
  2. Effectuer le dépistage de la cristallisation (ratio 1:1, 200 nL de protéine et 200 nL de tampon de réservoir) par la séance abandonner la méthode de diffusion de vapeur à 295 K avec plusieurs kits de cristallisation à l’aide d’un liquide automatisé système robotisé dans un format 96 puits de manutention.
    Remarque : Nous avons utilisé des kits de recherche Dimensions moléculaires et Hampton et le Gryphon automatisé système de manipulation de liquides.
  3. Sceller la plaque 96 puits cristallisation pour éviter l’évaporation et de permettre à l’équilibration de la baisse de la protéine avec le tampon de réservoir. Alors gardez les plaques dans l’incubateur de cristal à 18 ° C.
  4. Vérifier les plaques de 96 puits périodiquement à l’aide d’un microscope optique pour surveiller la croissance et la formation de cristaux.
  5. Pour différencier les cristaux protéiques de cristaux de sel, utiliser un colorant de la protéine. Ajouter 1 µL de colorant à la chute de la cible. Attendre environ 1 h et observer au microscope. Les cristaux de protéines seront allume en bleus.
  6. Utiliser les conditions de cristallisation positive (sulfate d’ammonium 1,5 M, 0,1 M Tris pH 8,0) pour optimiser les cristaux à l’aide de pendaison abandonner la méthode de diffusion de la vapeur en plaques 24 puits.
    1. Optimiser le pH de 7.0 à 8.5 avec intervalle d’unité pH 0,5 chaque étape. Optimiser la concentration de sulfate d’ammonium de 1,2 M à 1,7 M avec intervalle 0,1 M chaque étape. (Dans notre cas, le meilleur état produisant de gros cristaux en forme de plaque était de 0,1 M HEPES pH 7.0 et 1,6 M sulfate d’ammonium)

3. cristal montage, collecte de données de rayons x et la détermination de la Structure

  1. Monter les cristaux dans un cryoloop et flash-cool dans l’azote liquide avec réservoir solution contenant 20 % de glycérol comme cryo-protecteur. Placer les cristaux dans unipuck pour rangement et transport.
  2. Présélection des cristaux de protéine à l’aide d’un diffractor de rayons x interne Rigaku. Choisir les meilleurs des résolutions plus élevées pour la collecte de données dans les installations de rayonnement synchrotron (notre dataset a prélevé la BL17U1 à Shanghai Synchrotron Radiation Facility).
    1. Utilisez le logiciel de contrôle de source de rayonnement BluIce26 pour monter et centrer les cristaux en fonction de centrage automatique ou manuelle. Effectuer le test expositions afin de déterminer la stratégie de collecte de données, y compris départ angle, durée d’exposition, distance détecteur, largeur du cadre et numéros.
    2. Collecter des données en conséquence (nous avons recueilli 180 cadres avec 1 s de temps de l’exposition, largeur du cadre 1° et la distance détecteur de 350 mm).
  3. Index, intégrer et mettre à l’échelle le dataset à l’aide de HKL2000 suite27. Tout d’abord effectuer la fonction de recherche de pointe pour trouver les taches de diffraction et l’index puis les taches et sélectionnez le groupe de droite espace. Après intégration de pointe, à l’échelle du dataset avec le modèle d’erreur approprié et enregistrez le fichier .sca de sortie.
  4. Résoudre le problème de la phase de remplacement moléculaire à l’aide de Phaser28 PHENIX29.
    1. Calculer le nombre de copies possibles des molécules de protéine dans l’unité asymétrique par Xtriage,30.
    2. Recherchez les modèles de structure adéquate avec la similarité des séquences haute identité et structurels comme la protéine cible à l’aide de structures connues de la littérature ou les modèles générés par serveur de prédiction de structure tels que Phyre231 (lapin RyR1 NTD, nous avons utilisé comme un modèle de recherche, PDB ID 2XOA).
    3. Exécutez le Phaser en utilisant le fichier de données de diffraction, le fichier de structure du modèle et le fichier de séquence protéique pour trouver la solution.
  5. Effectuer AutoBuild32 PHENIX29 pour générer le modèle initial en utilisant le fichier de sortie du Phaser et le fichier de la séquence de la protéine cible.
  6. Intégrer la structure de la densité d’électrons expérimental mis à jour le moyen de Foulque33 et affiner à l’aide de phenix.refine34 cycles itératifs manuellement.
  7. Valider le modèle final en utilisant les outils de validation en PHENIX18.

Résultats

Purification

Le domaine N-terminal de DBM RyR a été exprimé d’une protéine de fusion avec une balise de protéine, une balise MBP et un site de clivage de protéase TEV. Nous avons suivi une stratégie en cinq étapes de purification pour obtenir une protéine très pure, appropriée pour usage de cristallisation. Dans un premier temps, la protéine de fusion a été purifiée de la fraction soluble du lysat cellulaire par co...

Discussion

Dans cet article, nous décrivons la procédure pour l’inoculation express, purifier, cristalliser et déterminer la structure de DBM RyR NTD. De cristallisation, une condition essentielle est d’obtenir des protéines avec l’homogénéité, la pureté et la solubilité élevée. Dans notre protocole, nous avons choisi d’utiliser TEP-28 a-HMT vecteur car il contient une protéine balise et la balise MBP, qui pourraient être utilisés pour la purification obtenir une pureté supérieure de pli. En outre, le MBP ta...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le financement de cette recherche a été fournie par : National Key Research et Development Programme of China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), Nature Science Fondation nationale de Chine (31320103922, 31230061) et projet de recherche fondamentale National (973) programme de Chine (2015CB856500, 2015CB856504). Nous sommes reconnaissants envers le personnel sur la ligne de faisceau BL17U1 à Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
pET-28a-HMT vectorThis modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strainNovagen69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)GE Healthcare45-000-325
Amylose resin columnNew England BiolabsE8021S
Q Sepharose high-performance column GE Healthcare17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)MilliporeUFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column GE Healthcare28-9893-36
Automated liquid handling robotic system Art Robbins InstrumentsGryphon
96 Well CrystalQuickGreiner bio-one82050-494
Uni-PuckMolecular DimensionsMD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micronHampton ResearchHR4-955
CryoWandMolecular DimensionsMD7-411
Puck dewar loading toolMolecular DimensionsMD7-607
Nano dropThermo ScientificNanoDrop One
Crystal incubatorMolecular DimensionsMD5-605
X-Ray diffractorRigakuFRX
PCR machineEppendorfNexus GX2
Plasmid mini-prep kitQiagen27104
Gel extraction kitQiagen28704
SspI restriction endonucleaseNEBR0132S
T4 DNA polymeraseNovagen2868713
KanamycinScientific Chemical25389940
IPTGGenview367931
HEPESGenview7365459
β-mercaptoethanolGenview60242
CentrifugeThermo ScientificSorvall LYNX 6000 
SonnicatorScientzII-D
Protein purification systemGE HealthcareAkta Pure
Light microscopeNikonSMZ745
IzIt crystal dyeHampton ResearchHR4-710
Electrophoresis unitBio-Rad1658005EDU
Shaker IncubatorZhichengZWYR-D2401
Index crystal screenHampton ResearchHR2-144
Structure crystal screenMolecular DimensionsMD1-01
ProPlex crystal screenMolecular DimensionsMD1-38
PACT premier crystal screenMolecular DimensionsMD1-29
JCSG-plus crystal screenMolecular DimensionsMD1-37

Références

  1. Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
  2. Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
  3. Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
  4. Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
  5. Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
  6. Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
  7. Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
  8. Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
  9. Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
  10. Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
  11. Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
  12. Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
  13. Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
  14. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  15. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  16. des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
  17. Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
  18. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
  19. Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
  20. Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
  21. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  22. Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
  23. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  24. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  25. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  26. Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
  27. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  30. Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
  31. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  32. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
  33. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  35. Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
  36. Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Biochimienum ro 141expression de la prot inepurificationcristallisationdiffractionremplacement mol culairer cepteur la ryanodineteigne des crucif res

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.