Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

Résumé

Ce protocole montre comment purifier les microARN extracellulaires de milieux de culture cellulaire pour petite construction de bibliothèque de RNA et de séquençage de la génération suivant. Différents points de contrôle de contrôle de la qualité sont décrites pour permettre aux lecteurs de comprendre à quoi vous attendre lorsque vous travaillez avec des échantillons d’entrée faibles comme exRNAs.

Résumé

Extracellulaires et circulation RNAs (exRNA) sont produites par plusieurs types de cellules du corps et existent dans nombreux fluides corporels comme la salive, plasma, sérum, lait et l’urine. Un sous-ensemble de ces ARN sont les régulateurs post-transcriptionnel – microARN (miARN). Pour délimiter les miARN produites par les types spécifiques de cellules, systèmes de culture in vitro permet de récolter et profil exRNAs dérivé d’un sous-ensemble de cellules. Les facteurs sécrétés de cellules souches mésenchymateuses sont impliqués pour soulager de nombreuses maladies et est utilisé comme système modèle in vitro ici. Cet article décrit le processus de collecte, de purification de petits ARN et de génération de la bibliothèque de séquence miARN extracellulaire. ExRNAs de milieux de culture diffèrent des ARN cellulaire étant faibles échantillons d’entrée d’ARN, qui prévoit des procédures optimisées. Ce protocole fournit un guide complet à exRNA petite séquence de milieux de culture, montrant les points de contrôle de la qualité à chaque étape au cours de la purification d’exRNA et de séquençage.

Introduction

Extracellulaire et circulant RNAs (exRNAs) sont présents dans divers liquides organiques et sont résistants vers RNases^1,2. Leur abondance élevée, la stabilité et la facilité d’accessibilité sont attrayants pour l’évaluation clinique des marqueurs diagnostiques et pronostiques³. Le mode de transport pour exRNAs comprennent les vésicules extracellulaires (EVs), liaison avec les lipoprotéines (tels que les lipoprotéines de haute densité ; HDL) et des complexes ribonucléoprotéiques (comme avec des complexes Argonaute2)⁴.

Un sous-ensemble d’exRNAs sont les microARN (miARN), qui est de petite taille non codantes ARN d’environ 22 nt qui régulent l’expression génique post-transcriptionnel. Ex-miARN ont été impliqués dans la communication de cellule-cellule et régulation de l’homéostasie cellulaire⁵. Par exemple, les HDL offre ex-miR-223 aux cellules endothéliales pour réprimer la molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) et l’inflammation⁶. Fait intéressant, miR-223 voit également transportés par des vésicules extracellulaires des leucocytes pour les cellules cancéreuses du poumon, à prendre sur une plus invasive de phénotype⁷programmation. Ainsi, le transcriptome d’ex-miARN provenant de divers fluides corporels et milieu de culture cellulaire améliorera grandement notre compréhension de la signalisation des ex-miRNA.

Petit ARN séquençage (petits RNA seq) est un outil puissant qui permet de comprendre la transcriptomique de petits ARN. Non seulement on peut comparer différents échantillons parmi RNAs connus différentiellement exprimés, mais nouveaux petits ARN aussi peut être détecté et caractérisé. Par conséquent, c’est aussi une méthode robuste pour identifier des miARN différentiellement exprimés dans des conditions différentes. Cependant, un des obstacles de petits RNA-seq est la difficulté à produire des petites bibliothèques de seq RNA provenant des liquides de basse exRNA d’entrée comme les échantillons de liquide céphalorachidien, salive, urine, lait, sérum et milieux de culture. Le protocole de TruSeq petits ARN bibliothèque Prep de Illumina exige environ 1 µg d’ARN total de haute qualité et le protocole NEBNext petits ARN bibliothèque Prep Set de New England Biolabs 100 ng-1 µg de RNA^8,9. Souvent, les ARN total de ces échantillons sont inférieures à la limite de détection pour classiques spectrophotomètres UV-visible.

Ex-miARN dérivés de fluides corporels est potentiellement bons marqueurs pronostiques et diagnostiques. Cependant, afin d’étudier les effets fonctionnels ou de déterminer l’origine des ex-miRNAs spécifiques, systèmes de cultures cellulaires sont souvent utilisés à la place. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été étudiés intensivement car leurs EVs ont été impliqués pour soulager de nombreuses maladies, y compris l’infarctus du myocarde, la maladie d’Alzheimer et maladie du greffon contre hôte¹⁰. Ici, nous démontrons la purification des ex-miARN de moelle osseuse MSCs (BMSC) et les étapes spécifiques utilisés pour optimiser la petite construction de bibliothèque de RNA, séquençage et analyse de données (Figure 1).

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Protocole

NOTE : Milieu de culture de cellules souches mésenchymateuses (médias MSC) est établi au préalable, comme indiqué dans la Table des matières.

1. culture cellulaire

Remarque : Les cellules souches mésenchymateuses humaines peut provenir de la moelle osseuse, tissu adipeux ou autres sources¹¹. Alternativement, les CSM peut être achetés chez un fournisseur. Le BMSC utilisés dans le présent protocole ont été dérivées de la moelle osseuse des patients et acheté auprès d’une société.

1. Décongelez les 1 x 10⁶ BMSC dans une fiole de T175 contenant 20 mL de médias MSC. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ et remplacer les médias tous les 2-3 jours jusqu'à la confluence de 80 %.
2. Laver les cellules avec 5 mL de solution 1 PBS x et jeter le PBS.
3. Détacher les cellules en ajoutant 5 mL de 0,05 % trypsine-EDTA et en incubant les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Appuyez sur les côtés du ballon afin de faciliter le détachement.
4. Ajouter 15 mL de médias MSC pour inactiver la trypsine, de détacher les cellules de la surface et la pipette de haut en bas pour obtenir des suspensions de cellules du même.
5. Recueillir les cellules dans un tube de 50 mL et la centrifuger pendant 5 min à 300 g pour granuler les cellules.
6. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de médias MSC et de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   Remarque : La moelle osseuse humaine primaire MSCs à confluence de 80 % dans une fiole de T175 est environ 2 x 10⁶ cellules.
7. CSM plaque à 2 000 cellules/cm² dans les milieux frais de MSC à 5 flacons T175. Cultiver les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ et remplacer les médias tous les jours 2 et 3 jusqu'à obtient 5 flacons de 90 % confluentes T175 flacons.

2. EVs et biomolécules associés à RNA collection

NOTE : Media collection EV est établi au préalable (de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium [DMEM] avec le sérum de veau fœtal [BF] 10 % et 1 % la pénicilline/streptomycine [P/S]). EV collection médias est normal MSC médias, mais préparé avec le commercial appauvris en EV SVF (Table des matières). C’est pour éviter la contamination des exRNA bovine de FBS, qui contient normalement exRNAs associé à EVs, ribonucléoprotéines et lipoprotéines. Pour préparation de bibliothèque petite ARN, exRNAs dérivés de 5 flacons confluentes de MSCs sont nécessaires pour permettre la construction de la bibliothèque.

1. Laver les cellules 3 x avec 20 mL de PBS par T175 flacon. Ajouter 20 mL de médias collection EV par confluentes T175 flacon de MSCs et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 48 h.
2. Recueillir les médias et centrifuger les médias pendant 10 min à 300 x g et 4 ° C.
3. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger les médias pendant 20 min à 2 000 x g et 4 ° C.
4. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger les médias pendant 30 min à 15 500 x g et 4 ° C. Puis recueillir le surnageant.
5. Transfert des médias à tubes ultracentrifugeuse et pellet l’exRNAs pendant 90 min à 100 000 x g et 4 ° C. Un rotor à angle fixe est utilisé ici et le culot est ancré sur le côté du tube. Marquez le côté du couvercle et tracez un cercle sur le côté du tube où le culot est attendu.
6. Retirez le surnageant, sécher l’intérieur du tube en renversant le tube sur un papier absorbant et utiliser de petits morceaux de papier absorbant pour enlever le liquide dans le tube sans toucher le fond du tube. Resuspendre le culot dans 200 μl de PBS au vortex pendant 30 s et pipetage et descendre de 20 x.
7. Évaluer les véhicules électriques et les biomolécules à nanoparticules suivi d’analyse (NTA) (Figure 2).
   NOTE : Les véhicules électriques et les biomolécules pouvant être évaluée par nanoparticules suivi d’analyse (NTA), diffusion de la lumière dynamique (DLS) ou transmission electron microscopy (TEM)¹².
8. Stocker le SVE et biomolécules à-80 ° C jusqu'à ce que des expériences plus loin en aval.
   Remarque : Si les EVs vont être utilisées pour des études fonctionnelles, 20 % de glycérol s’ajoutent pour les protéger de se rompre. Les cellules peuvent être collectées à l’aide de procédures standards si nécessaire.

3. EVs et biomolécules associés à RNA collection de cellules différenciées

NOTE : EVs et ARN associés biomolécules peuvent également être prélevés dans les milieux de culture cellulaire tandis que les cellules subissent une différenciation. L’exemple décrit dans le protocole décrit la différenciation ostéoblastique et exRNA collection à jour 0 et 7 de la différenciation. Si aucune distinction n’est requise, puis sauter 3 Section et allez à la Section 4.

1. Préparer les milieux de la différenciation ostéoblastique (DMEM avec 10 % BF, 1 % P/S, β-glycérophosphate de 10 mM, 10 dexaméthasone nM, 50 μM ascorbate-2-phosphate et 10 mM 1,25-vitamine-D3) frais chaque fois.
2. Une fois que MSCs sont 80 % anastomosé, changer les médias MSC aux médias de différenciation ostéoblastique.
3. Reconstituer les médias de différenciation ostéoblastique après 2 ou 3 jours.
4. Jour 5 de différenciation, retirez le support et laver les cellules 3 x avec 20 mL de PBS par T175 flacon.
5. Ajouter 20 mL de support de collection EV contenant des β-glycérophosphate de 10 mM, 10 dexaméthasone nM, ascorbate-2-phosphate de 50 μM à 10 mM 1,25-vitamine D₃ par confluentes T175 flacon de MSCs. incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 48 h pour s’assurer a continué différenciation tout en collectant les EVs et biomolécules.
6. Recueillir des médias au jour 7 et continuer à isoler le SVE et biomolécules comme décrit aux points 2.2 à 2,6.
7. Pour le contrôle de la qualité, semences cellules en 96 puits 6-puits afin d’évaluer la différenciation à l’aide d’un dosage de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) ou PCR quantitative (qPCR), respectivement.
   Remarque : La Figure 3 est un exemple illustrant la différenciation des cellules ostéogénique.

4. extraction de l’ARN et contrôle de la qualité

1. Décongeler les échantillons à l’étape 2.8 sur la glace. Extraire l’ARN utilisant un kit d’isolation d’ARN (Table des matières).
2. Éluer l’ARN de la colonne fournie dans le kit d’isolation d’ARN (Table des matières) dans 100 μl d’eau exempte de RNase.
3. Concentrer l’ARN par précipitation à l’éthanol en ajoutant 1 μL de glycogène, 10 μL 2 M pH 5,5 d’acétate de sodium et 250 μL d’éthanol à 99 % préalablement réfrigérées dans 100 μl de l’ARN purifié.
4. Incuber les échantillons à-20 ° C durant la nuit à précipiter l’ARN. L’ARN a granulé par centrifugation pendant 20 min à 16 000 x g et 4 ° C.
   Remarque : Le pellet est blanc en raison de la coprécipitation avec glycogène.
5. Retirez le surnageant et laver le culot de RNA avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Granulés de l’ARN à nouveau pendant 5 min à 16 000 x g et 4 ° C.
6. Retirez l’éthanol et laissez le couvercle du tube RNA ouvert pendant 5-10 min à l’air sec le culot de RNA. Resuspendre le culot de RNA dans 7 μL d’eau exempte de RNase.
7. Vérifier la qualité de RNA et de la concentration à l’aide d’une machine d’électrophorèse capillaire puce pour détecter l’ARN selon protocole du fabricant avant la construction de la bibliothèque.
   Remarque : Une distribution de taille représentative de l’ARN est illustrée Figure 4.
8. Extraire l’ARN cellulaire à l’aide d’un kit de purification commerciale (Table des matières) si nécessaire.

5. bibliothèque construction et contrôle de la qualité

NOTE : Bibliothèques de petits ARN sont construits à l’aide de kits commerciaux (Table des matières) avec des ajustements en raison de l’ARN basse d’entrée. Construction de la bibliothèque est effectuée sur le bloc refroidi.

1. Refroidir le bloc chauffant pour tubes PCR 0,2 mL sur la glace et distribuer 5 μL de l’ARN de l’étape 4.6 dans tubes PCR de 0,2 mL RNase-libre sur un bloc refroidi.
2. Diluer 3' adaptateurs (01:10) dans l’eau sans RNase dans un tube PCR de 0,2 mL RNase-libre. Ajouter 0,5 μL d’adaptateur dilué et mélanger avec 5 μL d’ARN de pipetage et descendre 8 x et centrifuger brièvement pour recueillir tout le liquide au fond du tube.
3. Incuber le mélange adaptateur ARN et 3' à 70 ° C pendant 2 min dans un thermocycleur préchauffé et puis replacez l’échantillon sur le bloc refroidi.
4. Ajouter 1 μL de tampon de ligature, 0,5 μL d’inhibiteur de RNase et 0,5 μL de ligase d’ARN T4 (mutant de délétion) dans le mélange de l’ARN et 3' adaptateur. La composition de pipetage et descendre 8 x et centrifuger brièvement.
5. Incuber les tubes à 28 ° C pendant 1 h dans le thermocycleur préchauffé.
6. Ajouter 0,5 μL de solution d’arrêt dans le tube à essais avec le tube restant dans le thermocycleur, mélanger en pipettant également, haut et bas x 8 et continuer à incuber à 28 ° C pendant 15 minutes.
7. Diluer 5' adaptateurs (01:10) dans l’eau sans RNase dans un tube PCR de 0,2 mL RNase-libre. Ajouter 0,5 μL de 5' adaptateur dans un séparé libre de RNase 0,2 mL tube PCR, chaleur l’adaptateur 5' à 70 ° C pendant 2 min dans le thermocycleur préchauffé et placez l’échantillon sur le bloc refroidi.
8. Ajouter 0,5 μL de 10 nM ATP, 0,5 μL de ligase d’ARN T4 au tube 5' adaptateur, mélanger en pipettant également monter et descendre de 8 x et centrifuger brièvement pour collecter tous les liquides dans le fond.
   NOTE : Gardez l’adaptateur 5' sur bloc refroidi autant que possible.
9. Ajouter 1,5 μL du mélange 5' adaptateur à l’échantillon de point 5.6 et mélanger très doucement par pipetage x 8 lentement. Incuber les échantillons à 28 ° C pendant 1 h dans le thermocycleur préchauffé.
10. Diluer RT amorce 01:10 dans de l’eau exempte de RNase dans un tube de PCR de 0,2 mL de RNase-libre. Ajouter 0,5 μL d’apprêt de RT dilué dans l’échantillon de l’étape 5.9, mélange très délicatement en pipettant également monter et descendre de 8 x lentement et centrifuger brièvement.
11. Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 2 min dans le thermocycleur préchauffé et placez l’échantillon sur un bloc refroidi.
12. Ajouter 1 μL de 5 x premier tampon strand, 0,5 μL du mélange dNTP 12,5 mM, 0,5 μL de 100 mM dithiothréitol (DTT), 0,5 μL d’inhibiteur de RNase et 0,5 μL de la transcriptase inverse. Mélanger très doucement en pipettant également monter et descendre de 8 x lentement et centrifuger brièvement.
13. Incuber l’échantillon à 50 ° C pendant 1 h dans le thermocycleur préchauffé pour obtenir l’ADNc.
14. Ajouter 4,25 μL d’eau ultrapure, 12,5 μL du mélange PCR, 1 μL d’apprêt index et 1 μL de l’amorce universelle dans l’ADNc. La composition de pipetage et descendre 8 x et centrifuger brièvement.
15. Placer l’échantillon dans un thermocycleur et mis en place le cycler comme suit : 98 ° C pendant 30 s ; 15 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 15 s ; et au bout du cycle avec 72 ° C pendant 10 min.
    Remarque : La bibliothèque de prête peut être stockée à-20 ° C pendant une semaine.
16. Purifier la bibliothèque RNA séparant la bibliothèque sur un gel de l’ADN et en coupant le gel (gel extraction) entre 140 bp et 160 bp et la bibliothèque du gel suivant le protocole donné par le kit de construction de bibliothèque d’élution.
    Remarque : Dans cette étude, la bibliothèque de prête de l’étape 5.15 est chargée sur un gel commercial (Table des matières) et la bibliothèque entre 140 bp et 160 bp est purifié dehors par un fractionnateur automatisé de taille sur les ADN (Table des matières) conformément à la protocole du fabricant.
17. Se concentrer et se laver de la bibliothèque de l’étape 5.16 à l’aide d’un kit de purification PCR basée sur les colonnes (Table des matières) et éluer la bibliothèque dans l’eau sans RNase 10 μL enfin.
18. Charge 1 μL de la bibliothèque purifiée sur une puce à ADN (Table des matières) pour vérifier la taille de la bibliothèque de base du protocole par le fabricant.
19. Diluer 1 μL de la bibliothèque purifiée (1 : 1000) du pH 8.0 de 10 mM Tris-HCl à 0,05 %, polysorbate 20 et quantifier la bibliothèque de qPCR en utilisant un kit de quantification de la bibliothèque commerciale pour quantifier la concentration de bibliothèque en utilisant les normes de l’ADN dans le kit.
20. Quantités égales de piscine des bibliothèques selon les exigences de la machine de séquençage et de la séquence sur un système de séquençage haut-débit.
    Remarque : La construction de la bibliothèque d’ARN cellulaire peut être faite en utilisant les mêmes kits en suivant un protocole standard des kits.

6. bioinformatique pipeline

Remarque : Il s’agit d’un pipeline interne et les programmes utilisés ici sont répertoriés dans le Table des matières.

1. Tailler loin lectures de faible qualité et retirer les lectures brutes de séquences d’adaptateur.
2. Mapper les lectures propres à différents types d’ARN.
   1. Annoter les Arnt en autorisant deux décalages parce que les séquences fortement modifiées de tRNA causent misincorporation base fréquente par la transcriptase inverse.
   2. Annoter des miARN par cartographie de miARN humaine de miRBase v21 permettant à zéro non-correspondances. Puisque miARN est soumis A et U nontemplated 3' fin ajouts, séquences qui ne sont pas mappent sont garnis de jusqu'à trois A ou T ent après quoi lectures sont mappés aux miARN humaine et autres miARN de miRBase v21 permettant à zéro décalages de 3'.
   3. Annoter à l’autre les petits ARN (snRNA, Arnpno, piRNA et Y RNAs) en permettant une incompatibilité.
   4. Mapper les lectures restantes non mappés à long RNA datasets (ARNr, autre ARN de Rfam et ARNm) afin d’évaluer la dégradation.
   5. Annoter les séquences au génome humain.
   6. Annoter les séquences de génomes bactériens.
   7. Normaliser les miRNA expression à l’aide de la formule suivante : miRNA compte / total chiffres de tous les miARN mappé) x 10⁶.

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Résultats

La méthode décrite dans le présent protocole est optimisée afin de recueillir des exRNA de culture MSC pour l’ordonnancement de la génération suivante. L’économie générale du flux de travail est à la Figure 1 sur la gauche et les points de contrôle de la qualité respective sont sur la droite.

La morphologie des cellules sur le jour du prélèvement pour indifférencié (

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour l’ordonnancement de production prochaine d’exRNAs qui permet des analyses des échantillons d’entrée faibles expression différentielle. Il est important de respecter un protocole spécifique pour l’isolement EV et exRNA parce que même de petites modifications (l’étape de l’ultracentrifugation ou un changement de type de rotor) peuvent influencer le transcriptome et miRNA niveaux^13,14. Ainsi, quelle que soit la...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells	ATCC	PCS-500-012	Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001	Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS	Gibco	A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
T175 Flask	Sarstedt	833,912
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline	Sigma	806552
Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter	355618
Beckman Coulter Type 60 Ti			Rotor used here
NucleoCounter	Chemometec	NC-3000	Cell Counter
β-glycerophosphate	Calbiochem	35675	Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone	Sigma	D4902-25MG	Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3	Sigma	D1530-1MG	Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1514	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits	Roche	KK4824	Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012	Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep	Sage Science		Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004	PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit	Cold Spring Harbor Lab		Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt			Adaptor removal in step 6
Bowtie			Mapping of clean reads in step 6
Samtools			To make the expression profile in step 6
Bedtools			To make the expression profile in step 6