Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo

Résumé

Les auteurs décrivent une méthode d’utilisation polyéthylèneimine (PEI)-enduit superparamagnetic iron oxide nanoparticules pour la transfection des macrophages avec siARN. Ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement des siARN d’expression du gène cible in vitro et in vivo et silence macrophages.

Résumé

En raison de leur rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires, les macrophages ont constamment fait l’objet de recherches intensives et représentent une cible thérapeutique prometteuse dans plusieurs maladies, telles que les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Silençage génique véhiculée par Arni est une approche utile de choix de sonde et de manipuler la fonction des macrophages ; Toutefois, la transfection des macrophages avec siARN est souvent considéré comme pour être techniquement difficile et, à l’heure actuelle, il existe quelques méthodes dédiés au transfert de siARN aux macrophages. Nous présentons ici un protocole d’utilisation de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique polyéthylèneimine-enduit (PEI-SPIONs) comme un véhicule pour l’administration ciblée d’ARNsi aux macrophages. PEI-SPIONs sont capables de liaison et de condensation complètement siARN lorsque le rapport de poids / Fe : siARN atteint 4 et au-dessus. In vitro, ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement siRNA dans les macrophages primaires, ainsi que dans la lignée cellulaire de type macrophages RAW 264.7, sans compromettre la viabilité des cellules à la dose optimale pour la transfection, et, en fin de compte, ils induisent induite par le siARN cible silençage génique. Outre utilisé pour in vitro transfection de siARN, PEI-SPIONs sont un outil prometteur pour la livraison des siARN à macrophages in vivo. Compte tenu de ses caractéristiques combinées de propriété magnétique et capacité de gène-baffle, systématiquement administré PEI-SPION/siARN particules devraient non seulement pour moduler la fonction de macrophage, mais aussi pour activer les macrophages à être photographié et suivies. En substance, PEI-SPIONs représentent une plate-forme nonviral simple, sûre et efficace pour la livraison de siARN aux macrophages in vitro et in vivo.

Introduction

Les macrophages sont un type de cellules immunitaires innées, distribué dans tous les tissus de l’organisme, mais dans des quantités différentes. En produisant une variété de cytokines et d’autres médiateurs, ils jouent un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre l’invasion des pathogènes microbiens, à la réparation des tissus après une blessure et dans le maintien de l’homéostasie tissulaire¹. En raison de leur importance, les macrophages ont continuellement fait l’objet de recherches intensives. Cependant, malgré sa prévalence dans la régulation des gènes et des études de fonction, siARN-mediated gene silencing est moins susceptible de réussir dans les macrophages, parce que ces cellules — en particulier, les macrophages primaires — sont souvent difficiles à transfecter. Ceci peut être attribué à un degré relativement élevé de toxicité associé à des approches plus bien établies de transfection dans lequel la membrane cellulaire est chimiquement (par exemple, avec des polymères et des lipides) ou physique (p. ex., par électroporation et canons de gène) perturbé pour laisser les siARN molécules traversent la membrane, réduisant ainsi considérablement viabilité^{2,3 des macrophages}. En outre, les macrophages sont des phagocytes dédiés riches en enzymes de dégradation. Ces enzymes peuvent endommager l’intégrité des siARN, affaiblissement de l’efficacité de son silencieux même si gène-spécifique siARN a été remis dans la cellule^3,4. Par conséquent, un système d’administration des siARN efficaces axés sur les macrophages a besoin pour protéger l’intégrité et la stabilité des siARN au cours de la livraison⁴.

Il est de plus en plus évident que les macrophages dysfonctionnels sont impliqués dans l’apparition et la progression de certains troubles cliniques courants comme les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Pour cette raison, en modulant la fonction des macrophages avec, par exemple, siRNA, a été en train de devenir une méthodologie attrayante pour le traitement de ces troubles^5,6,7. Si beaucoup de progrès ont été accompli, un enjeu majeur de la stratégie de traitement fondées sur des siARN est la spécificité cellulaire pauvre de siARN systématiquement administré et l’absorption de siARN insuffisante par les macrophages, qui par conséquent conduire à des effets secondaires indésirables. Par rapport aux thérapies de libre d’acide nucléique qui manquent généralement de sélectivité cellulaire optimale et conduisent souvent à des effets indésirables, chargé de drogue nanoparticles (NPs), en raison de leur propension spontanée d’être capturé par le système réticulo-endothélial, hors cible peut être conçue pour le ciblage passive à macrophages en vivo, permettant une meilleure efficacité thérapeutique avec des effets secondaires minimes⁸. Courants NPs explorés pour l’administration de molécules d’ARN incluent nanocarriers inorganiques et liposomes divers polymères⁹. Parmi eux, polyéthylèneimine (PEI), un type de polymères cationiques lier et condensation des acides nucléiques dans NPs stabilisées, montre l’ARN plus haut livraison capacité^9,10. PEI protège des acides nucléiques de la dégradation enzymatique et non-enzymatique, médiatise leur transfert à travers la membrane cellulaire et favorise leur libération intracellulaire. Bien qu’initialement présenté comme un réactif de livraison de l’ADN, PEI a été démontré par la suite pour être une plate-forme attrayante pour in vivo ARNsi, soit localement ou de manière systématique^9,10.

Nanoparticules superparamagnétiques d’oxyde de fer (SPIONs) ont montré de grandes promesses en biomédecine, en raison de leurs propriétés magnétiques, de biocompatibilité, de taille comparable aux objets biologiquement importants, surface-surface-à-volume élevé et facilement adaptable surface pour ètre pièce jointe¹¹. Par exemple, en raison de leur utilité potentielle comme agent de contraste et une absorption rapide par les macrophages, SPIONs ont émergé comme un outil clinique préféré à l’image de macrophages tissulaires¹². Alors que SPIONs ont également été largement étudiées sous la forme d’acide nucléique livraison véhicules^11,13,14,15, à notre connaissance, la littérature contienne peu de rapports de SPIONs comme un support pour ARNsi axés sur les macrophages. Pour la livraison de gène de SPIONs, leur surface est généralement recouvert d’une couche de polymères cationiques hydrophiles sur lequel des acides nucléiques chargés négativement peut être électrostatiquement attirés et attachés. Nous présentons ici une méthode de synthèse de SPIONs dont la surface est modifiée avec faible poids moléculaire (10 kDa), PEI ramifié (PEI-SPIONs). Ces nanoplatforms magnétiques travaillent alors à se condenser siRNA, formant des complexes de PEI-SPION/siARN qui permettent le transport de siARN dans la cellule. Nous avons raison cette phagocytose spontanée de SPIONs par les cellules du système réticulo-endothélial¹⁶, associée à la forte capacité de liaison et condensation des acides nucléiques par PEI, rend PEI-SPIONs adapté pour le transport efficace des siARN dans macrophages. Les données présentées ici confirment la faisabilité de PEI-SPION/siARN-mediated gene silencing dans les macrophages en culture ainsi qu’in vivo.

Protocole

Toutes les méthodes impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à l’animal soin et d’utilisent des lignes directrices de l’Université du Sud-est, en Chine.

1. préparation du PEI-SPIONs

1. Préparation de l’acide oléique-modified SPIONs
   1. Dissoudre FeCl₃•6H₂O et FeSO₄•7H₂O dans l’eau sous la protection du N₂.
      1. Ajouter 28 FeCl₃•6H₂O et 20 g de FeSO₄•7H₂O dans 80 mL d’eau désionisée dans un bécher. N₂ introduire de l’eau dans une gaine de verre et remuer jusqu'à ce que la matière solide a dissous.
      2. Faire chauffer le mélange réactionnel à 72 ° C à un taux d’agitation de 800 tr/min, suivie par l’ajout de 40 mL d’ammoniaque eau (28 %). Remuez pendant 5 min.
   2. Ajouter goutte 9 mL d’acide oléique dans la solution susmentionnée et remuez-le à 72 ° C pendant 3 h.
   3. Laisser refroidir la solution obtenue à la température ambiante (RT). Précipiter la solution par séparation magnétique.
   4. Laver le précipité contenant SPIONs 3 x avec alcool éthylique absolu et, ensuite, disperse le précipité dans 100 mL de N-hexane.
2. Préparation de dimercaptosuccinique modifiés acide SPIONs
   1. Ajouter 800 mg d’acide oléique (OA)-modification SPIONs dispersées dans 200 mL de N-hexane, et 400 mg d’acide dimercaptosuccinique (DMSA) dispersées dans 200 mL d’acétone, dans une fiole de trois-cou dans un bain-marie à 60 ° C.
      Remarque : Pour déterminer la concentration de SPION OA modifiés obtenue à partir de l’étape précédente, prenez un petit volume (p. ex. 1 mL) de la dispersion de SPION, se volatiliser le N-hexane et peser la poudre qui en résulte.
   2. Ajouter 200 µL de triéthylamine goutte à goutte dans la solution ci-dessus avec reflux et en remuant à 1 000 tr/min.
   3. Après 5 h en remuant et reflux, obtenir un précipité noir par séparation magnétique.
   4. Disperser les SPIONs hydrophiles dans l’eau désionisée homogène en ajustant le pH de la solution à l’aide d’hydroxyde de tétraméthylammonium.
3. Préparation de PEI-SPIONs
   1. Solution colloïdale SPION DMSA modifié, ajouter quelques gouttes dans la solution de PEI (10 kDa) dans un ballon jaugé de 500 mL trois-cou sous agitation mécanique à 1 000 tr/min pendant 2 h (W_Fe: W_PEI = 1:3).
      Remarque : La charge et la taille de PEI-SPIONs varient selon le ratio de W_Fe W_PEI. Le W_Fe: rapport 1:3 W_PEI peut être un bon point de départ pour la synthèse de PEI-SPIONs adaptés pour la livraison de siARN.
   2. Ajouter la solution résultante dans un tube d’ultrafiltration ayant un seuil de poids moléculaire de 100 kDa et d’une teneur de 15 mL ; Ensuite, la centrifugeuse à 5 400 x g pendant 10 min jusqu'à ce que le reste de la solution est de 1 mL. Ajouter de l’eau déminéralisée à la solution pour rendre le volume 15 mL à nouveau et répéter le processus ci-dessus 10 x pour obtenir le produit final. Ensuite, filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm et stocker le produit final à 4 ° C.
   3. Déterminer la concentration de Fe de PEI-SPIONs par la méthode colorimétrique utilisant phénanthroline¹⁷. Diluer les PEI-SPIONs avec de l’eau désionisée stérile à une concentration de 1 mg Fe/mL et conserver à 4 ° C.
   4. Diluer 10 μL de la solution de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) à 1 mL avec de l’eau déionisée ; Testez ensuite sa taille hydrodynamique et le potentiel zêta par un dispositif de dispersion de la lumière dynamique.
      Remarque : Préparer des PEI-SPIONs dans la gamme d’environ 30 à 50 nm. Dans cette gamme de taille, l’effet de la taille du NP sur liaison siARN et la capture cellulaire ne semble pas être importante. PEI-SPIONs portant un potentiel zêta moyenne plus + 37 mV peut être toxique dans la gamme de doses pour la transfection, et un essai de cytotoxicité devrait être effectué pour assurer la sécurité. La charge superficielle et hydrodynamique taille des nanoparticules peuvent être commandés dans une gamme désirée en réglant le contenu de PEI.

2. préparation et Gel d’agarose de PEI-SPION/siARN NPs

1. SiARN diluée avec de l’eau exempte de RNase pour donner une concentration finale de 20 μM (0,26 μg/μL).
2. Préparer cinq tubes de microcentrifuge exempte de RNase marqués 0, 1, 2, 4 et 8. Les étiquettes représentent Fe : siARN différents rapports de poids. Pipette 3 μl de solution de siARN à tous les tubes (~0.8 μg de siRNA/tube).
3. Ajouter 0, 0,8, 1.6, 3.2 et 6.4 μg de Fe sous forme de PEI-SPIONs aux tubes marqués 0, 1, 2, 4 et 8, respectivement. Garder le volume de l’échantillon total de chaque tube de moins de 20 μL. La composition de pipetage doucement verticalement.
4. Incuber les mélanges à ta pendant 30 min pour permettre la formation d’un complexe PEI-SPION/siARN. Durant cette période, faire une agarose à 3 % gel d’agarose de haute pureté.
   Remarque : Autres PEI-SPION/siARN complexes avec les autres ratios de Fe : siARN (p. ex., 5 ou 6) peuvent être préparés et testés.
5. Ajouter 1 μL de 6 x tampon ADN-chargement par échantillon 5 μL et mélanger avec précaution. Chargez tous les échantillons et exécutez électrophorèse à 5 V/cm, jusqu'à ce que le bleu de bromophénol migre dans la mesure où les deux-tiers de la longueur du gel. Souillez le gel avec le bromure d’éthidium (EB) pendant 15-20 min.
   Remarque : Électrophorèse fraîchement préparés et solution EB devraient servir.
6. Visualiser les bandes de siARN sous une exposition aux UV système d’imagerie. Vérifier les ratios Fe : siARN à laquelle siARN forme des complexes avec PEI-SPIONs et, par conséquent, les bandes représentant les siARN libre sont retardés ou non détectable.

3. la transfection des Macrophages RAW264.7 In Vitro

1. Cellules de RAW264.7 de macrophage-comme la culture souris dans un plat de 10 cm à l’aide de DMEM complètent moyen contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF) par 100 U/mL de pénicilline par 100 μg/mL de streptomycine à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 %.
2. Un jour avant la transfection, aspirer moyen des cellules et les rincer avec une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4). Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine dans le plat de 10 cm. Trypsinize cellules RAW264.7 pour environ 5-10 min à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 %.
3. Lorsque la majorité des cellules ont détaché (après 5-10 min), ajouter 5 mL de milieu complet DMEM au plat pour inactiver la trypsine. Pipette de haut en bas pour disperser des agrégats cellulaires dans des cellules individuelles.
4. Transférer la suspension de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à RT. enlever le surnageant.
5. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL d’un milieu DMEM complet frais et compter les cellules non vides.
6. Plaque 9 x 10⁴ cellules par puits dans une plaque 6 puits avec 2 mL de milieu DMEM complet et incuber à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 % pendant environ 24 h.
   Remarque : Si vous utilisez une plaque de dimensions différentes, ajuster la densité de cellules plaqué au prorata de la superficie relative afin que les cellules atteignent la confluence de 80 % au moment de la transfection.
7. Lorsque la confluence de la cellule est de 80 %, retirer le support des cellules et remplacez-la par 1 mL de milieu complet DMEM / puits. Remettez la plaque dans l’incubateur jusqu'à ce que le PEI-SPION/siARN complexes ont été préparés et sont prêts à l’emploi (environ 30 min).
8. Préparer des PEI-SPION/siARN complexes : calculer le montant de PEI-SPION/siARN complexes nécessaires pour une expérience de transfection. Dans un tube de microcentrifuge de RNase-libre 1,5 mL, mélanger une quantité appropriée de PEI-SPIONs avec siARN dans un rapport donné Fe : siARN. Par exemple, pour préparer le NPs de PEI-SPION/siARN contenant 100 µg de Fe à un ratio de Fe : siRNA de 4, ajouter 100 µL (1 mg Fe/mL), de PEI-SPIONs à 96 μL de siARN (0,26 μg/μL), puis en le mélangeant doucement avec une micropipette. Incuber 30 min à température ambiante.
   Remarque : Préparer un volume de PEI-SPION/siARN complexe qui est de 10 % supérieure à la masse totale et définitive pour tenir compte de toute perte accidentelle. Faire des complexes de PEI-SPION/siARN Fe : siARN faibles ratios, sous lequel des molécules de siARN sont complètement chargées dans le PEI-SPIONs et, par conséquent, de petites quantités de PEI-SPIONs peuvent être utilisées pour réduire au minimum la cytotoxicité potentielle. Expériences pilotes (analyse d’un retard de gel) pour l’optimisation du ratio Fe : siARN sont nécessaires.
9. Retirez la plaque de 6 puits de l’incubateur (étape 3,7). Ajouter un volume requis du complexe de PEI-SPION/siARN goutte à chaque puits et agiter la plaque avec prudence afin d’assurer une répartition uniforme. Remettez la plaque dans l’incubateur jusqu'à ce que l’évaluation de la cellulaire absorption ou gène knockdown efficacité (d 1-3).
   Remarque : Les macrophages transfection avec PEI-SPION/siARN à une concentration de ~ 15 μg Fe/mL peuvent maximiser l’efficacité de transfection tout en minimisant la cytotoxicité potentielle.

4. systémique administration d’ARNsi aux Macrophages chez les Rats avec l’arthrite expérimentale

1. Obtenir des rats Wistar mâles exempts d’agents pathogènes spécifiques qui sont âgés de 7 semaines. Habituer les rats pour 7D avant utilisation et leur fournir de l’eau et de nourriture suffisante. Induire l’arthrite adjuvant (AA) chez les rats comme décrit précédemment¹⁸.
2. Préparer des PEI-SPION/siARN complexes comme indiqué au point 3.8.
3. Injecter les PEI-SPION/siARN NPs (0,3 mg de siRNA/kg) dans l’AA rats via la veine caudale. Évaluer l’absorption cellulaire via, par exemple, cytométrie en flux, tissu biodistribution via, par exemple, une fluorescence en temps réel système, d’imagerie ou d’effets thérapeutiques basé sur, par exemple, les cliniques, histologiques et radiographique les analyses au moment désiré points¹⁸.
   Remarque : Pour les études de biodistribution cellulaire et tissulaire, traiter les rats avec une seule injection de la SNPP désirée ; pour les études thérapeutiques, injecter les rats avec les NPs est testé 1 x par semaine pendant trois semaines consécutives.

Résultats

La taille et zeta potentiel de PEI-SPIONs préparé avec ce protocole étaient de l’ordre de 29 à 48 nm (indice de polydispersité : 0,12 - 0,23) et 30 à 48 mV, respectivement. Ils étaient stables dans l’eau à 4 ° C pendant plus de 12 mois sans agrégation évidente. Afin d’évaluer leur siARN capacité de liaison, PEI-SPIONs étaient mêlés siARN à divers rapports de poids Fe : siARN. La figure 1 montre que lorsque le rapport de poids / Fe : ...

Discussion

Les macrophages sont réfractaires à transfecter par des approches nonviral couramment utilisées, telles que l’électroporation, liposomes cationiques et espèces de lipides. Ici, nous avons décrit une méthode fiable et efficace pour transfecter macrophages avec siARN. En utilisant le présent protocole, plus 90 % des macrophages RAW 264.7 cellules (Figure 2 b) et le rat macrophages péritonéaux¹⁸ peut être transfectées avec les siARN sans dégradation notabl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	C11995500BT	Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum	Gibco	A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)	Gibco	15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit	Promega	G3582	For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	TCM13
Tissue culture plates (6-well)	Corning	3516
Tissue culture dishes (10 cm)	Corning	430167
RNase-free tubes (1.5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)	Corning	430791
Trypsin	Gibco	25200-056
Wistar rats	Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder	National Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA	GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA	RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	E107079
Ammonia water	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	A112077
Oleic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	O108484
Dimethylsulfoxide	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D103272
FeSO4•7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012118
FeCl3•6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011918
Dimercaptosuccinic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D107254
ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	T100882
Particle size and zeta potential analyzer	Malvern, England	Nano ZS90