À l’aide de contenu élevé d’imagerie afin de quantifier l’Engagement de cibles en cellules adhérentes

Résumé

Mesures de l’engagement de cibles de drogue sont au cœur de développement des médicaments efficaces et validation de la sonde chimique. Ici, nous détaillons un protocole permettant de mesurer l’engagement de drogue-cible à l’aide de l’imagerie contenu élevé dans une adaptation de microplaques compatibles de l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA).

Résumé

Quantifiant l’interaction des petites molécules avec la cible de leur protéine prévue est essentiel pour le développement de médicaments, de validation de cibles et de validation de la sonde chimique. Méthodes qui mesurent ce phénomène sans modification de la protéine ou les petites molécules sont particulièrement utiles, bien que techniquement difficile. L’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) est une technique pour contrôler l’engagement cible dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici une adaptation du protocole CETSA original, qui permet pour les mesures de débit élevé tout en conservant la localisation sous-cellulaire au niveau de la cellule unique. Nous croyons que ce protocole offre des avancées importantes à l’application du CETSA caractérisation approfondie d’interaction composé-cible, notamment dans les populations hétérogènes de cellules.

Introduction

Lors de l’élaboration de nouveaux médicaments ou sondes chimiques, il est indispensable de coupler l’effet pharmacologique observé ou lecture fonctionnelle aux mesures de l’occupation de la cible ou l’engagement dans des cellules vivantes^1,2,3. Ces données sont nécessaires pour s’assurer que la petite molécule a en effet atteint sa cible recherchée tant pour valider l’hypothèse biologique derrière la protéine cible sélection^4,5. En outre, au cours du développement de médicaments, systèmes de modèles de complexité croissante servent à sélectionner et à corroborer un chef de file avant les essais cliniques. Pour confirmer la traduction de biologie dans l’ensemble de ces systèmes précliniques, les méthodes pour tracer les fiançailles de drogue-cible et accompagnant la biologie tout au long de ce processus de développement sont essentiels.

Engagement de drogue-cible est traditionnellement difficile à surveiller dans des cellules vivantes avec tétrahydrofuraniques de petites molécules et des protéines, notamment au niveau unicellulaire avec une résolution spatiale de^6,7. Une méthode récente pour observer l’interaction entre tels quels médicaments et protéines dans des cellules vivantes est l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) dans lequel stabilisation induite par le ligand d’une protéine native en réponse à un défi de chaleur est quantifiée^{8, 9,10}. Ceci est accompli en quantifiant les protéines solubles restantes après exposition à une épreuve de la chaleur. Dans la notification initiale de CETSA, tache occidentale a été utilisée pour la détection. Pour activer les campagnes de dépistage et a frappé le triage des plus grandes collections de composés, efforts pour augmenter le débit de CETSA expériences ont conduit à l’élaboration de plusieurs essais homogènes, axée sur la microplaque^10,11. Toutefois, une limitation avec ces méthodes est qu’elles sont actuellement mieux adaptées à un traitement composé des suspensions cellulaires et la détection exige la lyse cellulaire, conduisant à la perte de l’information spatiale. CETSA peut être appliqué expérimentalement soit comme un changement induite par le ligand température agrégation thermique (T_tot.) à une concentration unique de la petite molécule ou la concentration de ligand nécessaire pour stabiliser la protéine à une seule température. Ce dernier est appelé empreintes de réponse dose isotherme (ITDRF) pour signifier la dépendance à l’égard de ces mesures sur les conditions expérimentales spécifiques.

Le but du présent protocole est de mesurer l’engagement de cibles à l’aide de CETSA dans les cellules adhérentes de détection des anticorps par immunofluorescence (IF) avec la microscopie haute teneur¹². Cette procédure s’étend la plate-forme CETSA originale permettant la quantification unicellulaire de l’engagement de cibles avec conservation de la localisation subcellulaire. En particulier, contrairement à nombreux rapports précédents, dans cette procédure composé traitement est effectué dans des cellules vivantes adhérentes sans détachement de surface ou de lavage avant le défi de la chaleur, afin de préserver l’équilibre de liaison établis que nous voulons mesurer¹³. Actuellement, la méthode est validée pour une cible protéine p38α (MAPK14) en plusieurs lignées de cellules, et nous espérons qu’en partageant cette procédure la technique peut être appliquée largement à travers la fusion proteome. Nous prévoyons que ce protocole peut être adaptée dans l’ensemble du pipeline de développement de drogue de dépistage, hit triage grâce au suivi de cible engagement in vivo.

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Protocole

1. ensemencement de cellules

Remarque : Pour un aperçu général du flux de travail Voir la Figure 1. Une liste détaillée des matériels et réactifs sont disponibles dans la Table des matières.

1. Avant le semis des cellules, percer des trous avec un foret standard dans le cadre de 384 puits d’imagerie dosage plaques noires pour éviter les bulles d’air étant pris au piège sous la plaque plus tard au cours de l’étape de chauffage. Pour éviter des particules en plastique qui entrent dans les puits au cours de cette étape et pour maintenir des conditions stériles, sceller les plaques avec une feuille d’aluminium adhésive ou couvrir la plaque avant de le faire sous une hotte de culture de tissus. En général, 3 trous d’un diamètre de 3,5 mm sur chaque côté de la plaque (bords courts) suffisant.
2. Préparer un banc de flux laminaire en le nettoyant avec l’éthanol à 70 %. Suite à des techniques de culture de tissu aseptique standard, enlevez média flacon cellulaire ou plat. Laver les cellules avec 5-10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajoutez la trypsine 2 mL au ballon. Incuber le ballon à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules A-431 se détachement. Compter les cellules soit en utilisant un compteur hémocytomètre ou cellulaire. Préparer une suspension cellulaire de 50 000 cellules/mL dans le milieu de culture.
3. Administrer 40 µL de suspension de cellules (qui donne une densité de cellules final de 2 000 cellules / puits) dans chaque puits d’une plaque d’essai à l’aide d’un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux, selon l’importance de l’expérience. Brièvement, déplacez le plateau de côte-à-côte pour disperser les cellules uniformément sur le fond de la plaque.
4. Pour minimiser les effets de bord de la plaque, laissez les cellules à s’installer au bas de la plaque d’essai pendant 20 minutes à température ambiante dans le dos de la hotte à flux laminaire. Ensuite, placer la plaque dans un récipient en plastique avec un essuie-tout humide afin d’assurer une atmosphère humide. Avant utilisation, nettoyez le récipient en plastique avec l’éthanol à 70 %.
5. Incuber la boîte avec la plaque de test pendant 2 ou 3 jours à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié classique. Surveiller la confluence des cellules jusqu'à 50-75 %, tel qu’évalué par l’inspection visuelle avec un microscope optique.

2. composé de traitement

1. Le jour de l’expérience, aspirer le milieu de chaque bien en utilisant un laveur de plaques. Placer la plaque sur le laveur de plaques et sélectionnez le programme de l’aspiration. Si un laveur de plaques n’est pas disponible, le liquide peut être retiré en inversant la plaque avec un coup de main rapide sur un évier ou bac à déchets. L’élimination complète du liquide est essentielle pour de bonnes performances. Tout le liquide en excès est ensuite retiré en tamponnant avec du papier absorbant.
2. Ajouter 30 µL de composés diluée à la concentration appropriée dans le milieu de culture cellulaire à l’aide de distribution automatisé ou une pipette multicanaux selon l’importance de l’expérience. Vérifier que vous ajoutez un négatif (DMSO) et le contrôle positif (ligand connu) à plusieurs puits sur chaque plaque de test. Puisqu’il s’agit d’une analyse de décalage thermique, il est nécessaire que la concentration du composé est supérieure à la constante de dissociation pour observer la stabilisation de la protéine. Ainsi, une indication approximative pour la concentration en composé est 50 à 100 fois la ci₅₀, mais plus en détail pour les concentrations de composés sont décrites dans la section « Discussion ».
   Remarque : La tolérabilité de DMSO des lignées cellulaires doit être testée avant l’expérience.
3. Joint de la plaque de dosage composé-traitait avec une plaque respirante sceller et incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié pendant 30 minutes.

3. Faites chauffer Challenge

1. Tout d’abord, définir le bain d’eau à la température souhaitée. Notez que la température finale qui intervient à l’intérieur du puits de la plaque d’essai peut être différente de la température finale dans un bain-marie. Étudier au préalable le décalage avec un thermomètre à plaque et thermocouple factice. En général, il faut 30 minutes pour le bain pour se stabiliser à la température désirée.
2. Pour vérifier que la température désirée est atteinte dans les puits de la plaque de test lors de l’étape de chauffage, préparer une plaque factice non scellée contenant le même volume de milieu que la plaque de test.
3. Enlever les plaques de dosage de l’incubateur. Décoller le joint respirant et refermer la plaque d’essai contenant les cellules traitées composé avec un papier d’aluminium adhésive serré pour s’assurer que l’eau ne fuira dans les puits pendant le chauffage subséquent dans l’eau du bain. Vérifiez que les orifices percés dans le cadre de la plaque sont accessibles.
4. Placer les plaques de dosage et le mannequin dans le bain d’eau avec le fond de la plaque inclinée vers la surface de l’eau pour forcer tout air restant dehors sous les plaques.
5. Surveillez la température à l’intérieur du puits d’une nouvelle plaque factice à l’aide d’un thermomètre à thermocouple.
6. Faire chauffer la plaque de test dans le bain d’eau pendant 3 minutes. Transférer immédiatement le dosage et la plaque factice pour un autre bain marie avec chambre trempé de l’eau se refroidir pendant 5 minutes. La plaque de test est maintenant prête pour un traitement ultérieur.

4. fixation

1. Pipeter paraformaldéhyde à 16 % (p/v) 10 µL (PFA) directement sur la plaque d’essai à l’aide d’un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
   Remarque : Certains fixatifs sont classés comme cancérogènes et institutionnels consignes de sécurité doivent être suivies.
2. Aspirer la solution PFA et laver les cellules avec 300 µL PBS à l’aide d’un laveur de plaques. Placer la plaque sur le laveur de plaques et sélectionnez le programme de l’aspiration.
   Remarque : Cette procédure a été optimisée en utilisant un protocole de débordement sur la rondelle plaque dans laquelle liquide est en même temps distribué et enlevé. Si une procédure similaire ou un laveur de plaques n’est pas disponible, l’étape de lavage peut alternativement être faite manuellement.
3. Procédure de lavage manuel : Retirer le liquide provenant des puits en retournant la plaque avec un coup de main rapide sur un évier ou bac à déchets. L’élimination complète du liquide est essentielle pour de bonnes performances. Ajouter 80 µL de PBS avec une pipette multicanaux et inverser la plaque à nouveau comme décrit ci-dessus, répétez la procédure de nettoyage deux fois. Après le dernier lavage, séchez la plaque contre un essuie-tout propre pour enlever tout excès de liquide.

5. perméabilisation

1. Ajouter 20 µL de 0,1 % (v/v) : NP-40 pour les puits avec une pipette multicanaux et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Laver les cellules utilisant la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
2. Autrement, le cas échéant, appliquer un protocole de récupération de l’antigène, par exemple:
   1. Ajouter 20 µL du SDS de 1 % dans les puits avec une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes et lavez selon la procédure décrite ci-dessus (étape 4.2).
   2. Ajouter 80 μL de glycine de 10 mM à pH 7,2 et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirer la solution de glycine à l’aide d’un laveur de plaques en plaçant sur le laveur de plaques et de sélectionner le protocole de l’aspiration. Voir les notes aux points 2.1 et 4.2 Si un laveur de plaques n’est pas disponible.

6. blocage

1. Ajouter 15 µL de 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS dans les puits à l’aide d’un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 heure ou toute la nuit à 4 ° C, avec un joint de la plaque d’aluminium foil.

7. primaire anticorps

1. Aspirer la solution de blocage à l’aide d’un laveur de plaques en plaçant sur le laveur de plaques et de sélectionner le protocole de l’aspiration. Voir les notes aux points 2.1 et 4.2 Si un laveur de plaques n’est pas disponible.
2. Ajouter 10 µL d’anticorps primaire dilué en conséquence à 1 % (p/v) BSA dans du PBS dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 heure ou toute la nuit à 4 ° C, avec un joint de la plaque d’aluminium foil.

8. secondaires anticorps

1. Aspirer la solution de l’anticorps primaire et laver les puits selon la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
2. Ajouter 10 µL de Alexa 488 anticorps secondaire dilué en conséquence à 1 % (p/v) : BSA dans du PBS. Incuber à température ambiante pendant 1 heure. Sceller la plaque avec un opercule en aluminium adhésif pour protéger de la lumière.
   NOTE : Protéger la plaque de la lumière pendant ce temps et les étapes suivantes.

9. coloration nucléaire et masque cellulaire

1. Ajouter 10 µL de colorant nucléaire dilué à 0,05 mg/mL dans du PBS dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant encore 10 minutes.
2. Aspirer la solution de Hoechst et un anticorps secondaire et laver les puits à l’aide de la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
3. Ajouter 10 µL de cellules masque dilué à 200 ng/mL dans du PBS dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4. Aspirer la solution de masque cellulaire et laver les puits à l’aide de la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
5. Distribuer 60 µL de PBS dans tous les puits à l’aide de la rondelle de la plaque, un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux et scelle les plaques avec une feuille d’aluminium adhésive.

10. Acquisition et analyse d’images

1. Capturer des images sur un imageur contenu élevé en utilisant 3 canaux fluorescent : DAPI (387/447), GFP (472/520) et TexasRed (562/624). Acquisition de 4 images / puits utilisant l’objectif 10 X. Utiliser l’autofocus automatique laser et appliquez binning 2 lors de l’acquisition. Stocker des images comme fichiers tiff 16 bits, gris en échelle ainsi que des métadonnées.
2. Analyser les images à l’aide de logiciels disponibles. Identifier les limites d’une cellule utilisant un algorithme de cellule marquant avec DAPI (noyau) et TexasRed (cytoplasme).
3. Extrait d’intensité moyenne pour toutes les longueurs d’onde acquises pour une analyse ultérieure des données.
4. Calculer le facteur Z afin d’assurer la robustesse du dosage.
5. Calculer le % de stabilisation à l’aide de la formule suivante : 100 * (1-(bien intensité – intensité moyenne des puits témoin négatif) / (moyen régulateur d’intensité positive control-moyenne intensité négative)). Voici contrôle négatif et de DMSO et contrôle positif est la substance de référence. Étant donné que la stabilisation maximale entre les composés peut varier et en fait être plus grande que le contrôle positif pour les courbes de ITDRF, les intensités maximales et minimales de stabilisation pour chaque composé sont parfois utilisées en lieu et place les valeurs d’intensité des puits de contrôle .

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Résultats

Le protocole décrit dans la Figure 1 décrit le workflow de base pour l’exécution des essais CETSA sur des cellules adhérentes avec détection de protéines solubles restantes en imagerie contenu élevé. Ce flux de travail peut être facilement adapté à tous les stades de développement de l’analyse en modifiant le schéma des composés ou des réactifs¹⁴. Nous détaillons les résultats escomptés car plusieurs prévoit util...

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Discussion

Tel que discuté dans la section résultats, il y a plusieurs étapes clés de la procédure. Tout d’abord, il est important d’identifier un réactif d’affinité de haute qualité. Nous vous recommandons une petite bibliothèque d’anticorps pour chaque cible souhaitée. Après qu’un anticorps primaire a été sélectionné, il est aussi important de valider le système pour un certain nombre de sites de liaison différents de la cible de la protéine, le cas échéant. Contre le dépistage des composés qui int...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System