Microfluidique analyse pour l’évaluation de l’adhésion leucocytaire à humaine Induced Pluripotent Stem Cell dérivé des cellules endothéliales (hiPSC-ce)

Résumé

Ce protocole étape par étape fournit une description détaillée du montage expérimental et analyse des données pour l’évaluation des réponses inflammatoires hiPSC-ECs et l’analyse de l’adhérence des leucocytes dans un écoulement physiologique.

Résumé

Cellules endothéliales (CE) sont indispensables pour la régulation des réponses inflammatoires en limitant ou en facilitant le recrutement des leucocytes dans les tissus affectés par une cascade bien caractérisée Pro-d’adhésifs récepteurs qui sont surexprimés sur le surface cellulaire de leucocytes à la gâchette inflammatoire. Réponses inflammatoires diffèrent entre les individus dans la population et le bagage génétique peut contribuer à ces différences. Les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) ont démontré être une source fiable d’ECs (hiPSC-ECs), traduisant ainsi une source illimitée de cellules qui captent l’identité génétique ainsi que les variantes génétiques ou à des mutations du donneur. hiPSC-ECs peuvent donc servir pour la modélisation des réactions inflammatoires dans les cellules du donneur spécifique. Réactions inflammatoires peuvent être modélisées en déterminant l’adhérence des leucocytes à l’hiPSC-ECs dans un écoulement physiologique. Ce protocole étape par étape fournit une description détaillée du montage expérimental et analyse des données pour l’évaluation des réponses inflammatoires hiPSC-ECs et l’analyse de l’adhérence des leucocytes dans un écoulement physiologique.

Introduction

L’inflammation joue un rôle central dans nombreuses pathologies, notamment cardiovasculaires et neurodégénératives, septicémie et réactions indésirables (aux médicaments RIM). Cellules endothéliales (CE) jouent un rôle essentiel dans la régulation des réponses inflammatoires par l’intermédiaire de l’induction des récepteurs Pro-adhésifs, telles que la molécule d’adhésion intercellulaire, E-sélectine-1 (ICAM-1) et les cellules vasculaires molécule d’adhésion-1 (VCAM-1) sur leur surface ^{1 , 2}. on sait que ECs microvasculaires dans différents tissus présentent une hétérogénéité dans les réponses inflammatoires^3,4. En outre, bagage génétique ou certaines conditions génétiques pourraient entraîner des différences dans les réponses inflammatoires entre individus ; Il est donc important d’avoir accès à l’ECs de différentes personnes. Plus récemment, humaines pluripotentes induites des cellules souches (hiPSCs)⁵, qui peuvent provenir de n’importe quel individu, se sont avérés être une source fiable et renouvelable ECs^{6,7,8, 9}. par conséquent, l’évaluation des réponses inflammatoires et le recrutement des leucocytes dans hiPSC-ECs est précieuse, non seulement pour la modélisation de certains troubles génétiques, mais aussi de fournir des indications sur la variabilité interindividuelle et d’utiliser comme un outil pour médecine personnalisée dans le futur.

Tests de débit offrent un outil utile pour étudier l’interaction endothéliales-leucocyte. Avances en Dispositifs microfluidiques permettent la reproduction des conditions d’écoulement du fluide physiologique avec un contrôle précis des niveaux de contrainte de cisaillement spécifique lit vasculaire. L’imagerie direct permet de contrôler la cascade d’événements de capture de leucocyte, rouler, ramper, adhérence et transmigration. Plusieurs essais de débit d’étudier les interactions endothéliales-leucocytes ont été développés, cependant, ils sont tous utilisent primaire ECs^10,11,12,13. Ici, nous allons décrire en détail le test pour l’évaluation de l’adhérence leucocytaire humain à hiPSC-ECs dans un écoulement physiologique. Dans cette procédure, nous décrivons des conditions optimisées de stimulation hiPSC-EC avec des stimuli pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα), dissociation, semis dans une puce microfluidique avec huit canaux parallèles. Nous décrivent un protocole étape par étape pour la perfusion de hiPSC-ECs avec la suspension des leucocytes fluorescent étiquetés dans puces microfluidiques, vivons imagerie cellulaire et automatisé de comptage des leucocytes adhérentes.

Ce protocole est utile pour l’évaluation des réponses inflammatoires hiPSC-ECs dans le dépistage des drogues, modélisation de la maladie et médecine régénérative personnalisée.

Protocole

1. préparation des Solutions et réactifs

1. Préparer, milieu humain endothéliales-GDF complet (FULL EC-GDF) en ajoutant sérum de dérivés du plasma pauvre en plaquettes (1 %), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF, 20 ng/mL) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF, 50 ng/mL) pour homme endothéliales-GDF (voir Table de Matériaux). Le support de filtration à travers un filtre de porosité de 0,22 µm et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
2. Préparer le milieu RPMI complet en ajoutant le sérum de veau fœtal (10 %), 2-mercaptoéthanol (0,05 nM), L-glutamine (1 %), la pénicilline-streptomycine (25 U/mL) au milieu RPMI (voir Table des matières). Conserver à 4 ° C pendant 3 semaines.

2. revêtement de microfluidique puces

1. Placez une biopuce stérile dans une boîte de Petri stérile de 10 cm.
2. Préparer la solution de travail la fibronectine par reconstitution de la solution mère dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca^{2 +}/Mg^{2 +} à une concentration finale de 50 µg/mL. Estimer les 80 µL de solution de travail par biopuces.
3. Injecter 10 µL de solution de travail de la fibronectine dans chacun des canaux de la biopuce. Utiliser une pipette avec petit 10 conseils µL et assurez-vous que former un contact étroit entre l’entrée du canal et l’embout de la pipette (Figure 1, à gauche).
4. Fermer le couvercle de la boîte de Pétri contenant la biopuce et placez-le dans une chambre humidifiée (Figure 2 b). Ranger la chambre à 4 ° C durant la nuit. Pour humidifier la chambre, placer un papier tissu propre au fond de la chambre humidifiée et ajouter 5 mL de stérile H₂O.
5. Lendemain, avant le dosage, réchauffez la biopuce à 37 ° C dans l’incubateur.

3. préparation d’ECs-hiPSC

Remarque : Dans le protocole décrit ici, hiPSC-ECs étaient dissociés, purifiés, cryopréservés et décongelés comme décrit précédemment⁸.

1. Dégel et plaque hiPSC-ECs en EC-GDF complet complet dans un seul 0,1 % enduit de gélatine T75 fiole, trois ou quatre jours avant le test.
2. La nuit précédant le dosage, stimuler hiPSC-ECs avec TNFα en ajoutant EC-GDF plein additionné de 10 ng/mL TNFα et incuber pendant la nuit (~ 12 h) à 37 ° C, comme décrit précédemment ⁷.

4. hiPSC-ECs Dissociation et ensemencement en puce microfluidique

1. Le jour du test, prendre le ballon d’ECs-hiPSC de l’incubateur et d’examiner les cellules au microscope. Veiller à ce que hiPSC-ECs sont confluents de 80 à 100 % et ont une morphologie typique EC.
2. Transvaser le ballon dans la hotte de la culture cellulaire.
3. Aspirez le milieu de la fiole d’hiPSC-ECs.
4. Lavez brièvement la culture cellulaire en ajoutant 10 mL de PBS sans Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Aspirer le PBS.
5. Ajouter 4 mL par flacon d’enzyme de dissociation 1 x. Incuber 5 min à température ambiante (RT) (Figure 1 b).
6. Arrêter la réaction de dissociation en ajoutant 8 mL de milieu humain endothéliales-GDF par flacon. Doucement, détacher et recueillir la suspension hiPSC-ECs dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL.
7. Compter le nombre total des cellules de la suspension.
8. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min à température ambiante.
9. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans EC-GDF complet à une concentration finale de 1. 5 x 10⁷ cellules/mL.
10. Sortez de la boîte de Pétri avec les biopuces de l’incubateur et le transférer à la hotte de la culture cellulaire.
11. Aspirer la solution de la fibronectine de tous les canaux de la puce microfluidique.
12. Injecter 6 µL de la suspension cellulaire dans chaque canal à l’aide d’une pipette avec une pointe de petit 10 µL (Figure 1, milieu). Assurez-vous que la suspension cellulaire est mélangée bien avant l’injection et éviter la précipitation de la cellule.
13. Examiner la biopuce sous le microscope et faire en sorte que les cellules sont réparties uniformément, et la densité cellulaire est élevée (Figure 2).
14. Incuber les biopuces pendant 15 min à 37 ° C.
15. Ajouter 40 µL d’EC-GDF complet dans les réservoirs moyens des deux côtés de chaque canal.
16. Incuber les biopuces pendant 1 h à 37 ° C (Figure 1, droit).
17. Ajouter un autre à 50 µL de EC-GDF complet dans les réservoirs des deux côtés de chaque canal.

5. préparation des leucocytes humains

Remarque : Dans le protocole décrit ici, une lignée monocytaire commercialement disponibles (THP-1) a été utilisée. Par ailleurs, les cellules mononucléaires de sang périphérique ou neutrophiles peuvent être utilisés. Isolement des monocytes du sang périphérique et les neutrophiles peut être effectuée à l’aide de la procédure standard¹¹. Exécutez toutes les étapes décrites dans ce paragraphe sous une hotte de culture cellulaire.

1. Recueillir les leucocytes dans un tube conique de 50 mL.
2. Laver les leucocytes avec 10 mL de PBS sans Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min à ta (Figure 1).
3. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS avec colorant DiOC6 (λ_ex = 485 nm, λ_em = 501 nm) (1:5 000). Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 10 min à température ambiante.
4. Laver les leucocytes avec 10 mL de PBS sans Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min à RT. répéter l’étape de lavage une fois de plus.
5. Compter le nombre total des cellules de la suspension.
6. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans milieu RPMI complet à une concentration finale de 2. 5 x 10⁶ cellules/mL.

6. préparation de la pompe de microfluidique

1. Assembler la pompe microfluidique avec le collecteur de 8 canaux.
2. Connecter la pompe à un PC avec le logiciel d’exploitation installé.
3. Lancez le logiciel de la microfluidique et charger le protocole en cliquant sur le Protocole ouvert et naviguer sur le PC pour sélectionner le protocole de la microfluidique.
4. Branchez la pompe et le logiciel en sélectionnant le dossier d’installation en cliquant sur Exécuter test étape.
5. Définir la géométrie des canaux pour la commande de taux de débit correct : sélectionnez la Géométrie de mise à jour dans le dossier Setup de géométrie , puis cliquez sur Exécuter test étape.
   Remarque : Assurez-vous que les détails de la géométrie correspondent à la seringue et les canaux à utiliser (géométrie ID = 1, nombre de canaux = 8, largeur du chenal = 800,0 µm, profondeur du chenal = 120.0 µm, volume de la seringue = 250 µL) et la viscosité de l’échantillon (viscosité liquide = 1,0).
6. Laver la pompe en mettant le câble d’entrée (orange) dans le tube conique de 50 mL contenant 80 % d’éthanol. Placer le câble de sortie (vert) dans le tube à vide conique 50 mL (poubelle).
7. Sélectionnez le dossier de Lavage de lavage/pompe , puis cliquez sur Exécuter test étape (lavage volume = 2000 µL, pas de volume de lavage = 250 µL, direction lavage = sortie). Répétez l’étape de lavage une fois de plus.
8. Répétez la pompe lavage des marches (6,6 – 6,7) avec l’eau de qualité de culture cellulaire et milieu de culture humaine endothéliales-GDF.
9. Passez à l’étape de lavage de la tubulure d’admission.
10. Ouvrir manuellement la valve entre la seringue et le collecteur en plaçant l’adaptateur 3-way dans la position correcte (indicateur OFF est tourné vers la gauche).
11. Sélectionnez Régler les chaînes de courant/Open étape dans le dossier de Lavage lavage/collecteur , puis cliquez sur Exécuter test étape pour ouvrir toutes les vannes du collecteur.
12. Laver le collecteur manuellement en appuyant sur 5 mL d’éthanol à 80 % de la seringue, suivie par 5 mL d’eau de qualité de culture cellulaire.
13. Laver le collecteur en appuyant 5 mL de milieu de culture humaine endothéliales-GDF de la seringue.
14. Enlever toutes les bulles d’air important qui sont piégés dans le collecteur. Pour ce faire, placez l’adaptateur de broche 8 puits dans les 10 cm boîte de Pétri avec le milieu et accomplir en poussant/tirant avec la seringue jusqu'à ce que toutes les bulles d’air important ont disparu (petites bulles ne sont pas un problème).
15. Sélectionnez Régler les chaînes de courant/fermer étape dans le dossier de Lavage lavage/collecteur , puis cliquez sur Exécuter test étape pour fermer tous les robinets du manifold.
16. Connectez le câble de sortie verte de la pompe à l’adaptateur de collecteur.
17. Mettre la vanne 3 voies sur la position OFF pour fermer la seringue.
18. Sélectionnez dossier Lavage lavage/câble , puis cliquez sur Exécuter test étape pour laver chaque port avec milieu RPMI individuellement, veiller à ce que toutes les bulles sont retirés de chaque câble (volume de distribution = 100 µL).
    Remarque : Chaque vanne du collecteur est ouvert un par un, de 1 à 8 et 100 μL du milieu est distribué par l’intermédiaire de chaque canal individuellement tout en gardant les autres chaînes fermées. Veillez à ce que le liquide s’étend de chaque broche. S’il n’y a pas de liquide qui sort, c’est une indication d’une bulle d’air ou un sabot.

7. préparation de la puce microfluidique pour vivre d’imagerie

1. S’assurer que les configurations de microfluidique sont prêtes et la chambre d’imagerie live est préalablement équilibrée à 37 ° C et le taux de CO₂ atteint 5 % (Figure 3 a, B).
2. Prenons les biopuces de l’incubateur et placez-la dans le support de puce de microscope. Fixer le support de la puce sur le microscope imaging stade (Figure 3).
3. Afin de connecter la biopuce via le collecteur à la pompe, placer l’adaptateur 8 broches près des réservoirs de la sortie de la puce et approfondir toutes les broches dans le milieu (mais ne branchez pas complètement).
4. Sélectionnez le lavage de | Se connecter à puce dossier, puis cliquez sur Exécuter test étape pour distribuer le milieu RPMI avant de connecter la puce (volume de distribution = 30 mL). Une fois que le milieu est dispensé, insérez l’adaptateur 8 broches dans la prise de la biopuce.
   Remarque : Au cours de cette étape, tous les canaux sont en position sur (ouvrir) et 30 µL du milieu est distribué par l’intermédiaire de chaque canal et suite à cela, les canaux sont définies sur Off (fermé). De cette manière, pas d’air bulles seront introduits dans les canaux de la puce microfluidique.
5. Manuellement aspirer le support de tous les réservoirs d’arrivée de la biopuce avec une pipette.
6. Sélectionnez le lavage de | Puce de lavage dossier, puis cliquez sur Exécuter test étape à perfuse 40 mL de milieu EC-GDF complet à travers les canaux un par un pour se débarrasser des cellules mortes/débris du canal (volume de lavage = 40 µL, cisaillement de lavage Maximum = 40 dynes/cm²).

8. flow adhérence Assay et Acquisition d’images

1. Manuellement aspirer le support du réservoir d’entrée du chenal d’intérêt avec une pipette.
2. Ajouter 100 µL de leucocytes de 5,6 étape vers le réservoir de l’entrée du chenal d’intérêt.
   Remarque : Mélanger délicatement les cellules pour produire une suspension de cellules individuelles.
3. Dans l’analyse de cellules | Description de l’étape dossier, sélectionnez Set Current Channel/Step Description , dans la liste des canaux, sélectionnez uniquement le canal courant d’intérêt et en position On (ouvert) valeur et tous les autres sept canaux Off (fermé).
4. Sélectionnez le test de cellule | Description de l’étape dossier, puis cliquez sur Exécuter test étape.
   Remarque : Assurez-vous que Taux de débit Variable distribution s’applique une pression négative constante pour tirer la suspension de leucocytes provenant du réservoir d’entrée via le canal pendant 5 min (ensemble de cisaillement = constante, contrainte de cisaillement =-0,50 dyne/cm², durée = 00:05:00, Scan de retard = 00:00:00). La valeur négative de la contrainte de cisaillement assure le bon sens de l’écoulement.
5. Aspirer les leucocytes restants dans le réservoir d’aspiration.
6. Ajouter 100 µL de milieu RPMI complet au réservoir d’aspiration. Sélectionnez dossier cellule test/Step description , puis cliquez sur Exécuter test étape pour perfuse le canal pendant 5 min avec milieu RPMI afin d’estomper tous les leucocytes non adhérents (ensemble de cisaillement = constante, contrainte de cisaillement =-0,50 dyne/cm², durée = 00 : 05:00, retard de Scan = 00:00:00).
7. Acquérir des images d’au moins trois ou quatre positions différentes du chenal afin d’imager les leucocytes adhérés (pour s’assurer que les aires représentatives sont capturées).
8. Répétez les étapes 8.1 – 8,7 pour évaluation fonctionnelle de l’ensemble des canaux.
   Remarque : Il est possible d’exécuter plusieurs canaux à la fois. Pour ce faire, ouvrir tous les canaux d’intérêt au cours de l’étape de 8.3. et effectuer tous les précités étapes 8,4 –8.7 pour plusieurs canaux d’intérêt.

9. Comment remplir le test et le nettoyage de la pompe de la microfluidique

1. À l’issue de l’expérience, exporter et enregistrer toutes les images au format RAW.
2. Lors de l’enregistrement des résultats, exécutez la pompe de la microfluidique et le collecteur protocole de nettoyage.
3. Pour la pompe de la microfluidique, exécutez d’abord le dossier de Lavage/pompe lavage en perfusant 4 mL d’eau de qualité de culture cellulaire, puis 4 mL 80 % éthanol comme décrit aux étapes 6.6 – 6,7 sec la pompe en exécutant l’air pendant plusieurs minutes.
4. Afin de nettoyer le collecteur, exécutez pas de Lavage de lavage/collecteur avec la seringue. Suivez les étapes pour ouvrir la seringue et les valves multiples tel que décrit dans les étapes 6.10 – 6.11 lavage tout d’abord avec l’éthanol à 80 % et prochaine avec l’eau de qualité de culture cellulaire. Sécher le collecteur en poussant l’air par l’intermédiaire de la seringue. Fermer la vanne de la seringue et les valves multiples comme décrit aux étapes 6.10 et 6.15.

10. décompte des leucocytes adhérentes

1. Téléchargez et installez le logiciel¹⁴ de http://cellprofiler.org de traitement d’image.
   Remarque : Traitement dans cette étude de l’image a été réalisée à l’aide du logiciel version 2.1.1. Si vous utilisez une version plus récente, le pipeline peut nécessiter une adaptation mineure.
2. Télécharger le pipeline Count_leukocytes.cpipe. Cliquez sur le fichier | Importation | Pipeline partir du fichier et naviguer sur PC pour choisir le pipeline Count_leukocytes.cpipe.
3. Glisser-déposer un dossier avec les images RAW acquis des leucocytes adhérentes à la fenêtre de liste de fichiers dans les modules de entrée | Images section pour analyse.
4. Spécifier la taille typique des leucocytes via des modules analyse | IdentifyPrimaryObjects. Spécifiez le diamètre minimal et maximal des leucocytes adhérentes en pixels.
5. Sélectionnez les critères de filtrage via des modules analyse | FilterObjects. Indiquez la surface minimale acceptée d’objets en pixels.
6. Démarrer l’analyse en appuyant sur le bouton Analyze images .
   Remarque : Toutes les images RAW seront traitées et les résultats seront enregistrées dans un dossier de sortie par défaut. Le fichier de sortie Image.txt contient le nombre de leucocytes adhérentes dans chaque image traitée (chaque numéro correspond à une image, c'est-à-dire, chaque champ de vue acquis).

Résultats

Tout d’abord, la réponse de hiPSC-ECs à la stimulation avec agent pro-inflammatoire TNFα devraient être examinée, comme décrit plus haut⁷. Traitement de TNFα pendant 12 h déclenche la stimulation de l’expression de la E-sélectine avec un pic à 6 h après le début du traitement. En outre, ICAM-1 est augmentée après le traitement 6 à 12 h. Bien que nous n’avons pas observé l’upregulation attendue de VCAM-1, il est généralement observé dans les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine primaire (HUVEC). Nous avons trouvé une nuit traitement de TNFα (12 h) pour être le plus commode pour l’essai d’adhérence de leucocyte.

Optimale hiPSC-ECs dissociation devrait se traduire par une suspension monocellulaire libre d’amas de cellules. La figure 2 illustre la densité optimale hiPSC-EC juste après l’injection. En règle générale, 15 min après l’injection, hiPSC-ECs attachent au fond du chenal et commencent à se répandre (Figure 2D). 1 h après l’injection, hiPSC-ECs former une monocouche bien répartie le long du canal et sera prêts commencer le test de débit (Figure 2E).

Marquage des leucocytes avec traceur fluorescent est bénéfique pour la phase des images contrastées dans automatisé de quantification de l’image, car il facilite l’étape d’identification de cellule, en particulier parce que les leucocytes adhèrent à la monocouche d’ECs et il est souvent difficile logiciel distinguer les différents types de cellules.

Gratuit logiciel de traitement d’images open source est très utile pour la quantification automatique des leucocytes adhérentes. Le pipeline visé dans le protocole ici repose sur l’identification de l’objet principal à l’aide d’adaptatif d’images fluorescentes des leucocytes (Figure 4 a). Filtrage des objets basés sur une zone minimale en outre identifiés filtre les objets faussement identifiés, comme les débris cellulaires, autofluorescence ou tout autre non-spécifiques signal fluorescent (Figure 4 C, D).

Une seule puce microfluidique avec huit canaux parallèles permet la comparaison de deux groupes indépendants, par exemple, ECs différencient des hiPSCs indépendants, tels que les donneurs sains ou atteints de maladies génétiques. Des contrôles supplémentaires, tels que l’ECs, ou avant le traitement avec un anticorps bloquant ICAM-1 peuvent être inclus en tant que puits^10,11. Puces microfluidiques deux ou trois peuvent être traitées simultanément. Pour la robustesse des conclusions, un minimum de trois expériences biologiques indépendants sur des jours indépendants est recommandé.

Figure 1 : Préparation du hiPSC-ECs et leucocytes pour l’essai de débit. (A) avant le traitement de hiPSC-ECs avec le stimulus pro-inflammatoires (TNFα). (B) Représentation schématique de la dissociation enzymatique hiPSC-ECs, centrifugation et remise en suspension. Représentation schématique (C) du revêtement des canaux (C, gauche), l’injection de la suspension hiPSC-EC (C, middle) et ajout de milieu de culture après l’attachement de ECs-hiPSC dans la puce microfluidique de cellules. (D) une représentation schématique de l’étape de lavage de leucocyte, marquage avec le colorant fluorescent DiOC6 et remise en suspension. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Puce microfluidique avec ECs-hiPSC. La puce microfluidique (A) une boîte de Pétri de 10 cm. (B) la chambre humidifiée utilisés pour l’incubation. (C, D, E) Des images représentatives de hiPSC-ECs dans la microfluidique canal 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) après l’injection. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Montage expérimental de l’essai de la perfusion de cellules vivantes d’imagerie et de leucocytes. (A, B) Représentation de photo (A) et le schéma (B) de l’installation expérimentale du dosage d’imagerie et de flux de cellules vivantes : (1) pompe de microfluidique - microscope inversé à fluorescence avec monté direct d’imagerie chambre (5 % CO₂, 37 ° C, humidifié), (2) -, (3) - 8 canaux variété, (4) PC - PC pour l’acquisition de contrôle et de l’image du microscope, (5) - pour la commande de pompe de microfluidique. La puce microfluidique (C) avec le tube inséré du collecteur 8 voies fixée dans un support de plaque et montés sur la platine motorisée du microscope. (D) Représentation schématique des grandes étapes de l’analyse de flux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Image analyse et détection automatique des leucocytes adhérentes. (A) la fenêtre de dialogue du logiciel avec les paramètres spécifiés pour l’identification des leucocytes de traitement d’image. Critères (B) la fenêtre de dialogue du logiciel de traitement d’image avec filtrage spécifié des objets identifiés issus au minimum accepté superficie (SA_min = 70 px). (C) exemple d’une identification correcte des leucocytes et le filtrage d’objets non spécifiques de la petite surface (SA) (diamètre typique en pixel (Min, Max) = (9, 15) ; Filtrage des critères SA_min = 70 px). Objets acceptés sont représentées en vert et des objets mis au rebut sont représentés en violet. (D) exemple d’identification incorrecte des leucocytes en raison de la gamme incorrecte de diamètre typique (diamètre typique en pixel (Min, Max) = (3, 15) ; Filtrage des critères SA_min = 70 px). Objets acceptés sont représentées en vert et des objets mis au rebut sont représentés en violet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit la caractérisation du traitement de hiPSC-EC par des stimuli pro-inflammatoires, telles que TNFα, l’évaluation fonctionnelle de l’adhérence des leucocytes à hiPSC-ECs dans l’essai de débit moyen direct d’imagerie et de comptage automatique des leucocytes adhérentes.

La stimulation durant la nuit du hiPSC-ECs avec TNFα provoque l’apparition allongée qui indique en général un phénotype pro-inflammatoire activé en ECs. Pendant la phase d’optimisation, expression des niveaux de la E-sélectine, ICAM-1, VCAM-1 devraient être vérifiées par FACs^7,8et la veine ombilicale humaine primaire ECs (HUVEC) sont conseillés pour être inclus comme témoins positifs.

Optimale hiPSC-ECs dissociation et la densité de semis doivent être atteinte pour atteindre une monocouche confluente sans former des amas de cellules et de canaliser les sabots. Il est essentiel de remettre en suspension droite de leucocytes avant la perfusion afin d’éviter la précipitation de la cellule et de maintenir une concentration constante lors du dosage de chaque canal. Leucocytes du sang périphérique humain, comme les monocytes et les neutrophiles peuvent être utilisés ou établis des lignées monocytaire, tels que THP-1 ou HL-60 pourrait être utilisé comme une alternative.

Au cours de l’Assemblée de la configuration de la microfluidique et Pendant le test de débit, il est essentiel pour empêcher les bulles d’air d’être piégés dans le tube de la microfluidique et les canaux, car ils peuvent entraîner le détachement de hiPSC-ECs et/ou de leucocytes adhérentes. Interface fluide-à-liquide ou incorporation des étapes de lavage supplémentaire lors de la préparation de l’installation de microfluidique pourrait aider à prévenir les bulles d’air.

Il est recommandé que le protocole est géré par deux opérateurs où on prépare les cellules et le second prépare le test de système et le flux de microfluidique. Cela garantit que l’ECs sont plaqués en puces microfluidiques dans une fenêtre de temps constante avant traitement et améliore la précision et la reproductibilité des résultats. En outre, cela permet également de mise en place des expériences aveugles éviter le biais dans les résultats.

Pour la détection des cellules réussie avec le pipeline de traitement d’image automatique, il est important d’acquérir des images mise au point avec un rapport signal sur bruit élevé et d’éviter l’autofluorescence des objets non spécifiques, tels que les amas de cellules. D’une importance cruciale est la spécification correcte des limites minimales et maximales de la taille typique des leucocytes adhérentes qui doivent être identifiés. On peut estimer la taille typique des leucocytes à l’aide d’un outil de mesure de ligne dans ImageJ. Par exemple, dans notre analyse, nous avons utilisé la gamme de 9 à 15 pixels, ce qui correspond à la taille physique de 10.3 – 17,1 µm (Figure 4). Lors de l’utilisation d’une gamme mal, par exemple, de 3 à 15 pixels (3.4 – 17,1 µm), un seul leucocyte est identifié non pas comme une seule cellule, mais plutôt ses sous-parties sont identifiés en tant qu’objets distincts (Figure 4). Cela conduit à la fausse nombre d’objets à identifier.

Nombre d’objets de faible intensité et plus petite superficie de leucocytes peuvent être détectées à l’aide de la méthode de seuillage adaptatif fourni. Cela pourrait prendre place en raison de l’autofluorescence ou tout autres signaux fluorescents non spécifiques. Néanmoins, ces objets non spécifique, si leur superficie est inférieure à la zone typique d’un leucocyte unique, peuvent être filtrés en définissant la superficie minimale acceptée (Figure 4).

L’essai de débit décrite ici permet une évaluation directe de l’adhérence des leucocytes à une monocouche EC, élucider l’interaction de ces deux cellules types, mais ne prend pas en compte d’autres cellules types, telles que les péricytes qui sont présent dans la paroi vasculaire et pourrait également participent à la régulation de l’extravasation de leucocyte¹⁵. Intégrant un micro-environnement culture 3D avec d’autres types de cellules pourrait améliorer la pertinence physiologique du système. Malgré ces limites, le test de débit pour l’évaluation des réponses inflammatoires décrits ici fournit un outil précieux pour la maladie et à la caractérisation de base des applications de modélisation de hiPSC-ECs.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vena8 Endothelial+ biochip	Cellix Ltd	V8EP-800-120-02P10
Mirus Evo Nanopump	Cellix Ltd	MIRUS-EVO-PUMP	1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables.
8-channel manifold MultiFlow8	Cellix Ltd	MIRUS-MULTIFLOW8
Humidified box	Cellix Ltd	HUMID-BOX
Fluorescence imaging system Leica AF6000	Leica Microsystems
Electron-multiplying charge-coupled device camera	Hamamatsu	C9100
Biological safety cabinet/laminar flow-hood	Cleanair
CO2 cell-culture incubator	Panasonic	MCO-170AICUV
Centrifuge	Hitachi	himac-CT6EL
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL)	Gilson international	4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl)
Sterile plastic pipette	Greiner Bio-One	606180 (5ml), 607180 (10ml)
Petri dish	VWR/ Duran Group	391-0860
Culture flasks (75 cm2)	CELLSTAR	658,170
Centrifuge tube (15 mL)	CELLSTAR	188271
Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G1890
Fibronectin (Bovine plasma)	Sigma-Aldrich	F1141
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-169
Human Endothelial-SFM	Life Technologies	11111-044
Human VEGF 165 IS, premium grade	Miltenyi Biotec	130-109-386
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-842
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine	Biomedical Technologies	BT-214
Recombinant Human TNF-α	Tebu-bio	300-01A-A
TrypLE Select	Life Technologies	12563029
DiOC6(3)	Sigma-Aldrich	318426
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	21875-034
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Life Technologies	31350010
FBS	Life Technologies	10270-106
L-glutamine	Life Technologies	25030-024
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Life Technologies	15070-063
Distilled water	Life Technologies	15230-089
Ethanol absolute	Merck	1.00983.2500
VCAM-1	R&D systems	FAB5649P
E-Selectin	R&D systems	BBA21
ICAM-1	R&D systems	BBA20
Name	Company	Software version	Comments
Cellrofiler	CellProfiler	2.1.1
VenaFluxAssay Software	Cellix Ltd	2.3.a