Évaluation non invasif de la fonction musculaire de dorsifléchisseurs chez la souris

Résumé

Mesure de la fonction contractile du muscle squelettique rongeurs est un outil utile qui peut être utilisé pour suivre la progression de la maladie ainsi que l’efficacité d’intervention thérapeutique. Nous décrivons ici l’évaluation non invasive, in vivo des muscles dorsifléchisseurs qui peut se répéter au fil du temps dans la même souris.

Résumé

Évaluation de la fonction contractile du muscle squelettique est une mesure importante à la fois clinique et de recherche. Nombreuses conditions peuvent affecter négativement le muscle squelettique. Cela peut entraîner une perte de masse musculaire (atrophie) et/ou une perte de qualité de muscle (réduit la force unitaire du muscle masse), qui sont fréquents dans les maladies chroniques, maladies musculaires spécifiques, immobilisation et le vieillissement (sarcopénie). La fonction de muscle squelettique chez les animaux peut être évaluée par une variété de différents tests. Tous les tests ont des limitations liées à l’environnement de test physiologique, et le choix d’un test spécifique souvent dépend de la nature des expériences. Ici, nous décrivons une technique non-invasive in vivo, , impliquant une évaluation utile et facile de fréquence-courbe de force (FFC) chez les souris qui peuvent être effectuées sur le même animal au fil du temps. Cela permet une surveillance de la progression de la maladie et/ou de l’efficacité d’un traitement thérapeutique potentielle.

Introduction

Le muscle squelettique est un important tissu métabolique qui comprend environ 40 % du poids corporel total. Il joue un rôle crucial dans le contrôle de l’énergie du métabolisme et l’homéostasie du¹. Le muscle squelettique masse est maintenue par un équilibre subtil entre les taux de protéines de synthèse et dégradation¹. Nombreuses pathologies affectent ces processus dans le muscle squelettique conduisant à une perte nette de la masse musculaire (atrophie). Ceux-ci incluent, mais ne se limitent pas aux vieillissement cancer, sida, jeûne et immobilisation^2,3d’un membre. Dans le vieillissement de la population, perte de force est associée à une perte de muscle de masse et est un facteur prédictif de mortalité tout cas⁴. Dans ce contexte, l’évaluation de la fonction musculaire fournit une mesure importante lors de la détermination de l’efficacité des stratégies thérapeutiques pour combattre ou prévenir la fonte musculaire squelettique et perte de fonction.

Chercheurs ont utilisé beaucoup de différentes approches et des modèles animaux pour comprendre les voies moléculaires de muscle atrophie^5,6 et les implications de ces mécanismes sur muscle fonction contractile^{2,3 ,},⁷. Corrélation entre les changements au niveau moléculaire à des différences dans la fonction musculaire est donc indispensable dans la compréhension comment les changements de niveau moléculaires peuvent avoir un impact des fonctionnalités de muscle.

Fonction de muscle squelettique, particulièrement chez les petits rongeurs, est généralement effectuée à l’aide de trois procédures bien définies^8,9 pour détecter avec facultés affaiblies de la production de force et/ou surveiller la progression de la maladie. (1) ex vivo ; où le muscle est retiré de l’animal et incubé dans une solution de Ringer bain solution pour évaluer la fonction du muscle à l’aide de la zone de stimulation¹⁰. (2) In situ ; où la fixation proximale du muscle reste chez l’animal et le tendon distal est relié à un capteur de force, ce qui permet la fonction musculaire doit être effectuée par la stimulation de nerf direct¹¹. (3) In vivo ; Si les électrodes sont placées par voie sous-cutanée pour obtenir évoquée par le nerf muscle force production^9,12. Alors que ces trois méthodes sont utilisées à des fins différentes, ils chacun possèdent des avantages et inconvénients. Par conséquent, il est important de choisir une méthode appropriée basée sur l’objectif de l’étude. La principale limitation avec ex vivo des expériences est l’enlèvement du muscle de son environnement normal et l’utilisation de la stimulation de champ. La méthode in situ maintient une circulation sanguine normale et utilise la stimulation du nerf, mais l’anatomie normale est altérée et la nature de l’expérience est en phase terminale ; ainsi, cela rend les mesures de fonction musculaire suivi impossible. La méthode in vivo décrite ici plus étroitement imite normal physiologie en ce que l’anatomie est intacte, le faisceau neuromusculaire reste intact, et l’expérience n’est pas terminale, ce qui permet des mesures de suivi au sein du même animal au fil du temps,⁸.

Ici, nous décrivons une procédure in vivo qui permet des mesures multiples de la fonction musculaire chez le même animal au fil du temps. Cette procédure implique l’évaluation des muscles du compartiment antérieur crural — notamment le jambier anterior(TA) extensor digitorum longus (EDL) et des muscles extenseurs hallicus longus (EHL), responsables de la dorsiflexion — dans une procédure non invasive par neurostimulation fibulaire (également connu sous le nom péronier). La TA fournit l’essentiel de la force de dorsiflexion cheville¹³, avec seulement une contribution minimale de l’EDL et EHL que contrôler le mouvement des orteils. Ce protocole non terminal assure la préservation de l’approvisionnement nerveux et sanguins. Ceci permet l’étude de l’efficacité d’evolution et traitement de la maladie au fil du temps dans l’environnement plus physiologique actuellement disponible dans un modèle animal.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par Deakin University Animal Ethics Committee (projet #G19/2014).

1. installation de l’équipement

1. Veiller à ce que toutes les machines sont correctement connectés.
2. Allumez l’ordinateur, la haute puissance bi-phasée stimulateur et système de levier double mode.
3. Mettre en place la pince de genou de la souris sur la plate-forme, ainsi que la semelle de la souris sur le transducteur.
4. Tourner sur la plate-forme de chauffage à 37 ° C.
5. Ouvrez le logiciel de contrôle musculaire dynamique sur le bureau.
   Remarque : Il s’agit de logiciels nécessaires pour effectuer des tests fonctionnels.

2. le logiciel et installation du modèle

1. Une fois le programme ouvert (Figure 1), calibrer le capteur et sélectionnez d’installation | Mes Instruments | Étalonner les.
2. Sur la touche « Setup », sélectionnez InstantStim et changer les paramètres de « Run Time » à 120 s (Figure 1 a).
   Remarque : Tension optimale est possible également en effectuant des mouvements convulsifs unique, mise en place manuellement ou à partir de l’InstantStim autant de fois que nécessaire.
3. Dans la fenêtre type-able étiquetée « Autosave Base » pour saisir le nom de l’auto pour enregistrer l’emplacement du fichier (par exemple, mouse1-date-timepoint1). Cochez la case située à gauche de la fenêtre « Base de sauvegarde automatique » et changer pour Activer enregistrement automatique.
4. En haut du contrôle DMC écran aller à séquenceur, qui ouvrira une nouvelle fenêtre pop-up. Sélectionnez la Séquence Open et sélectionnez le protocole premade d’être utilisée (Figure 1 b). Cliquez sur la séquence de chargement | Fermez la fenêtre.
   Remarque : Cette étape sert à générer un test de fréquence-courbe (FFC) de force (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz).
5. Réglez le bouton de « RANGE » à 10 mA sur le stimulateur bi-phasée.
   Remarque : Assurez-vous que le bouton « Ajuster » (en bas à droite suivant) est sur zéro. Ce réglage permet l’installation des électrodes.

3. configuration de souris

Remarque : Toutes les mesures de force ont été effectuées sur des souris mâles type sauvage (C57BI/6) à l’âge de 12 semaines.

1. Placez chaque souris dans la chambre de l’anesthésie avec un débit d’oxygène de 1 L/min avec 5 % isoflurane (par inhalation de l’ogive) jusqu'à ce que la souris perd conscience. Confirmer l’anesthésie adéquate via perte du réflexe pied.
2. Enlever tous les poils sur la jambe droite de la souris par le rasage avec tondeuse électrique.
3. Placer l’animal dans une position en décubitus dorsal sur la plate-forme chauffée et nettoyer la jambe droite (peuvent être utilisée des deux côtés) avec 70 % d’alcool et de l’iode. À ce stade, ajuster l’isoflurane à 2 % (avec une alimentation en oxygène à 1 L/min) et appliquez le gel conducteur sur la peau où les électrodes seront placés.
   Remarque : Une sonde de température rectale permet de surveiller la température du corps au cours de la procédure et appliquer la pommade ophtalmique pour éviter tout dessèchement et/ou des dommages à l’oeil.
4. Placer le pied sur la semelle et fixez à l’aide de ruban adhésif médical. Bloquer le genou afin de stabiliser et d’immobiliser la jambe au cours de la procédure.
   Remarque : Certaines études ont décrit à l’aide d’une épingle très mince insérée à travers le tibia proximal (postérieur aux muscles fléchisseurs)¹² pour fournir la stabilisation. Ce protocole opte pour une pince, car cela fournit une stabilisation suffisante sans compression/dommages inutiles au genou. La pince évite également d’inflammation potentielle qui risqueraient de créer une broche trans-osseux, tout en permettant une évaluation précise de la contractilité du muscle. En outre, la pince de genou de souris a été utilisé avec succès¹⁴.
5. À ce stade, utilisez les boutons sur la plate-forme pour positionner le membre postérieur de la souris afin qu’il y a un angle de 90° à la cheville (Figure 2).

4. optimisation de la Position des électrodes

1. Une fois que la souris est placée sur la plate-forme, placer les électrodes sous la peau (sous-cutanée) à la jambe droite.
   Remarque : Il s’agit d’une étape cruciale, et certains repositionnement peut-être devoir obtenir la position désirée lors de l’installation à l’étape 4.4.
2. Placez les électrodes sur le côté latéral de la jambe droite ; Placez un près de la tête du péroné et l’autre électrode plus distale sur le côté latéral de la jambe (Figure 2).
   Remarque : Un système d’électrodes sur mesure est conçu pour optimiser cette étape. Cependant, cet essai peut être effectué avec électrodes aiguilles fournies par le fabricant dans ce système.
3. Une fois que ces étapes sont atteints, le stimulateur de bi-phasée haute puissance, réglez le bouton portant la mention « ADJUST » requise pour obtenir une stimulation du nerf péronier qui se traduit par couple de dorsiflexion maximale.
   Remarque : Pour des souris adultes de type sauvage, cet intervalle est inférieur à 2 mA ; Toutefois, cela peut être tributaire de la taille, âge et sexe de l’animal. La production de force (pics de courbes) doit être augmentée lentement jusqu'à ce que la force maximale est atteinte.
4. Pendant la stimulation, le transducteur tournez vers la droite pour obtenir des valeurs négatives (Figure 3), qui sont importants pour s’assurer que les électrodes sont stimulant seulement les muscles dorsifléchisseurs de nerf péronier. Une fois cette étape réalisée, stabiliser les électrodes à l’aide d’une pince, empêchant tout mouvement pendant la procédure.
   Remarque : Les pics augmentera lentement dans l’ampleur et l’intensité maximale est déterminée par le niveau au cours de laquelle trois ou plusieurs stimulations consécutifs résultent contractilité identiques. Résister en tournant l’ampérage plus élevé que nécessaire ; l’intensité maximale va stimuler les muscles antagonistes à se contracter, les voisins et potentiellement causant la co-contraction, qui peut générer des pics des valeurs positives.
5. Arrêter la Stim instantanée sur le logiciel.
6. Sur l’écran principal, tourner le bouton « Démarrer la séquence » pour démarrer la séquence d’installation précédente (comme indiqué au point 2.4).

5. mettre fin à la procédure

1. Une fois la mesure de la force est terminée, retirez les électrodes, relâcher la pince du genou et enlever le ruban de pied.
2. Désactiver l’isoflurane et maintenir l’apport d’oxygène pendant quelques minutes, facilitant la récupération animale. Une fois que la souris se met en mouvement et/ou reprend conscience et pouvez dès self, retourner la souris à sa cage.
   Remarque : Un anti-inflammatoire non stéroïdien (ains) peut être injecté par voie sous-cutanée (1 mg/kg meloxicam) afin d’éviter toute gêne ou douleur après l’intervention.

6. analyse de données

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données.
2. Aller à Haut débit (en haut à gauche sur l’écran). Select Force fréquence d’analyser ce qui précède décrit la séquence d’installation.
3. Sélectionnez manuel et modifiez la valeur de « Fin de curseur » 3. Également sélectionner Supprimer Baseline.
4. Cliquez sur Sélectionner les fichiers pour accéder à la procédure effectuée précédemment, puis cliquez sur Analyze. À ce stade, le résultat peut être consulté sur l’écran ou exporté vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie et/ou des calculs.
   Remarque : Les données ont été mesurées dans mN ; Cependant, le couple peut être calculé en multipliant la valeur de la force par la longueur du bras du levier (force absolue). Si la normalisation est nécessaire (force spécifique), couple peut être normalisée au poids corporel, ou terminal des expériences peuvent être effectuées pour recueillir la masse musculaire du même âge.

Résultats

La courbe force-fréquence est un test utile dans laquelle les muscles peuvent être stimulées par des fréquences inférieures et supérieures de distinguer de réponses suboptimales et optimale de la force¹⁵. La force à des fréquences basses peut stimuler une secousse unique, activation des unités moins et plus petit moteurs, et à des fréquences plus élevées, un pic stable est atteinte, où des secousses isolées fusionnés (tétanos), atteignant une force maximale grâce à l’activation de toutes les unités motrices¹⁶ . Dans le test présenté, les courbe tétaniques dès ~ 60Hz, où la potentialisation peut être visualisée (Figure 4 a) et la force maximale sont déterminées à ~ 150 Hz (Figure 4 b), lorsque le plateau est atteint avec une courbe fondu terminé^{9, 16}.

Toute variation de ces résultats peut indiquer que les muscles ne sont pas être correctement stimulés par les électrodes. Placement des électrodes est une étape importante dans la préparation de cette procédure, comme la stimulation électrique doit être positionnée correctement pour innerver le nerf péronier et ainsi activer complètement les muscles de la flexion dorsale, qui lui fournit (TA, EDL et EHL). Bon positionnement des électrodes se traduit par la génération des pics négatifs (Figure 3) au cours de ce processus, alors que le défaut d’alignement entre les électrodes ou l’ampérage plus élevé peut conduire à la stimulation des muscles, cause co-contraction de la les muscles voisins et muscles antagonistes, ce qui génère à son tour les sommets des valeurs positives.

Figure 5 a montre les données de fréquence-courbe force représentative d’une souris au fil du temps, où la procédure a été répétée une fois par semaine jusqu'à ce que 5 points ont été achevés. Ces observations ont montré une force cohérente des valeurs de production dans l’ensemble les points et/ou les observations mesurées. Cette procédure a également été montré pour être cohérent entre les mesures de la souris, comme le montre la Figure 5 b le représentant aire sous la courbe de la FFC a stimulé de plus de 5 différentes observations à 6 souris testés une fois par semaine.

Figure 1 : Logiciel système. (A) commande logiciel figure des étapes permettant de configurer les paramètres de « Stim instantanée ». Sur la photo d’arrière-plan, cliquez sur d’installation | Stim instantanée. Sur le petit sauté vers le haut de la fenêtre (photo avant), définir les paramètres. (B) Illustration de l’affichage de configuration « Sequencer ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Configuration souris. Aperçu de la position de l’animal anesthésié. La pince du genou droit est placée afin que le genou soit à 90° et que le pied et la cheville sont à angle de 90° (ligne en pointillés de blanche). Contraction des muscles fléchisseurs est obtenue par la stimulation du nerf péronier, qui se trouve juste en dessous (distal) la tête du péroné. Nous utilisons des électrodes spécialement conçus (en médaillon) ; Toutefois, des électrodes aiguilles fournies avec l’appareil, ou achetés séparément, sont également suffisants. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Sortie de positionnement des électrodes. Une fois que les électrodes sont placées sous la peau, et la tension est enclenchée, pics avec des valeurs négatives sont observés. À ce stade, atteignant des valeurs négatives (lignes vertes) est une étape cruciale en veillant à ce que la stimulation est atteint dans les dorsifléchisseurs muscles seuls (TA, EDL et EHL). La mesure en temps réel est indiquée entre les deux lignes rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Courbes représentatives. Échantillon (A) de la courbe de force à 60Hz (souris #06). Échantillon (B) de la courbe tétanique à 150 Hz (souris #03). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Représentant la force courbe de fréquence (FFC) et l’aire sous les données de la courbe. (A), FFC (axe x) plus de 5 différents points (semaines 1, 2, 3, 4 et 5) dans une souris de l’échantillon (05). (B) aire sous la courbe (AU, axe des y) de la FFC sur 5 points différents (souris #01, 02, 03, 04, 05 et 06, respectivement ; axe x). Résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type de mesure (SEM) de cinq points (essais) à 6 souris et ont été analysés par ANOVA à test (p < 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Discussion

Mesure de la fonction contractile musculaire maximale d’une manière précise et reproductible est essentielle à l’évaluation progressive génétiques, métaboliques et muscle conditions¹⁷. De même, la fonction contractile musculaire in vivo permet l’évaluation de nouveaux traitements et thérapies pour muscle conditions débilitantes. Nous démontrons ici la mesure de la production de la force des muscles dorsifléchisseurs de souris du membre postérieur inférieur à travers une procédure in vivo.

Les appareils commerciaux sont efficaces et utiles dans le cadre de cette procédure non invasive. Ce test offre des avantages importants reliés à l’évaluation de la fonction contractile musculaire tout en préservant un environnement physiologique natif, dans lequel le sang, l’approvisionnement et l’innervation restent intacts. En revanche, ses inconvénients sont liés à la normalisation de la force par unité de transversale du muscle (force spécifique), ce qui seulement peut être établi dans un muscle isolé qui est récolté après expérimentation. Cependant, le test non invasif permet de multiples mesures de la fonction contractile des muscles fléchisseurs chez le même animal au fil du temps, ce qui entraîne un nombre réduit d’animaux de laboratoire soit nécessaires, surtout si l’objectif est d’évaluer les changements relatifs ( changements dans la force absolue au fil du temps).

Il y a des étapes importantes qui doivent être examinées au cours de cette procédure afin d’assurer la cohérence des données dans les intervalles. Tout d’abord, on devrait essayer de normaliser les animaux positionnement lorsque c’est possible. En second lieu, au cours de la mise en place il est importante d’être cohérent avec électrode de positionnement afin que la stimulation optimale peut être atteint via la stimulation du nerf péronier. L’emplacement des électrodes doit être sur le côté latéral de la jambe (dans ce cas à droite), près de la tête du péroné et d’autres plus loin sur le côté latéral de la jambe (Figure 2). Sur cette base, les électrodes sur mesure sont conçus comme tels que les deux peuvent être placés à la même position chaque fois. Toutefois, une stimulation suffisante aussi est possible en utilisant les aiguilles électrodes fournies avec les appareils commerciaux. En troisième lieu, il est essentiel atteindre des pics négatifs lors de la configuration de tension en tournant dans le sens horaire le transducteur relié à la semelle. Bon positionnement des électrodes jambe souris avec réglage de la tension maximale a montré comme une technique qui peut être effectuée sur la souris même au fil du temps.

La capacité d’évaluer et de suivre la fonction musculaire à différents intervalles sur le même animal est une évaluation importante pour caractériser les maladies musculaires différentes ainsi que leur progression. En outre, cette mesure de la dorsiflexion du muscle chez la souris peut être un outil pour évaluer l’efficacité des traitements potentiels dans un environnement physiologique natif, avec moins de stress métabolique¹². Ainsi, il fournit une technique pour évaluer le traitement de la maladie, sa progression et son potentiel musculaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse	Aurora Scientific Inc.	305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus	Complete muscle function system
Conductive gel	Livingstone	ECGEL250	conductive gel used in the mice
Eye ointment	Alcon	Poly Visc	pharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)	Ilium	Metacam	veterinary medicine (injectable 5mg/ml)
Isoflurane	Zoetis	Isoflo	veterinary inhalation Anaesthetic