Visualisation niveaux gibbérelline cellulaires à l’aide de la NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer biocapteur (FRET)

Résumé

Gibbérelline Perception capteur 1 (GPS1) est le premier Förster resonance energy axée sur le transfert biocapteur pour mesurer les niveaux cellulaires de phytohormones gibbérelline avec une haute résolution spatio-temporelle. Ce protocole des rapports sur la méthode de visualiser et de quantifier les niveaux de gibbérelline cellulaires utilisant le biocapteur nlsGPS1 génétiquement encodé dans Arabidopsis hypocotyles et radicelles.

Résumé

La gibbérelline phytohormone (GA) est une petite molécule signalisation mobile qui joue un rôle clé dans la germination des graines, l’élongation cellulaire et les transitions du développement chez les plantes. Gibbérelline Perception capteur 1 (GPS1) est le premier transfert d’énergie de résonance Förster (FRET)-base de biocapteur qui permet de contrôler les concentrations cellulaires GA in vivo. En mesurant un facteur d’émission de fluorescence du nucléaire localisé-GPS1 (nlsGPS1), la cartographie spatio-temporelle des gradients de GA endogène et exogène fournis dans types de tissus différents est réalisable à l’échelle cellulaire. Ce protocole décrit comment nlsGPS1 les ratios d’émission en trois expériences exemple d’image : équilibre, traitements de₄ (GA₄) avant et après la gibbérelline exogène A et au fil du temps un traitement. Nous fournissons également des méthodes pour analyser les rapports d’émission nlsGPS1 aide de Fidji et un logiciel de visualisation et d’analyse commerciale à balayage tridimensionnelle (3D) et expliquer les limites et les pièges susceptibles d’utiliser nlsGPS1 pour quantifier les niveaux de la gibbérelline.

Introduction

Hormones végétales jouent un rôle fondamental dans la croissance des plantes et le développement. Ces molécules de signalisation petites, mobiles sont généralement réglementées à plusieurs niveaux, tels que la biosynthèse, catabolisme et courte et longue distance transport^1,2,3,4. La compréhension des voies de signalisation de l’hormone et réponses transcriptionnelles en aval a aiguisé au fil des ans. Toutefois, pour lier les diverses réponses cellulaires des voies de signalisation hormone avec les entrées réglementaires, mise en scène des distributions de l’hormone, nous exigeons une quantification spatio-temporelle des niveaux d’hormones à l’échelle cellulaire. Biocapteurs axée sur la frette qui peuvent détecter des phytohormones peuvent avancer la capacité des scientifiques à quantifier les niveaux d’hormones à l’échelle cellulaire. Biocapteurs axée sur la frette se composent d’une paire de frette (protéines fluorescentes donneur et accepteur) liée à un domaine sensoriel qui se lie à un ligand spécifique ou répond à un stimulus biologique. Pour les biocapteurs de petites molécules, liaison du ligand déclenche un changement conformationnel du domaine sensoriel qui se traduit par un changement de distance et/ou d’orientation entre les deux protéines fluorescentes de la paire de frette. Une analyse logométrique d’un biocapteur FRET s’effectue en excitant le donateur et le coefficient d’émission de la fluorescence de l’accepteur de mesure plus de donateurs^5,6. Liaison du ligand est détectable comme un changement dans cette émission ratio⁷.

Récemment, nous avons développé un biocapteur axée sur la frette pour l’hormone végétale GA. gaz sont une classe d’hormones qui peuvent favoriser la germination des graines, l’élongation cellulaire et la transition du développement de végétative aux phases de floraison. Le biocapteur nlsGPS1 est nucléaire localisé et fournit des aperçus spatio-temporelle de la dynamique de GA dans les tissus végétaux divers. Dans les cellules de l’Arabidopsis , GA se lie aux récepteurs solubles, indépendante de la gibbérelline nain (GID), et le complexe provoque la dégradation des protéines DELLA qui agissent comme des régulateurs négatifs du GA²de signalisation. Le domaine sensoriel GA de nlsGPS1 se compose du récepteur Arabidopsis GA (AtGID1C) lié à une troncature 74-amino acide d’une protéine DELLA (AtGAI) et une paire de frette consistant en amélioré des variantes de dimérisation de Cerulean comme la protéine fluorescente de donateurs et Aphrodite (Vénus sur une codon diversifiés) comme l’accepteur protéine fluorescente⁸. Le biocapteur de nlsGPS1 est un capteur de haute affinité pour le bioactive GA₄ (K_d = 24 nM pour GA₄) et il peut être utilisé dans divers types de tissus pour cartographier et quantifier des gradients de GA. Pour éviter une interprétation erronée des niveaux Arabidopsis GA in vivo, nous avons également développé une variante qui ne répondent pluse de nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) à utiliser comme contrôle négatif. La protéine nlsGPS1-NR porte dans la poche de GA-fixation des mutations qui perturbent la liaison du GA et mutations de la protéine DELLA qui perturbent l’interaction avec les récepteurs GID protéines^7,9. Modèles de rapport d’émission ou des changements observés chez les nlsGPS1 nlsGPS1-NR lignées et peuvent être considéré comme objets non directement liés aux événements de GA-liaison. Il est également important de noter que la liaison nlsGPS1 à GA₄ n’est pas rapidement réversible, et donc, les rapports d’émission nlsGPS1 cellulaire devraient être interprétés comme représentant la plus forte concentration récente de GA dans un noyau donné plutôt que le temps réel niveaux d’équilibre. En conséquence, une analyse de la baisse du niveau GA n’est pas possible avec nlsGPS1.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé d’utilisation d’un biocapteur nlsGPS1 dans les cellules de la plante modèle Arabidopsis, en utilisant des approches axées sur l’imagerie confocale à une haute résolution. Le protocole fournit des informations sur les racines des plantes d’imagerie et des hypocotyles tant à l’état stable au fil du temps-cours. Le capteur nlsGPS1 pourrait potentiellement être utilisé dans divers types de tissus, ainsi qu’entre les espèces de plantes, de cartographier et de quantifier les distributions de GA.

Protocole

1. les préparatifs

1. Préparez ½ milieu de Murashige et Skoog gélose pH 5,7 sans saccharose (1 L).
   1. Dissoudre 2,2 g de milieu de Murashige et Skoog (MS) à 950 mL d’eau ultrapure. Ajuster le pH à 5,7 avec 5 M KOH.
   2. Amener la solution à un volume final de 1 L avec de l’eau ultrapure. Divisez-la en deux bouteilles de 500 mL, chacune contenant des géloses plante de 1 %. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
2. Préparer ¼ MS liquide à pH 5,7 sans saccharose (1 L).
   1. Dissoudre 1,1 g de MS en 950 mL d’eau ultrapure. Ajuster le pH à 5,7 avec 5 M KOH. Amener la solution à un volume final de 1 L avec de l’eau ultrapure. Divisez-la en deux bouteilles de 500 mL. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
3. Préparer les GA₄.
   1. Dissoudre le GA₄ dans l’éthanol 70 % de faire une concentration finale de stock de₄ 100 mM GA.
   2. Pour préparer la solution de travail, diluer le stock de₄ GA à 0,1 – 1 µM dans MS ¼ liquide pH 5,7.

2. croissance de la plante

1. Stériliser les graines d’Arabidopsis .
   1. Travailler à l’aide d’une hotte chimique. Aliquotes graines (environ 200) dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL. Utiliser un marqueur à encre résistant au chlore et placer les tubes avec couvercles ouverts dans le récipient de stérilisation (une grosse boîte qui peut être scellé).
   2. Placer un bécher de 250 mL contenant 50 mL d’eau ultrapure et 50 mL de solution d’hypochlorite de sodium à l’intérieur du navire de stérilisation.
   3. Ajouter 3 mL d’acide chlorhydrique concentré (HCl) dans le bécher. Immédiatement, sceller le navire et permettent la stérilisation par le chlore gazeux pour 6 – 16 h.
   4. Après le descellement du navire, fermer les couvercles de tous les tubes de microcentrifuge dans le panier de la graine. Graines stérilisées peuvent être stockés à sec jusqu’au moment de l’ensemencement.
2. Semer environ 20 stérilisé Arabidopsis sur MS ½ géloses carrés. Sceller les plaques avec du ruban chirurgical poreux et les envelopper de papier d’aluminium. Incuber à 4 ° C pendant 1 à 3 jours pour la stratification.
3. Pour l’imagerie de la racine, transférer les plaques à la chambre de croissance à la verticale pendant 3 jours avec les conditions de croissance suivants : conditions de jours longs (LD, 16 h de lumière/8 h d’obscurité) ; µmol⋅m 120^-2s^-1 intensité de la lumière ; température de 22 ° C (pendant le cycle de lumière) ou 18 ° C (pendant le cycle foncé), 65 % d’humidité relative (HR).
4. Pour l’hypocotyle cultivés à l’obscurité : les plaques de transfert à la chambre de croissance pour une impulsion de lumière de 1 à 4 h pour synchroniser la germination. Enveloppez les plaques avec du papier aluminium et placez-les dans la chambre de croissance à la verticale pendant 3 jours.

3. préparation des échantillons

1. Mesures de l’état d’équilibre (Figure 1 a)
   1. Sur une lame de microscope propre, ajouter 50 µL de liquide MS ¼ (dorénavant appelée solution simulée). Doucement le transfert semis exprimant le nlsGPS1 de la plaque à la diapositive.
   2. Prendre un lamelle couvre-objet propre et apercevoir une goutte de graisse sous vide à chaque angle de la lamelle. Placez délicatement la lamelle sur les semis puis verser avec précaution supplémentaire simulacre solution pour enlever les bulles d’air.
2. Traitement₄ GA : expérience de l’échange chimique (Figure 1 b).
   1. Avant le traitement de₄ GA, utiliser une seringue de 20 mL, remplie de graisse sous vide (attaché à un embout de la pipette) pour dessiner un rectangle (longueur : 3,5 cm, hauteur : 2,5 cm) d’une couche uniforme de graisse sous vide sur une lame de verre propre (Figure 1 b). Pour permettre une ligne fine de graisse sous vide, l’embout de la pipette doit être coupé pour une ouverture de 1 mm de diamètre.
   2. Ajouter 50 µL de solution de simulation à la lame de verre. Avec une pince propre, choisissez les plants nlsGPS1 et placez-les délicatement sur la fausse solution. Pour prévenir tout dégât, transférer les semis en soutenant le dessous des cotylédons sans saisir le semis avec la pince.
   3. Prendre un lamelle couvre-objet propre et apercevoir une goutte de graisse sous vide à chaque angle de la lamelle. À l’aide de la pince, placer la lamelle au centre du rectangle vide de graisse. Maintenant, la lamelle est scellée sur les deux côtés correspondant aux bords du rectangle vide graisse longues.
   4. Ajouter avec précaution supplémentaire simulacre solution pour remplir le réservoir et enlever les bulles d’air dans le réservoir sans déranger les seedling(s) à l’intérieur.
   5. Acquérir les images avant le traitement de₄ GA à l’aide d’un microscope confocal. Suivez les instructions comme décrit dans la section 4 du présent protocole.
   6. Pour le traitement de₄ GA, retirer la lame de microscope confocale scène. Paramétrer une minuterie pour 20 min.
   7. Après le démarrage de la minuterie, échanger la solution tampon avec MS ¼ liquide contenant 1 µM GA₄. Ajouter la solution de₄ GA (environ 50 µL) du côté gauche de la lamelle et enlever l’ancienne solution (fictif) du côté droit. Garder en échange de la solution pour remplacer la solution fausse complètement, qui prend environ 10 min (Figure 1 b).
   8. Replacer la lame sur la platine du microscope. Attendre encore 10 min avant d’acquérir l’image d’après-GA.
3. Mise en place d’un cours à temps pour le tissu d’intérêt
   Remarque : Le tissu d’intérêt peut être, par exemple, hypocotyles ou des racines. Nous effectuons régulièrement des cours à temps pour l’imagerie nlsGPS1 biocapteur à l’aide d’un système de perfusion commerciale (Figure 1, voir la Table des matières) ou un RootChip^7,10,11.
   1. Ajouter 200 µL de solution de simulation au centre du chenal de la perfusion de la diapositive-collant (voir Table des matières). Doucement, pick nlsGPS1 semis et placez-les sur la solution simulée dans le collant-slide.
   2. Avec une pincette, doucement placer la lamelle de verre et, à l’aide de l’arrière de la pince, appuyez doucement sur les bords extérieurs de la lamelle afin qu’il forme un lien fort avec la matière collante sur la périphérie de la diapositive-collant.
   3. À l’aide de deux coudes Luer connecteurs (d’un diamètre interne [ID] de 0,8 mm) et le tube de silicone (avec un ID de 0,8 mm), connectez le collant-slide à une seringue de 20 mL et à un conteneur de sortie, recueillant la solution de sortie. Utilisez le connecteur Luer-lock (portant l’ID 0. 8 mm) pour connecter la seringue au tuyau de silicone.
   4. Poussez doucement la seringue contenant la solution simulée manuellement afin de laisser suffisamment de solution à passer par la chambre afin qu’il n’y a aucune bulle d’air dans la chambre. Placez et tenez la seringue sur le pousse-seringue programmable.
   5. Définissez les paramètres de la pompe spécifique à la seringue utilisée (c’est à dire., diamètre et volume) ainsi que le débit d’après le manuel fourni avec la pompe.
      Remarque : Dans le présent protocole, un débit de 1 à 3 mL/h a été utilisé, et ceci peut être changé selon les demandes expérimentales. Initier le décours temporel de démarrage de la pompe.
   6. Pour le traitement de₄ GA pendant un temps (Figure 1), arrêter la perfusion par une pause de la pompe et changer la seringue avec un nouveau contenant un liquide ¼ MS additionné de GA₄. Procéder avec imagerie confocale comme indiqué dans la section suivante.

4. microscopie

Remarque : Nous effectuons la microscopie confocal laser.

1. Acquérir des images à l’aide d’un microscope confocal équipé avec les lasers pour effectuer l’imagerie frette.
   Remarque : Pour nlsGPS1, variantes de la protéine fluorescente cyan (PCP) et de la protéine fluorescente jaune (YFP) sont imagés. Dans ce protocole, microscopes commerciales (voir Table des matières, répertorié comme microscope 1 et 2) sont utilisés avec 10 x ou 20 x sec 0,70 harmonique composé PLAN APO objectifs.
2. Pour microscope 1, utilisation 448 nm et 514 lasers de longueur d’onde nm pour exciter la PCP et YFP, respectivement. Acquérir les balayages séquentiels. Définir des détecteurs (par exemple, HyD SMD) pour détecter les 460 – 500 nm pour PCP (émission du donneur) et 525 – 560 nm pour YFP (frette d’émission) après l’excitation de PCP. En utilisant une deuxième séquence, définissez un détecteur pour détecter les 525 – 560 nm pour YFP (émission YFP) après l’excitation de la YFP.
   Remarque : Cette fluorescence YFP est utilisée comme un contrôle de l’expression, ainsi que dans la segmentation des noyaux, de générer des surfaces à l’aide d’une visualisation à balayage 3D commerciale et un logiciel d’analyse.
3. Pour microscope 2, utilisation de 440 nm et 514 nm longueur d’onde laser lignes exciter CFP et YFP, respectivement. Acquisition de deux pistes. Pour piste 1, définir des détecteurs (par exemple,., ChS) pour détecter les 464 – 500 nm pour PCP (émission du donneur) et 526 – 562 nm pour YFP (frette d’émission) après l’excitation de PCP. Pour la piste 2, poser un détecteur pour détecter 526 – 562 nm pour YFP (émission YFP) après l’excitation de la YFP.
   Remarque : Cette fluorescence YFP est utilisée comme un contrôle de l’expression, ainsi qu’en segmentant les noyaux, pour générer des surfaces dans le logiciel d’analyse et de visualisation 3D.
4. Acquisition d’images à l’aide d’un format de 512 x 512 pixels et une résolution de 12 bits.
5. Le gain doit être ajustée à une valeur déterminée empiriquement qui permet un bon signal lorsque ne pas saturer pixels. Le gain ne doit pas être changé entre CFP et frette sur leurs émissions au cours de l’expérience. Affectez le sténopé 1 unité aérée (UA). Placez le collant IBIDI slide au stade de la microscopie confocale et aller de l’avant avec l’imagerie comme précédemment indiqué.
6. Dans le logiciel de microscope 1, tandis que dans un balayage direct actif, utiliser briller dessus/dessous situé en haut à gauche de l’écran de l’image pour déterminer la sous-exposition et la saturation de la région d’intérêt. Dans le logiciel de microscope 2, utiliser Voyant situé sur le côté bas de l’écran de l’image afin de déterminer la sous-exposition et la saturation de la région d’intérêt. Pour toute analyse quantitative d’image, il ne devrait y avoir aucune saturation de pixel.
7. La valeur du z-piles avec une taille d’étape de 1 μm. La taille de palier peut être réduite pour une z-résolution accrue ou a augmenté pour une augmentation de la vitesse d’acquisition ou d’augmenter le nombre de postes/échantillons qui peut être photographiée. Au cours du temps automatisée, réglez l’heure ainsi que les z-piles (xyzt mode à partir de l’onglet mode d’acquisition) d’acquérir des images à des intervalles de temps.

5. image analyse à l’aide de Fidji

Remarque : À l’aide de ImageJ (Fidji) il est possible de traiter les données d’imagerie et de produire bidimensionnels (2D) images de la nlsGPS1 le coefficient d’émission dans les semis de l’Arabidopsis . Pour obtenir des exemples d’images, voir Figure 2 a, 2C, 2F, 2 Get 3 a. Dans ImageJ, il est possible de trouver chaque commande du présent protocole à l’aide de la fonction de recherche. Appuyez sur barre d’espace et L sur le clavier de l’ordinateur. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira ; Tapez la commande désirée dans le champ de recherche.

1. Faites glisser le fichier (les fichiers .lif ou .lsm) dans les îles Fidji (Image J) et ouvrez les images comme hyper-pile.
2. Dans le menu principal, sélectionnez Image > pile > projet Z et sélectionner des tranches de somme pour capturer tous les pixels, et non uniquement les pixels plus brillants comme projection Max.
3. Dans le menu principal, sélectionnez processus > arrière-plan Subtract et ensemble le rayon de roulement bille à 50 pixels. Désélectionner toutes les autres options et traiter toutes les images de trois. Cette étape supprime le fond à l’aide de l’algorithme « rolling ball ».
   Remarque : 50 pixels a été empiriquement déterminée afin d’inclure les noyaux comme de premier plan.
4. Dans le menu principal, sélectionnez Image > couleur > canaux de Split. Trois nouvelles fenêtres seront ouvre : C1-somme (canal CFP) ; C2-somme (Canal frette) et C3-somme (canal YFP).
5. Sélectionnez la fenêtre C3-somme et, dans le menu principal, sélectionnez processus > filtres > Flou gaussien et appliquez un flou gaussien de 1 afin de réduire le bruit de l’image.
6. Dans le menu principal, sélectionnez Image > réglage > Luminosité/contraste et sélectionnez auto.
7. Dans le menu principal, sélectionnez processus > améliorer le Contrasteet la set saturés = 0,35.
8. Dans le menu principal, sélectionnez Image > Type > 8-bit et convertir les piles en image 8 bits.
9. Dans le menu principal, sélectionnez Image > réglage > Seuil automatique-Local. Le Seuil d’Auto-Local, sélectionnez les paramètres suivants : méthode Phansalkar, rayon = 15, paramètres 1 = 0, 2 = 0et pile blanche. Dans cette étape, les cheminées YFP servent à fabriquer un masque binaire.
10. Sélectionnez la fenêtre C2-somme et, dans le menu principal, sélectionnez processus > filtres > Flou gaussien et appliquez un flou gaussien de 1.
11. Sélectionnez la fenêtre C1-somme et, dans le menu principal, sélectionnez processus > filtres > Flou gaussien et appliquez un flou gaussien de 1.
12. Pour créer la pile de ratio d’émissions des deux chaînes, dans le menu principal, sélectionnez processus > Calculateur de l’Image. Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, sélectionnez C2-somme comme image 1, sélectionnez diviser comme opérateur et sélectionnez somme C1 comme image 2.
13. Veillez à sélectionner créer une nouvelle fenêtre et le format de 32 bits. Une nouvelle fenêtre apparaîtra nommée Résultat de C2-somme.
14. Dans le menu principal, sélectionnez Image > table de choix > LUT 16_colors.
15. Dans le menu principal, sélectionnez processus > Calculateur de l’Image. Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, sélectionnez Résultat de C2-somme comme image 1, sélectionnez multiplier comme opérateur et sélectionnez Somme C3 comme image 2. Dans cette étape, le masque binaire YFP est multiplié avec la pile YFP/CFP pour ne montrer que des pixels présents dans le canal de commande YFP.
16. Dans le menu principal, sélectionnez processus > mathématiques > diviser et régler la valeur à 255. Dans la nouvelle fenêtre qui s’ouvre, sélectionnez Oui pour analyser toutes les images dans la pile. Une nouvelle image apparaît nommé Résultat du résultat de C2-somme.
17. Dans le menu principal, sélectionnez Image > réglage > Luminosité/contraste et sélectionnez automatique.
18. Dans le menu principal, sélectionnez processus > Renforcer contrasteet sélectionnez Type saturé = 0,35.
19. Dans le menu principal, sélectionnez Image > réglage > Luminosité/contrasteet les valeurs minimales et maximales définies pour capturer la distribution GA. Étape facultative : dans le menu principal, sélectionnez analyser > outils > Barre de Calibration et étalonnage LUT voir la barreet enregistrez le Résultat du résultat de C2-somme sous un fichier .tiff.
20. Pour obtenir les valeurs des émissions de rapports, dans le menu principal, sélectionnez analyser > mesure de la valeur et sélectionnez gris valeur moyenne et écart-type.
21. Sélectionnez la forme de rectangle dans la barre d’outils et tracez une zone d’intérêt (ROI). Dans le menu principal, sélectionnez analyser > mesure. Une nouvelle fenêtre fera rapport à la valeur moyenne de la ROI sélectionnée.
22. Copiez et collez les valeurs obtenues dans le logiciel de tableur (Excel ou OriginPro), puis effectuez un histogramme pour un traitement de₄ avant et après GA expérimenter ou un graphique linéaire pour une évolution temporelle expérimenter.

6. image Analysis, en utilisant le logiciel d’analyse et de visualisation 3D

Remarque : L’avantage d’utiliser le logiciel sélectionné (voir Table des matières) est de segmenter les objets (p. ex., les noyaux) et créer des images 3D d’une z-pile confocale. Pour obtenir des exemples d’images, voir Figure 2 b, 2D, 2F, 2 Het 3 b.

1. Ouvrez le logiciel et importer le fichier (les fichiers .lif ou .lsm).
2. Noyaux de segment basés sur le canal d’émission de YFP commande à l’aide de l' Assistant de Surfaces. Les objets segmentés sont qualifiées de « surfaces ». Cette étape de segmentation permet l’analyse de tous les voxels dans un noyau comme un objet tout en éliminant les fond de voxels en dehors du noyau.
3. Dans l' Assistant de Surfaces, définir la soustraction du fond (contraste local) à 3 µm et le seuil par défaut. Masquer les émissions de PCP (émission de donateurs d’excitation de donateurs [DxDm]) et les canaux d’émission (donneur excitation accepteur d’émission [DxAm]) de frette basé sur les surfaces créées à l’aide de lachaîne YFP d’émission (accepteur excitation accepteur d’émission [AxAm]).
4. Utilisez l’extension XT Ratio d’intensité moyenne pour calculer un ratio de donateurs excitation accepteur émission divisé par donneur excitation donneur émission (DxAm/DxDm) entre les valeurs d’intensité moyenne des surfaces individuelles dans les deux canaux.
   Remarque : Cette extension est disponible en ligne à télécharger.
5. Pour colorer les surfaces individuelles avec le coefficient d’émission de la nlsGPS1, sélectionnez codage avec des statistiques par couleur, qui est représenté par une icône de roue de couleur. Sélectionnez moyenne ratio d’intensité comme type de statistiques.
6. Exporter les rapports des valeurs individuelles de la table, qui se trouve sous l’icône de statistiques .
7. Copiez et collez les valeurs dans une feuille de calcul, puis effectuez un histogramme pour avant et après les expériences traitement GA₄ ou un graphe linéaire pour les temps de parcours des expériences.

7. analyse statistique

Remarque : Voir Figure 3D pour un tracé beeswarm en boîte des ratios d’émission nlsGPS1.

1. Ouvrez le logiciel et collez le facteur d’émission des surfaces noyaux comme colonnes de Y.
2. Sélectionnez les colonnes d’intérêt et sélectionnez statistiques > Statistiques Description > test de normalité de savoir si les échantillons sont distribués normalement. Exécutez le test de normalité et une nouvelle fenêtre s’ouvrira et communiquer les résultats.
3. Si les échantillons sont distribuées normalement, utilisez le t-test dans le test statistique. Sélectionnez statistiques > tests d’hypothèse > t-test à deux échantillons sur lignes et exécuter le t-test.
4. Si les échantillons ne sont pas normalement distribuées, sélectionnez statistiques > tests d’hypothèses statistiques > deux échantillons d’essai pour la variance de savoir si l’écart entre les échantillons n’est pas significativement différente.
5. Si l’écart n’est pas significativement différente, utilisez le test U de Mann-Whitney comme test statistique. Sélectionnez statistiques > Test non-paramétrique > test de Mann-Whitney et exécuter le test.
6. Si l’écart est sensiblement différente, servir de test de Kruskal Wallis ANOVA test statistique. Sélectionnez statistiques > Test non-paramétrique > test de Kruskal Wallis ANOVA et exécuter le test.

Résultats

À l’aide de nlsGPS1, il est possible de mesurer les concentrations de₄ GA cellulaires dans les tissus se prêtent à l’imagerie de fluorescence, y compris les radicelles et hypocotyles cultivés à l’obscurité (Figure 2). Dans la racine de l’Arabidopsis , le gradient de ratio nlsGPS1 d’émission est révélatrice de faibles niveaux de GA dans les zones méristématiques et division et des niveaux élevés de GA dans la zone d’élongation fin (Figure 2 a et 2 b). En revanche, un gradient de ratio d’émission n’a pas été observé dans les racines nlsGPS1-NR, suggérant que le gradient de GA endogène n’est pas un artefact (Figure 2 et 2D). Un gradient de ratio d’émissions nlsGPS1 a été également formé en hypocotyles cultivés à l’obscurité, avec faibles concentrations dans les cotylédons et le crochet apical et des niveaux élevés dans la région basale rapidement en élongation de l’hypocotyle (Figure 2E et 2F). En revanche, un gradient de ratio d’émission n’a pas été observé dans les hypocotyls nlsGPS1-NR (Figure 2 et 2 H). Dans les racines d’Arabidopsis et les cellules de l’hypocotyle cultivés à l’obscurité, l’accumulation GA endogène corrélée avec le taux d’élongation cellulaire.

En outre, exogène GA₄ accumule préférentiellement dans la zone d’élongation par rapport à la zone de la division de la racine de l’Arabidopsis (Figure 3), indiquant que nlsGPS1 peut être utilisée pour étudier les GA endogène et exogène le Patterning.

Au cours d’expériences de cours de temps, nlsGPS1 semis ont été placés dans des chambres de collant-slide et perfusé avec MS ¼ liquide, suivi d’un traitement avec 0,1 µM GA₄ pendant 30 min. La vidéo montre une accumulation plus rapide de l’exogène GA₄ dans la zone d’élongation racinaire par rapport à la zone de division (vidéo 1).

Figure 1 : préparation d’échantillons vue imagerie confocale. Ces panneaux montrent une représentation schématique de la préparation des échantillons pour (A) une expérience de l’équilibre, (B) avant et après traitements exogènes de GA₄ et (C) une expérience de cours de temps de traitement à l’aide post-it-slides (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Le gradient de GA dans Arabidopsis roots et cultivés à l’obscurité des hypocotyles. Des images bidimensionnelles de nlsGPS1 (A) et (C) nlsGPS1-NR racines ont été analysées à l’aide de logiciels ImageJ, et des images en trois dimensions de nlsGPS1 (B) et (D) nlsGPS1-NR ont été analysées à l’aide d’un film publicitaire en trois dimensions logiciel d’analyse image. Les deux analyses ont montré une endogène GA₄ dégradé dans des racines d’Arabidopsis . Des images bidimensionnelles de nlsGPS1 (E) et l’hypocotyle d’obscurité nlsGPS1-NR (G) ont été analysées à l’aide de logiciels ImageJ, et des images en trois dimensions de nlsGPS1 (F) et (H) nlsGPS1-NR ont été analysées à l’aide de la logiciel d’analyse commerciale image en trois dimensions. Les deux analyses ont montré une endogène GA₄ dégradé dans hypocotyles cultivés à l’obscurité. La barre LUT affiche la fausse coloration des ratios d’émission nlsGPS1. Images de la YFP sont signalés comme options pour expressions. Images de l’hypocotyle ont été acquises à l’aide de deux positions de la scène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : le gradient de GA exogène dans les racines. Le premier spectacle de deux panneaux (A) à deux dimensions et (B) des images en trois dimensions d’une racine nlsGPS1 avant et 20 min après le traitement exogène GA₄ (1 µM). Images de la YFP sont signalés comme options pour expressions. Les deux derniers panneaux montrent (C), la moyenne et écart-type et (D) beeswarm et boîte emplacement des ratios des émissions nlsGPS1 pour les noyaux de la zone d’élongation (la région qui est définie avec un cadre blanc). Dans la zone d’élongation, le facteur d’émission de nlsGPS1 était significativement plus élevé après le traitement₄ GA (test U de Mann-Whitney, *** P-valeur < 0,0001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : expérience de Perfusion de nlsGPS1 racine à l’aide de post-it-slide. Cette vidéo montre des images en trois dimensions de nlsGPS1 perfusés avec MS ¼ liquide et traités avec 0,1 µM GA₄ pendant 30 min. Dans le cours du temps, l’imagerie a acquis toutes les 10 min pendant 3 h avec les intervalles suivants : 30 min de solution simulée (cadre t = 1, t = 2, t = 3), 30 min de traitement₄ GA (cadre t = 4, t = 5, t = 6), 2 h de mock afin lution (cadre t = 7 à t = 18) solution. Avant l’acquisition, l’échantillon a été perfusé avec fausse solution pendant 2 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

Le nlsGPS1 de biocapteur axée sur la frette GA fournit une méthode quantitative pour signaler et de mesurer les gradients hormone GA plantes multicellulaires. Axée sur la frette biocapteurs peuvent de quantifier la dynamique avec une meilleure résolution spatio-temporelle sur détection directe par spectrométrie de masse et une mesure indirecte de transcriptional reporters ou signalisation-protéine-dégradation-méthodes basées sur les^{12, 13}. Une imagerie cellulaire dans divers types de tissus peut donner un aperçu significatif de GA biologie et étincelle de nouvelles hypothèses concernant la régulation et la fonction des accumulations de GA dans un contexte multicellulaire. Par exemple, suivre les changements dans le biocapteur nlsGPS1 GA spécifique biosynthétique, catabolique et des mutants de transport, ainsi que durant les perturbations induites spatio-temporelle, peut être très instructif pour tester plus précisément comment les gradients de GA sont établies en la racine et les racines de l’adresse de cellule réponses aux gradients de GA. Le capteur peut être utilisé chez d’autres espèces de modèle et de la culture pour tester la conservation des mécanismes qui régissent le contrôle médiée par les GA de la germination des graines, l’élongation cellulaire et la floraison.

Les étapes critiques de l’imagerie axée sur la frette du biocapteur nlsGPS1 sont que 1) les pixels ne devraient pas être saturés lors de l’analyse quantitative de la frette, 2) imageries paramètres comme « détecteur gain » doivent être maintenus constantes pour l’émission du donneur (DxDm) et les acquisitions d’accepteur d’émission (DxAm), les 3) lignes de nlsGPS1-NR de contrôle doivent être utilisés pour exclure des artefacts et 4) échantillons devraient être prêts à réduire au minimum la dérive et les questions de changement de focale. En outre, les conditions environnementales dans lesquelles sont cultivés les échantillons sont importantes contrôler les niveaux de GA étant sensibles aux conditions environnementales telles que l’autonomie et de l’intensité lumineuse^{14,15,16 ,17}. Une clé de la limitation de ce type d’analyse est qu’il faut pour l’imagerie en raison de l’augmentation du bruit inhérent à l’imagerie ratiométrique un rapport signal sur bruit élevé. Ainsi, l’imagerie nlsGPS1 ne sera pas utile pour les tissus et les organes qui ne se prêtent pas à la microscopie de fluorescence de ratiométrique utilisant des protéines fluorescentes cyan et jaunes — par exemple, les tissus plus profonds où les protéines fluorescentes sont mal détectés. En revanche, ratiométrique lectures sont souvent préférées sur intensiometric lectures, parce qu’un contrôle interne est utile pour éliminer les artefacts découlant des changements dans l’expression de biocapteur, stabilité, luminosité ou la détectabilité dans une cellule donnée, tissu , ou d’une condition. Par exemple, vous inquiétez pas l’imagerie biocapteur et analyses de l’image ont également été utilisés pour étudier une variété de ligands dans une variété de tissus^{5,6,18,19,20,}. Des expériences d’imagerie et des analyses d’image rapportés ici sont modifiables en fonction de nouvelles méthodes d’imagerie, telles que la microscopie de nappe de lumière, qui pourrait donner des idées nouvelles dans, par exemple, plus profonde racine-types de tissus.

Le biocapteur de première génération nlsGPS1 est un capteur de haute affinité qui fournit une carte à haute résolution des gradients de GA qui peut également signaler une augmentation intracellulaire GA suite à des traitements de GA exogènes. Une des limitations actuelles de nlsGPS1 est que le capteur n’est pas rapidement réversible et, ainsi, rapporte pas sur les niveaux de GA stationnaire mais, probablement, sur la concentration dans la solution GA récente maximale d’intérêt. Le taux de rotation précis pour le capteur est également pas connu et ceci, combiné avec faible réversibilité, s’oppose à une détection des déplétions de GA endogènes qui pourrait se produire dans une minutes à un peu d’heures dans certains types de tissus. Il est également important de noter que nlsGPS1 a une forte affinité pour GA₄ (K_d = 24 nM) par rapport à d’autres formes de GA (GA₃ K_d= 240 nM, GA₁K_d = 110 nM) lorsque l’imagerie autre gaz bioactive ⁷. les générations futures des biocapteurs GA peuvent être conçues pour augmenter la réversibilité tout en conservant une affinité élevée ou présentent des spécificités différentes pour les différents précurseurs, bioactive, ou catabolite gaz. 

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107735
Gibberellin A4 (GA4)	Sigma	G7276	dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach)	Fisher S/5040	HSRA 064
Hydrogen cloride HCl	Sigma	31434
Micropore tape	3M	1530-1
ibidi sticky-slide	Ibidi	81128	Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide	Ibidi	80168	Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides	Ibidi	10812
Elbow Luer Connectors	Ibidi	10802
silicone tubing	Ibidi	108401
Luer Lock Connector	Ibidi	10826
programmable syringe pump	World Precision Instruments	AL-1000
Vacuum grease	Sigma	18405
Murashige and Skoog Basal Salts	Duchefa	M0221
Agar plant, 1 kg	Melford	P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick	Fisher Scientific	12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm	Fisher Scientific	12363138
Luer-slip Syringe 20 mL	Fisher Scientific	10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape	Fisher Scientific	12787597
Potassium Hydroxide, 500 g	Sigma Aldrich	221473-500G-D
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel	Scientific Laboratory Supplies	INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel	Fisher Scientific	12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6	Ibidi	10829
Leica SP8			Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780			Confocal laser microscope 2
Imaris	Bitplane		3D visualization and Analysis software
Fiji			image analysis software
OriginPro	Origin Lab		Statistical Analysis Software