Création de l’anastomose du côlon chez la souris

Résumé

Une fuite anastomotique ou une panne après la chirurgie est une cause majeure de mortalité et de morbidité postopératoire. Notre intervention chirurgicale pour la création d’une anastomose du côlon est une méthode fiable et reproductible pour étudier les mécanismes de guérison des anastomoses.

Résumé

Anastomoses intestinales sont couramment effectués en opérations électifs et émergentes. Malgré cela, les fuites anastomotiques sont un très redouté complications de la chirurgie du côlon et peuvent se produire chez 26 % des anastomoses chirurgicales, avec mortalité étant jusqu'à 39 % pour les patients ayant une telle fuite. Actuellement, il subsiste un manque de données décrivant les mécanismes cellulaires de cicatrisation anastomotique. Concevoir des stratégies de prévention et les modalités de traitement de fuite anastomotique pourrait être grandement potentialisée par une meilleure compréhension de la guérison anastomotique approprié.

Un modèle murin est idéal car des études antérieures ont montré que l’anastomose murin est plus cliniquement similaire à l’affaire humaine par rapport aux autres modèles animaux. Nous offrons un modèle murin facilement reproductible d’anastomose colique chez les souris qui permettra à titre d’illustration supplémentaire de guérison anastomotique.

Introduction

Une complication très redoutée de l’anastomose chirurgicale de l’intestin est rupture anastomotique ou une fuite. Fuite anastomotique, qui provoque le déversement du contenu intraluminal dans la cavité abdominale, est mortelle et peut rapidement conduire à une septicémie intra-abdominale ; choc les taux varient de 0,3 % à 5,5 %, suite à l’intestin grêle des anastomoses et relever entre 0,5 % et 26 % pour les anastomoses colique^1,2. Les taux de mortalité suite à fuites peuvent être aussi élevés que 39 % en raison de l’apparition rapide d’une septicémie et une progression rapide à mort suite à une contamination intraabdominale³. Les stratégies de prévention et les modalités de traitement sont actuellement fondées sur la physiopathologie qui n’est pas entièrement comprise.

Actuellement, cicatrisation anastomotique est souvent comparée à la guérison des plaies cutanées plus largement étudiée, qui se révèle pour être un fac-similé relativement pauvre. La guérison se produit dans une série de phases qui se chevauchent, commençant par la phase de latence initial. Pendant les jours 0-4 après la création de l’anastomose intestinale, la phase de latence est définie par une réaction inflammatoire aiguë qui efface la plaie des débris cellulaires. Ensuite, au cours des jours 3 et 4, prolifération fibroblastique et la production de collagène est typique de la phase de fibrophasia. Enfin, après jour 10, une période prolongée de remodelage du collagène est connue comme la phase de maturation. Il est important de noter que force anastomotique est assez faible et dépend du soutien extrinsèque d’agrafes placées chirurgicalement ou suture jusqu'à ce que le collagène est déposé⁴. Comprendre le rôle et le calendrier chaque couche de la paroi de l’intestin joue dans la cicatrisation anastomotique et l’implication dans des types de cellules inflammatoires médiée par telles que les macrophages, ainsi que des marqueurs de substitution élucider pour prédire l’échec anastomotique ou réussite pourrait réduire considérablement les dépenses de santé suite à deux points des opérations⁵, la mortalité et la morbidité.

Le modèle murin a démontré dans des études antérieures l’utile en imitant l’anastomose humaine⁶. Bien qu’il existe des exemples populaires, éprouvées et bien étudiées du modèle murin anastomotique colique, en particulier la méthode décrite par Komen et al. ⁷, ces modèles favorisent ILÉO-caecale ou ascendant anastomotique techniques de colocolonic⁸. Des études antérieures des patients humains ont démontré une différence significative dans les taux de fuite entre ILÉO-caecale, les colocolonic et les anastomoses colorectal, soulignant la nécessité d’autres modèles expérimentaux à différents endroits anatomiques. Méthodes supplémentaires, populairement utilisés visent à développer un modèle qui crée intentionnellement une fuite anastomotique plutôt que d’élucider les mécanismes cellulaires nécessaires à la normale⁹de cicatrisation anastomotique. Les modèles de rat ont été tentées dans le passé mais ont des taux de déhiscence anastomotique et/ou des signes de fuite (c'est-à-dire la formation d’abcès) significativement plus faible que les humains et les souris^6,7. En outre, les lignées expérimentales plus génétiquement modifiées sont disponibles chez la souris que les rats. Cela rend le modèle de rat moins utiles pour un modèle anastomotique. En outre, modèles canins et porcines ont eu des investigations cliniques moins que le modèle murin^6,7.

Nous proposons une procédure sûre, techniquement simple et reproductible facilement et rapidement pour la création des anastomoses coliques dans un modèle murin qui devrait faciliter l’enquête plus approfondie sur le mécanisme sous-déclarés de guérison des plaies anastomotique¹⁰ .

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Protocole

Le protocole suivant a été approuvé par l’University of Oklahoma Health Sciences Center institutionnels soins aux animaux et le Comité utiliser (IACUC) et est conforme à toutes les directives éthiques institutionnelles relatives à l’utilisation des animaux de recherche. En outre, toutes les expériences ont été effectuées conformément à la réglementation institutionnelle, étatique et fédérale concernant les recherches expérimentales sur les animaux.

Remarque : Pour ce protocole, nous avons utilisé congéniques mâles et femelles de race des souris C57BL6/J à l’âge de 12 à 72 semaines. Toutes les souris utilisées pour cette procédure sont restés dans notre établissement sans barrière pendant au moins une semaine avant l’opération pour s’adapter à ce biome local. Animaux était autorisés à nourrir au moment de l’opération et nous avons utilisé la préparation intestinale mécanique oral ni rinçage rectale avant la procédure.

1) création d’Anastomoses

1. Stériliser les instruments chirurgicaux, chauffer la solution d’irrigation saline et bien nettoyer toutes les surfaces du dispositif avec l’éthanol à 70 %.
2. Pour induire l’anesthésie, placez votre souris dans une boîte d’induction qui est connectée à un vaporisateur. Livrer l’isoflurane 2-3 % à 1-2 L/min jusqu'à ce que les souris sont sous sédation.
3. Placez l’animal sur un dispositif de réchauffement, comme un coussin chauffant, pour éviter l’hypothermie.
4. Injecter par voie sous-cutanée une dose de temps de la buprénorphine (3 µg pour une souris de 30 g) de 0,1 mg/kg pour l’analgésie postopératoire et une une fois dose de 10 mg/kg d’enrofloxacine pour antibioprophylaxie préopératoire.
   NOTE : Si les antibiotiques préalables- et postopératoires ne sont pas requises pour cette opération, directives institutionnelles et l’animal soin et utilisent comité dans notre Etablissement recommandé leur utilisation dans notre établissement.
5. Placez le cône de nez anesthésique autour du museau de la souris. Tout au long de l’opération, soigneusement surveiller la fréquence respiratoire de l’animal et ajustez le débit anesthésique selon vos besoins. Maintenir un rythme respiratoire à 30-40 respirations / minute.
6. Utiliser une tondeuse à cheveux suivie d’un agent dépilatoire pour enlever les poils de la surface entière de la peau de l’abdomen. Complètement éliminer l’agent dépilatoire avec de la gaze imbibé d’eau, soit 70 % de l’éthanol. Soigneusement sécher l’animal.
7. Avant de préparer l’abdomen, bande des membres de la souris sur le coussin chauffant ou une surface du dispositif à la fin de chaque jambe pour empêcher la souris de se déplacer pendant la chirurgie. Désinfecter l’abdomen à la chlorhexidine. Inclure toute la zone rasée ainsi que les poils sur les bords de la zone rasée. Placez un drap stérile sur la souris (Figure 1 a).
   1. Avant drapé, coupez une petite fenêtre de forme ovoïde ou rectangulaire en drapé d’exposer l’abdomen préparée.
      NOTE : La fenêtre doit exposer l’abdomen entier de la souris mais couvrent les branches, la queue, la tête et le thorax. Nous avons coupé une fenêtre de² 4 x 3 cm pour nos opérations (Figure 1 b).
   2. Faire une petite fente le long de la ligne médiane à drapé du bord inférieur vers la fenêtre de forme ovoïde ou rectangulaire, pour permettre l’accès au rectum pendant la procédure (Figure 1).
8. Faire une incision de la peau. Commencer le long de la ligne médiane de l’abdomen inférieur et inciser la peau avec des ciseaux verticalement à la xiphoïde. Inciser seulement la peau et éviter de couper la musculature de la paroi abdominale (Figure 2 a).
9. Saisir la ligne médiane de la paroi abdominale avec une pince et lever loin le contenu abdominal. En prenant soin de ne pas blesser les structures intraabdominale, inciser la longueur de l’aponévrose abdominale médiane verticalement avec des ciseaux pointus. Augmenter la longueur de l’incision cutanée (Figure 2 b).
10. Lorsque les intestins sont exposés, localisez le caecum et l’intestin grêle et faire pivoter les viscères côté gauche médialement pour exposer le descendant et le côlon sigmoïde. Enduire l’extrémité de la sonde mousse lubrifiante gelée et avancer avec précaution la sonde dans le rectum afin de faciliter l’identification du côlon sigmoïde/décroissant (Figure 3).
    Remarque : Contrairement aux êtres humains, le caecum de souris se trouve généralement dans le quadrant supérieur gauche de l’abdomen. Prendre soin de ne pas pour perforer la paroi intestinale avec la sonde dans cette étape. Si la paroi intestinale est perforée, mettre fin à la procédure et euthanasier la souris.
    1. Évitez de saisir le caecum avec une pince crantée ou tranchants. Au lieu de cela utiliser pince atraumatique, coton applicateur à pointe, ou manipulation douce doigt pour faire pivoter les viscères.
    2. Utilisation réchauffé du sérum physiologique stérile pour s’assurer que l’exposé de l’intestin est maintenu humide tout au long de la procédure.
    3. Le colon sera sur la gauche de la ligne médiane et attaché à la rétropéritoine via le mésentère. Après identification, retirer la sonde émoussée partiellement pour faciliter colotomy.
11. Effectuer des colotomy transversal du côlon sigmoïde.
    1. Saisir délicatement le côlon sigmoïde supérieur à l’entrée du bassin avec une pince atraumatique (Figure 4 a).
    2. À l’aide de micro-ciseaux pointus, de pratiquer une coupe perpendiculaire à la direction du côlon et s’étendant sur 80 à 90 % de la largeur du côlon à travers le côlon sigmoïde. Cela aidera à empêcher le retrait d’une des extrémités du côlon hors du champ opératoire et de faciliter la réparation (Figure 4 b).
    3. Si un vaisseau sanguin mésentérique est blessé au cours de la rotation viscérale ou colotomy, maintient doucement la pression jusqu'à 2 min avec une gaze ou un coton-tige. Si le saignement persiste après ce temps, placer une figure de huit suture de monofilament de 8-0 autour du point de saignement.
       Remarque : Si l’intestin montre des signes de nécrose ou de blessure après cela, mettre fin à la procédure et euthanasier la souris à l’aide de méthodes humaines approuvé par votre comité institutionnel utilisation des animaux.
12. Réparer le colotomy sigmoïde.
    1. Un pousseur d’aiguille de Castroviejo, placer 5-6 interrompu simple de 8-0 non résorbables polypropylène points pour réparer la colostomie. Placer des sutures 1 mm indépendamment de l’autre avec les piqûres de 0,5 mm.
       1. Veiller à ne pas rouler les bords de l’intestin dans la réparation, en prenant un peu plus séreuse que muqueuse avec chaque point. Laisser les queues de 5 mm de long. Attention de ne pas accidentellement l’intestin environnants prises dans la suture (Figure 4).
          Remarque : Il est utile de commencer la suture à la frontière mésentérique de le colotomy, sauver la partie anti-mesenteric-la plupart de la colotomy pour la fin.
       2. Lorsque la réparation progresse, sonde à pointe blunt dissection avance le trans-anal pour enjamber la réparation avant les finales sutures sont placées. Cela aidera à prévenir trop étroite une réparation et diminuer les taux de sténose anastomotique.
13. À l’aide d’une seringue de 10 mL remplie de solution saline chauffée, irriguer l’abdomen plusieurs fois. Si la surface sous la souris devient trempée, sécher la souris ou déplacez la souris sur une surface sèche afin d’éviter l’hypothermie.
    1. Utiliser une gaze stérile placée sur l’incision pour absorber les excès d’irrigation.
    2. À l’irrigation finale, remplir l’abdomen avec du sérum physiologique stérile. Soigneusement avancer un cathéter de 18 G lubrifié dans le rectum et gonfler avec 0,5-1 cm³ d’air. Cela démontrera toutes les fuites à l’anastomose que peuvent être réparés avec un autre interrompu suture en polypropylène à l’aide de la sonde stérile pour enjamber l’anastomose.
    3. Dégonfler le côlon à l’aide du cathéter avant l’enlèvement.
14. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement actif. S’il y a, appliquez une légère pression directement sur le point de saignement pour sutures hémostatiques de 1-2 min. Place comme décrit ci-dessus, si le saignement persiste.
15. Retourner délicatement les viscères medialized en position anatomique normale (Figure 5 a).
16. Refermer l’incision abdominale (Figure 5 b).
    1. 4-0 les sutures résorbables tressées, placer une suture en cours d’exécution le long de la couche musculaire de la paroi abdominale, commençant par le haut de l’incision et la finition à l’aspect inférieur de l’incision. Installez une cravate et coupez la suture en laissant les queues de 5 mm.
       Remarque : N’intègrent pas accidentellement l’intestin dans la fermeture de la paroi abdominale.
    2. Répéter l’opération avec suture de monofilament de 4-0 pour fermer la peau (Figure 5).
17. S’assurer que l’animal entier est chaud et sec, pour éviter l’hypothermie postopératoire.
18. Surveiller attentivement l’animal car il récupère de l’anesthésie. Administrer buprénorphine 0,1 mg/kg toutes les 72 h pendant 2-3 jours après l’intervention pour le contrôle de la douleur.  Au cours de la période de récupération, souris devraient être soigneusement examinées chaque jour des signes d’abcès ou de septicémie péritonéale.  Observation post-opératoire pour la douleur et de détresse devrait inclure : restriction de circulation y compris arrondir type de posture, manque de manger ou boire, pas bon toilettage, inflammation excessive autour de plaie, absence de guérison normale sur le site d’incision, ou imbrication de pas normale.  Tout animal montrant un de ces comportements doit immédiatement être euthanasié par CO₂ asphyxie pendant un minimum de 10 min, suivie d’une thoracotomie bilatérale.
19. Mélanger 0,1 mg/mL d’enrofloxacine avec de l’eau potable de la souris sur les 7 jours suivant la chirurgie pour prévenir l’infection intra-abdominale ou septicémie due à la contamination fécale associée à l’opération.

2) récolte tissu anastomotique

1. Juste avant l’excision des tissus anastomotique, euthanasier la souris à l’aide d’une méthode humaine, approuvée par le Comité institutionnel utilisation des animaux.
   NOTE : Basé sur la politique institutionnelle, nous euthanasier les animaux en les plaçant dans une chambre de dioxyde de carbone avec infusion de gaz de dioxyde de carbone de 100 % à 2 L/min pendant 5 min avant d’effectuer la thoracotomie bilatérale.
2. Stériliser l’abdomen à la chlorhéxidine suivie d’éthanol à 70 %.
3. Re-inciser l’incision médiane original avec des ciseaux pointus. Commencez au pôle inférieur de l’incision précédente et étendre cette coupe supérieurement à la xiphoïde (Figure 6 a).
4. À l’aide de ciseaux, couper dans la couche musculaire et après être entré dans l’espace péritonéal, étendre la coupe vers le haut et le bas de l’incision. Veiller à ne pas blesser l’intestin en entrant dans l’abdomen ou l’interruption de l’anastomose, tel qu’il peut y avoir l’intestin ont adhéré à l’incision ou le site anastomotique.
5. Avec précaution, effectuez une rotation médiale viscérale gauche, exposant la réparé le côlon sigmoïde (Figure 6 b). Il y aura probablement des adhérences intestinales de l’intestin qui entourent la réparation. Doucement et sans ambages disséquer ces adhérences loin du lieu de réparation. Prenez grand soin de ne pas perturber l’anastomose.
   1. Identifier le site de réparation en localisant les queues de la suture en polypropylène utilisée pour la réparation. À l’aide de ciseaux et à partir de 1 cm de proximale à la réparation, transect transversalement à travers le côlon descendant. Répétez cette étape 1 cm distal au site de l’anastomose.
6. Retirer le segment sigmoïde en disséquant brusquement le côlon du mésentère attaché le long de la frontière postérieure du côlon avec des ciseaux fins (Figure 7).
7. Identifier la frontière mésentérique du spécimen du côlon et utiliser des ciseaux pour couper le long de la frontière mésentérique de manière longitudinale. Cela créera une section carrée ou rectangulaire du côlon par l’échantillon cylindrique précédemment retiré (Figure 8).
8. Utilisez un marqueur pour délimiter la frontière anti-mésentérique du côlon avant d’ôter le segment du côlon. Après l’enlèvement, faites une coupe longitudinale le long du côlon en face de la marque. Difficulté, intégrer et couper le tissu échantillon au besoin pour histologie et/ou immunostaining.

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Résultats

À 7 jours suivant la chirurgie, l’anastomose doit être bien guérie. L’anastomose peut être récoltée à points dans le temps avant et après que sept jours afin de mieux illustrer les étapes de la cicatrisation anastomotique. Dans la Figure 9, l’analyse histologique montre un fibreux (collagène visualisé par coloration trichrome) réponse médiée par les myofibroblastes positif d’alpha-actine muscle lisse. Cependant, nous avons constaté que ...

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Discussion

Il y a plusieurs étapes clés pour assurer le succès d’et de réduire la morbidité/mortalité liée à cette procédure. Tout d’abord, assurer la manipulation soigneuse de tissu intestinal et éviter que les blessures de traction lors de la rotation des viscères pour exposer le côlon. Une tension excessive sur les fonctions des intestins ou mésentère peut dommage la nécrose intestinale de l’intestin ou le système vasculaire et cause loin du lieu de l’anastomose. En outre, les pince forte ou une pince à ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H