Extraction et analyse des taïwanaise Propolis verte

Résumé

Nous présentons un protocole pour l’utilisation de l’éthanol comme solvant d’extraire et de caractériser la propolis verte taïwanaise qui présente une activité antibactérienne.

Résumé

Taïwanaise propolis verte est riche en flavonoïdes prénylés et présente un large éventail d’activités biologiques, comme antioxydant, antibactérien et les anticancéreux. Les composés bioactifs de propolis verte taïwanaise sont propolins, à savoir C, D, F et G. La concentration de propolins dans la propolis verte taïwanaise varie selon la saison et la localisation géographique. Ainsi, il est essentiel d’établir une procédure standard et reproductible pour la détermination de la qualité de la propolis verte taïwanaise. Nous présentons ici un protocole qui utilise l’extraction à base d’éthanol, chromatographie liquide à haute performance et une analyse de l’activité antibactérienne pour caractériser la qualité de la propolis verte taïwanais. Cette méthode indique que 95 % et 99,5 % des extractions de l’éthanol atteignent les rendements en matière sèche maximale de la propolis verte taïwanaise, réduisant ainsi aux plus fortes concentrations de propolins qui ont des propriétés antibactériennes. Selon ces résultats, le présent protocole est réputé fiable et reproductible pour la détermination de la qualité de la propolis verte taïwanaise.

Introduction

La propolis est un mélange de résineux naturel produit par l’espèce d’abeille Apis mellifera. La propolis a été largement utilisée depuis l’antiquité en médecine folklorique. Une étude a récemment rapporté que la propolis est bénéfique pour prévenir les infections microbiennes et inflammation¹. De nombreuses études ont démontré que les principaux composés bioactifs dans la propolis sont des flavonoïdes, des esters de l’acide phénoliques, prénylés p-coumarique acides et diterpenic acides^2,3. A ce jour, 10 dérivés de flavanone prénylés de propolis verte taïwanaise ont été identifiés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)^4,5,6,7. Les plus abondantes parmi ceux-ci sont propolins C, D, F et G^5,7. Les effets biologiques considérables de propolis verte taïwanaise sont corrélés avec sa haute teneur de propolins⁸.

Les concentrations de composés bioactifs dans la propolis varient considérablement selon la saison et l’emplacement géographique d'où provient la propolis. La propolis européenne contient essentiellement des flavonoïdes aglycone et phénoliques acides⁹. Les principaux composés bioactifs dans la propolis du Brésil sont prénylés p-coumarique acides, tels qu’artepillin C¹⁰. Une étude a démontré que la saison est un facteur essentiel pour déterminer la teneur totale propolin taïwanais propolis verte¹¹. Le contenu de propolin en taïwanais propolis verte est plus élevé en été (mai - juillet) et plus faible en hiver¹¹. La propriété antibactérienne de la propolis a été considérée comme un indicateur de l’activité biologique. En général, les échantillons de la propolis provenant de diverses régions ont manifesté une propriété antibactérienne similaire ; par exemple, il est généralement efficace contre presque toutes les bactéries gram-positives et présente un effet antibactérien limité contre les bactéries gram-négatives^10,12,13. Ont démontré que des interactions synergiques entre les flavonoïdes contenus dans la propolis ont un effet antibactérien¹⁴. De même, la propolis verte taïwanaise aurait ont un effet antimicrobien contre les bactéries gram-positives,¹⁵. En outre, une étude a également un effet antimicrobien de l’interaction de propolins en taïwanais propolis verte⁸.

La caractérisation des composés bioactifs dans la propolis est difficile parce que sa composition chimique peut varier selon sa source d’origine. Par conséquent, il est nécessaire d’établir une méthode faisable et reproductible pour la détermination de la qualité de la propolis verte taïwanaise. Cependant, aucune procédure standard n’a été établi pour l’extraction de la propolis verte taïwanais et analyse fonctionnelle. Plusieurs méthodes s’appliquant indifféremment des solvants organiques et inorganiques ont été proposées pour la propolis extraction^{16,17,18,19,20}. Parce que la propolis est un mélange lipophile, les études ont démontré que l’extraction organique est mieux qu’extraction inorganiques^8,18,19. La concentration totale propolin taïwanaise propolis verte et ses propriétés antibactériennes sont des indicateurs clés de la qualité de la propolis verte taïwanaise. Ainsi, le but de cette étude est de présenter un protocole pour l’utilisation d’éthanol comme solvant d’extraire et de caractériser les propriétés antibactériennes de propolis verte taïwanaise.

Protocole

1. préparation de l’extrait l’éthanol composés

1. Peser 10 g de gelée propolis verte taïwanaise, qui ont été recueillie des ruches à Taïwan de mai à juillet, et les broyer à l’aide du moulin à épices. Confirmer qu’entiers morceaux de propolis verte taïwanaise est broyés en une fine poudre sans les particules volumineuses.
2. Ajouter 100 mL de diverses concentrations d’éthanol (60 %, 70 %, 80 %, 95 % et 99,5 %) et de l’eau pour séparer les flacons et mélanger chaque concentration avec 10 g de la propolis au sol.
3. Incuber à 25 ° C et agiter la fiole à 250 tr/min pendant 48 h.
4. Filtrer les extraits à l’éthanol sur papier filtre avec une taille de pore de 25 μm.
5. Reconstituer les filtrats de leur volume original (100 mL) avec de l’éthanol 95 % en utilisant un ballon jaugé.
6. Magasin que l’éthanol extrait à-20 ° C.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

2. préparation des extraits à l’éthanol pour HPLC

1. Concentré de 10 mL d’éthanol extraits par évaporation sous vide à 40 ° C pendant 15 min.
2. Cuire au four de la matière sèche à 45 ° C pendant 24 h.
3. Reconstituer la matière sèche avec 10 mL d’éthanol à 95 %.
4. Filtre 1 mL d’éthanol extrait à l’aide d’un filtre de seringue stérile avec une taille de pores de 0,45 µm.
5. Refiltrer les extraits à l’éthanol en utilisant un filtre de seringue stérile avec une porosité de 0,22 µm. Le filtrat est recueilli et peut être analysé directement par CLHP.

3. analyse du contenu Propolin par CLHP

1. Création de courbes standard de propolins
   1. Préparer 1 L de la phase mobile de solution de méthanol : eau 88.8:11.2 (v/v).
   2. Préparer des dilutions de propolin des concentrations (C, D, F et G) standards (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL et 125 mg/mL, respectivement) à l’aide de la solution de la phase mobile comme solvant.
   3. Injecter 20 µL de propolin des concentrations standard dans la colonne de phase inverse, dans l’ordre de la faible concentration à la forte concentration.
   4. Affectez à la colonne HPLC à 30 ° C et le débit de 1 mL/min.
   5. Sélectionner la longueur d’onde du détecteur UV 280 nm et le temps de l’enregistreur à 20 min.
   6. Analyser les normes au moins 3 x.
   7. Tracer la réponse de mesure (axe y) contre la concentration (axe des x) à l’aide de calcul feuille de logiciel et créer une courbe standard avec l’équation et la valeur de R-carré.
2. Analyse des extrait alcoolique s
   1. Injecter 20 µL de l’éthanol les extraits obtenus d’étape 2.5 dans la colonne de phase inverse.
   2. Affectez à la colonne HPLC à 30 ° C et le débit de 1 mL/min.
   3. Sélectionner la longueur d’onde du détecteur UV 280 nm et le temps de l’enregistreur à 20 min.
   4. Analyser les normes au moins 3 x.
   5. Calculer la concentration de propolin dans l’extrait par l’éthanol, à l’aide de l’équation de la courbe d’étalonnage obtenue à l’étape 3.1.7 qui utilise la surface du pic pour chaque propolin.

4. analyse de Concentration bactéricide Concentration minimale inhibitrice et Minimum

Remarque : La méthode de microdilution sert à évaluer l’efficacité antibactérienne du propolins de l’éthanol extrait de propolis verte taïwanaise.

1. Préparation des organismes d’essai
   1. Décongeler les souches bactériennes, Staphylococcus aureus et Escherichia coli et puis, la culture eux à bouillon trypticase soja et bouillon nutritif, respectivement, à 37 ° C pendant 24 h.
   2. S. aureus à l’aide de bouillon trypticase soja et e. coli à l’aide de bouillon nutritif pour deux générations de passage et, puis, calculer unités formatrices de colonies par comptage des colonies individuelles sur une gélose.
2. Préparation de l’éthanol extrait pour tests d’activité antibactérienne
   1. Concentrer les extraits à l’éthanol obtenus à l’étape 1.5 par évaporation sous vide à 40 ° C pendant 15 min.
   2. Reconstituer la matière sèche avec le diméthylsulfoxyde (DMSO) et ajuster la concentration de l’extrait à 12,8 mg/mL.
   3. Faire une dilution en série (concentration : 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 et 640 µg/mL) de l’éthanol extrait en utilisant le bouillon.
3. Tests de concentration minimale inhibitrice
   1. Ajouter 10 µL d’éthanol dilué extraits allant de 0,156 640.0 µg/ml dans une plaque de 96 puits.
   2. En utilisant le bouillon, réglez le volume à 100 µL et maintenir 5 % DMSO dans toutes les dilutions.
   3. Ensemencer 100 µL de culture bactérienne (1 x 106/ml) dans la plaque à 96 puits.
   4. Extraits de l’inoculum de culture contenant différentes concentrations d’éthanol à 37 ° C pendant 48 h.
   5. Analyser la croissance bactérienne selon la turbidité et à l’aide de la densité optique (lecteur de microplaques) à 590 nm pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI).
4. Concentration bactéricide minimum tests
   1. Ensemencer 10 µL de culture liquide de chaque puits du test MIC qui ne présentaient aucune croissance sur une gélose.
   2. Incuber à 37 ° C pendant 24 h.
   3. Déterminer l’activité bactéricide en identifiant la plus faible concentration qui a révélé aucune prolifération bactérienne visible. La concentration qui élimine complètement la croissance cellulaire est considérée être la concentration bactérienne minimale (MBC).

Résultats

Résultats positifs des données représentatives pour l’extraction de l’éthanol sont présentées au tableau 1. Le rendement en matière sèche de la propolis verte taïwanais était corrélée positivement avec la concentration d’éthanol. Les extraits de l’éthanol 95 % et 99,5 % avaient la matière sèche plus élevée rendement de propolis verte taïwanaise. Le rendement en matière sèche plus faible de la propolis verte taïwanais s’est produite lorsque ...

Discussion

Une étude a rapporté que macération, avec différentes concentrations d’éthanol, pourrait servir pour l' extraction de la propolis brésilienne¹⁷; Toutefois, le processus était long¹⁷. Il a fallu au moins 10 jours pour extraire les composés bioactifs, comme la teneur en composés phénoliques, de propolis brésilienne¹⁷. Par ailleurs, extraction de l’éthanol en combinaison avec chauffage à 37 ° C, 50 ° C ou 70 ° C pendant 30 min a ét?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman no. 4 filter paper	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
reverse phase RP-18 column	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092
nutrient broth	Sigma-Aldrich	70122
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
spice grinder	Waring	WSG60K
microplate Reader	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC system	Agilent	1200 Series
vacuum evaporation	BÜCHI	Rotavapor R-215