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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Analyse de la SEM est une méthode efficace pour aider à l’identification des espèces ou discrimination phénotypique. Ce protocole décrit les méthodes pour l’examen des détails morphologiques spécifiques des trois types représentatifs des organismes et serait applicable à l’examen des caractéristiques d’un grand nombre d’organismique et types de tissus.

Résumé

Microscopie électronique (MEB) est une technique largement disponible qui a été appliquée à l’étude des spécimens biologiques allant des protéines individuelles aux cellules, tissus, organelles et même tout l’organisme. Ce protocole se concentre sur deux méthodes de séchage chimiques, hexaméthyldisilazane (HMDS) et t-butanol (TBA) et leur application à l’imagerie d’organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de sem Dans cet article, nous décrivons comment fixer, laver, déshydrater, sécher, monter, bredouiller manteau et image de trois types d’organismes : les cyanobactéries (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. et un SP inconnue), deux euglènes appartenant au genre Monomorphina (M. aenigmatica et M. pseudopyrum) et la drosophile (Drosophila melanogaster). Le but du présent protocole est de décrire une méthode rapide, peu coûteuse et simple pour obtenir des informations détaillées sur la structure, la taille et des caractéristiques de surface d’échantillons qui peuvent être largement appliquées à un large éventail d’organismes pour morphologiques évaluation. La réussite de ce protocole permettra à d’autres d’utiliser SEM pour visualiser des échantillons en appliquant ces techniques à leur système.

Introduction

Un microscope électronique à balayage (SEM) utilise un faisceau focalisé d’électrons de haute énergie pour générer une image à partir d’électrons secondaires qui montre la morphologie et la topographie d’un échantillon de1. SEM peut servir à déterminer directement la taille physique d’un échantillon, la structure de la surface et la forme en trois dimensions et offre une plus grande résolution et de la plus grande profondeur de champ par rapport à la microscopie photonique. Une autre forme de microscopie électronique (me), microscopie électronique à transmission (TEM) utilise des électrons focalisés qui traversent l’échantillon, générant des images avec des détails de structure interne. Tandis que TEM a une résolution supérieure à la lumière ou SEM et peut être utilisée pour résoudre des structures aussi petites que les atomes, il a trois inconvénients majeurs : préparation de l’échantillon vaste, un petit champ de vision et une faible profondeur de champ2,3. Bien qu’autre visualisé il existe des protocoles à l’aide de SEM d’examiner des cellules, tissus ou organites4,5,6,7,8,9, 10 , ce protocole est unique car nous décrivons des méthodes qui peuvent être largement appliquées à un large éventail d’organismes d’évaluation morphologique.

SEM a trouvé des applications larges pour l’examen des matériaux inorganiques, y compris les nanoparticules11,12, polymères,13et nombreuses applications en sciences géologiques, industriels et matériels14, 15,,16. En biologie, SEM a longtemps été utilisé comme une méthode d’examen des échantillons biologiques allant de protéines individuelles à tout les organismes17,18. SEM est une valeur particulière parce que les détails morphologiques de la surface peuvent être utilisés pour informer de la découverte scientifique. Analyse de la SEM est une méthode rapide, peu coûteuse et simple pour obtenir des informations détaillées sur la structure, la taille et des caractéristiques de surface d’une large gamme d’échantillons biologiques.

Car une SEM fonctionne normalement sous vide poussé (10-6 Torr minimum) pour soutenir un faisceau cohérent d’électrons à haute vitesse, aucun des liquides (eau, huiles, alcools) ne sont autorisés dans le compartiment de mesure, liquides à prévenir un vide de se former. Ainsi, tous les échantillons examinés à l’aide de SEM doivent être déshydratés, généralement à l’aide d’une série graduée de l’éthanol suivie d’un procédé de séchage pour éliminer l’éthanol. Il existe plusieurs méthodes de séchage des tissus biologiques devant servir à la SEM, y compris le séchage à l’air, lyophilisation, utilisation d’un dispositif de séchage du point critique (CPD), ou produit chimique séchage en utilisant l’alcool t-butylique (TBA) ou hexaméthyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. le plus souvent, le choix d’une méthode de séchage est empirique puisque chaque échantillon biologique peut-être réagir différemment à chaque méthode de séchage. Pour un échantillon donné, toutes ces méthodes peuvent être appropriées, afin de comparer les avantages et les inconvénients de chacun est utile dans le choix de la méthode appropriée.

Alors qu’un échantillon à la température ambiante ou dans une étuve (60 ° C) de séchage à l’air est la méthode la plus simple, la plupart des échantillons biologiques montrent des dommages causés par le séchage comme ratatinement et s’effondrer, aboutissant à la distorsion de l’échantillon. Le processus de lyophilisation aussi supprime l’eau (ou glace) auprès d’un échantillon, mais nécessite des échantillons congelés flash et mis sous vide pour éliminer la glace via le processus de sublimation, potentiellement endommager l’échantillon. En outre, l’utilisateur doit avoir accès à un lyophilisateur. La méthode la plus couramment utilisée pour la déshydratation des échantillons pour SEM est point critique séchage (CPD). CPD, l’éthanol dans un échantillon est remplacé par liquid dioxyde de carbone (CO2) et, sous une température spécifique et des conditions de pression appelées le point critique (31,1 ° C et 1 073 lb/po2), CO2 se vaporise sans créer de tension superficielle, ce qui maintien efficace les caractéristiques morphologiques et structurales de l’échantillon. Alors que le CPD est généralement la méthode standard, il a plusieurs inconvénients. Tout d’abord, le processus nécessite un accès à un point critique, sèche qui n’est pas seulement coûteux, mais qui nécessite également l’utilisation de dioxyde de carbone liquide. Deuxièmement, la taille de l’échantillon qui peut être séché se limite à la taille de la chambre du point critique sèche. En troisième lieu, l’échange de liquides au cours de la CPD peut provoquer des turbulences qui peuvent endommager l’échantillon.

Le séchage chimique offre de nombreux avantages par rapport aux CPD et sert comme une alternative appropriée devient largement utilisé dans la préparation de l’échantillon SEM. L’utilisation des dehydrants chimiques tels que l’ATB et HMDS offre une alternative rapide, peu coûteuse et simple à d’autres méthodes, tout en conservant l’intégrité structurale de l’échantillon. Récemment, nous avons montré qu’il n’y avait aucun différence dans l’intégrité du tissu ou de la qualité de l’image finale, capturé lors de l’utilisation de la DPC ou TBA comme la méthode de séchage en adulte Drosophila tissu rétinien23. Contrairement à la CPD, TBA et HMDS n’exigent pas un instrument de séchage ou de liquide de CO2 et il n’y a aucune limitation sur la taille de l’échantillon à sécher. En plus d’obtenir les produits chimiques, qu’une hotte chimique standard et l’équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse et des lunettes de sécurité) sont nécessaires pour compléter le processus de séchage. Alors que les deux TBA et HMDS sont inflammable, TBA est moins toxique et moins cher (environ 1/3 du coût de la HMDS) que HMDS.

Dans cet article, nous décrivons comment fixer, laver, déshydrater, sécher, monter, bredouiller manteau et image de trois types d’organismes : les cyanobactéries (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. et un SP inconnue), deux euglènes appartenant au genre Monomorphina (M. aenigmatica et M. pseudopyrum) et la drosophile (Drosophila melanogaster). Ces organismes représentent un large éventail en taille (0,5 µm à 4 mm) et de la diversité cellulaire (unicellulaires à multicellulaires), pourtant tous se prêtent facilement à l’analyse de la SEM avec seulement de légères variations, nécessaires à la préparation des échantillons. Ce protocole décrit les méthodes pour l’utilisation de déshydratation chimique et l’analyse de la SEM pour examiner les détails morphologiques des trois types d’organismes et serait applicable à l’examen des nombreux organismique et types de tissus.

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Protocole

1. préparation et Fixation

  1. Préparer des cyanobactéries.
    1. Cultiver des cultures pures en F/2 médias24,25 à une température de 28 ° C sur une 14:10 h cycle sombre de la lumière. Transférer la culture suffisante dans un tube de microtubes de 1,5 mL qu’après avoir laissé 15 min régler, le culot bactérien est environ 0,05 mL taille. Retirez le support et de la remplacer par 1,5 mL de fixateur (glutaraldéhyde à 1,25 %, du tampon phosphate 0,1 M pH 7,0), doucement, inverser plusieurs fois et incuber une nuit à 4 ° C.
    2. Les cellules fixes avec une pipette de verre dans une installation de filtration de 10 mL (Figure 1) contenant un filtre de 25 mm en polycarbonate avec 0,8 ou 0,2 µm pores, selon la taille des cellules de transfert. Sceller le bras latéral et entonnoir avec bouchons en caoutchouc pour contenir la culture dans l’entonnoir. Retirez le fixateur doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
      Remarque : Si la densité des cellules sur le filtre en polycarbonate n’est pas optimale, réglez le montant de départ de culture utilisée.
  2. Préparer les algues unicellulaires (euglènes).
    1. Cultiver des cultures pures en AF-6 médias26 avec 150 mL L-1 de milieu sol-eau disponible dans le commerce, ajouté aux médias, à une température de 22 ° C sur une 14:10 h cycle sombre de la lumière. Transférer 2 mL de faible densité (OD600 < 0,5) culture avec une pipette de verre dans une installation de filtration de 10 mL (Figure 1) contenant un filtre de 25 mm en polycarbonate avec 8 µm pores. Sceller le bras latéral et entonnoir avec bouchons en caoutchouc pour contenir la culture dans l’entonnoir.
      Remarque : Si la densité des cellules sur le filtre en polycarbonate n’est pas optimale, réglez le montant de départ de culture utilisée.
    2. Ajouter trois gouttes de 4 % le tétroxyde d’osmium (OsO4) directement à la culture et laisser pour incuber pendant 30 min. retirer le fixateur doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
      Remarque : OsO4 est une toxine aiguë (voie cutanée, orale et par inhalation, routes), corrosive pour la peau, dommageable pour les yeux et un sensibilisant respiratoire. OsO4 doivent être manipulés sous une hotte chimique utilisant des équipements de protection individuelle appropriés, y compris les gants, blouse et lunettes de protection.
  3. Préparer la Drosophila melanogaster (mouche)23.
    1. Anesthésier les mouches adultes en utilisant 100 % de dioxyde de carbone. Place anesthésiés adultes (environ 10 à 30 mouches) dans un tube à centrifuger flacon ou 1,5 mL petit bouchon à vis en plastique.
    2. Immerger les mouches anesthésiés dans 1 mL de fixateur (glutaraldéhyde à 1,25 %, du tampon phosphate 0,1 M pH 7,2) pour 2 h (ou toute une nuit) à 4 ° C. Si les mouches flottent à la surface du fixateur, ajouter quelques gouttes d’éther de tert-octylphényle de polyéthylèneglycol de 2,5 % à affaiblir la tension superficielle de le fixatif permettant une immersion totale du tissu. Retirez le fixateur à l’aide d’une pipette de verre.

2. laver et déshydratation

  1. Laver et mettre en attente les cyanobactéries.
    1. Laver l’échantillon fixe trois fois avec 5 mL de tampon phosphate 0,1 M pH 7.0 à température ambiante pendant 10 minutes chacun. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir le lavage. Retirez chaque lavage doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
    2. Déshydrater l’échantillon tout en conservant l’immersion continue en utilisant une série graduée de l’éthanol, pendant 10 min dans un volume de 5 mL dans l’entonnoir. Les concentrations d’éthanol graduées sont : 25 %, 50 %, 75 %, 95 % et 2 changements d’éthanol à 100 %. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir de l’éthanol dans l’entonnoir, prévenir la perte tant par évaporation et passive flux à travers le filtre.
    3. Supprimer l’éthanol par aspiration douce sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons. Transférer le filtre/échantillon dans un aluminium jetable pesant plat contenant juste assez d’éthanol 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.
  2. Laver et mettre en attente les algues unicellulaires (euglènes).
    1. Laver l’échantillon fixe trois fois avec 5 mL d’eau déminéralisée à température ambiante pendant 10 minutes chacun. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir le lavage dans l’entonnoir. Retirez chaque lavage doux sous vide sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons.
    2. Déshydrater l’échantillon tout en conservant l’immersion continue en utilisant une série graduée de l’éthanol pendant 10 min dans un volume de 5 mL dans l’entonnoir. Les concentrations d’éthanol graduées sont : 25 %, 50 %, 75 %, 95 % et 2 changements d’éthanol à 100 %. Garder le ballon et l’entonnoir avec bouchon pour contenir de l’éthanol dans l’entonnoir, prévenir la perte tant par évaporation et passive flux à travers le filtre.
    3. Supprimer l’éthanol par aspiration douce sur la fiole de filtration, après avoir enlevé les deux bouchons. Transférer le filtre/échantillon dans un aluminium jetable pesant plat contenant juste assez d’éthanol 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.
  3. Laver et déshydrater Drosophila melanogaster (mouche).
    1. Laver l’échantillon fixe trois fois avec 1 mL de tampon phosphate 0,1 M pH 7,2 à température ambiante pendant 10 min dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Retirez chaque lavage avec une pipette en verre, en veillant à ne pas enlever les mouches.
    2. Déshydrater l’échantillon en utilisant une série graduée de l’éthanol, pendant 10 min dans un volume de 1 mL dans un tube à centrifuger. Les concentrations d’éthanol sont : 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, 95 %, 100 %. Supprimer l’éthanol avec une pipette en verre, en veillant à ne pas enlever les mouches.
    3. Conserver l’échantillon dans le tube de microtubes de 1,5 mL avec juste assez d’éthanol 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.

3. séchage

  1. Effectuer le séchage chimique en utilisant t-butyl alcohol (TBA)27.
    1. Remplacer la solution d’éthanol à 100 % avec une solution 1:1 de TBA et 100 % éthanol pendant 20 min. remplacer la solution 1:1 avec 100 % de TBA pendant 20 min. répéter deux fois. Conserver la solution à 37 ° C alors que TBA ne gèle pas.
      Remarque : TBA 100 % a un point de congélation de 25,5 ° C ; la solution 1:1 ne gèlera pas à température ambiante. ATB est inflammable, provoque une irritation oculaire grave, est nocif par inhalation et peut causer une irritation respiratoire, somnolence ou vertiges. TBA doit être manipulé sous une hotte chimique utilisant des équipements de protection individuelle appropriés, y compris les gants, blouse et lunettes de protection.
    2. Transférer l’échantillon en TBA, si dans un tube de microtubes de 1,5 mL, dans un pesant plat d’aluminium jetable. Une fois dans la capsule en aluminium, supprimez TBA et remplacez-les par juste assez frais TBA de 100 % pour couvrir l’échantillon. Congeler le TBA à 4 ° C pendant 10 min.
    3. Transférer dans un dessiccateur à vide (cloche) avec des cryosacs congelé pour garder TBA congelé. Évacuer et maintenir le vide avec une pompe rotative permettant l’échantillon sec par sublimation sous vide de la TBA congelé pendant au moins 3 heures ou jusqu’au lendemain.
  2. Effectuer le séchage chimique en utilisant hexaméthyldisilazane (HMDS)20.
    1. Remplacez la solution d’éthanol 100 % avec une solution de 1:2 de HMDS et éthanol à 100 % pendant 20 min. remplacer la solution 1:2 avec une solution de 2:1 de HMDS et éthanol à 100 % pendant 20 min. 2:1 solution 100 % HMDS pendant 20 min. répéter une fois.
      Remarque : Le HMDS est inflammable et une toxine aiguë (voie cutanée). HMDS doivent être manipulé sous une hotte chimique utilisant des équipements de protection individuelle appropriés, y compris les gants, blouse et lunettes de protection.
    2. Transférer l’échantillon dans le HMDS, si dans un tube de microtubes de 1,5 mL, dans un pesant plat d’aluminium jetable. Une fois dans l’aluminium pesant plat, remplacer le 100 % HMDS avec juste assez frais 100 % HMDS pour couvrir l’échantillon.
    3. Transférer l’échantillon dans un dessicateur non vide en plastique ou en verre avec dessicant frais (5-6 cm de profondeur) et les placer sous une hotte chimique. Vous pouvez également placer l’échantillon directement sous une hotte chimique à sec avec un couvercle lâche, tel qu’une zone, pour empêcher les débris de tomber sur l’échantillon. Laisser sécher pendant 12 à 24 h l’échantillon.

4. montage

  1. Monter les cyanobactéries et les euglènes.
    1. Bas de soit un aluminium de 12 ou 25 mm-montage stub pour indiquer ce qui est mis sur le dessus de l’étiquette. Couper le filtre en polycarbonate avec les cellules séchées en quartiers avec une lame de rasoir propre ou un scalpel, si vous utilisez une longrine de 12 mm, ou placer le filtre entier si vous utilisez une ébauche de 25 mm.
    2. Placer chaque filtre sur adhésif ou un onglet adhésif carbone fixée sur le haut d’une ébauche.
  2. Monter Drosophila melanogaster (mouche).
    1. La partie inférieure du talon aluminium montage pour indiquer ce qui est mis sur le dessus de l’étiquette.
      Placer les mouches sèches dans la position souhaitée sur onglet adhésif adhésif ou carbone, fixée sur le haut d’un village sous un microscope à dissection avec pince de précision.
    2. Appliquer l’adhésif conducteur argent, c.-à-d. argent peinture, sur les bords externes des talons. Branchez la peinture argentée sur les mouches à l’aide d’un cure-dent pour assurer la conductivité. Ne laissez pas la peinture de toucher la zone d’imagerie désirée.
    3. Placer les talons dans une zone de stub titulaire et la boîte de porte talon ouvert dans un dessicateur. Laisser le vernis sécher au moins 3 heures ou jusqu’au lendemain pour de meilleurs résultats.

5. revêtement par pulvérisation cathodique

  1. Préparez l’appareil de revêtement par pulvérisation cathodique en effectuant quatre ou cinq bouffées de gaz argon. Si l’humidité est élevée (c'est-à-dire l’air ambiant se sent moite, habituellement d’environ 50 % d’humidité relative), effectuer des purges de six ou sept. Par pulvérisation cathodique enduire les stubs suivant les instructions du fabricant.
  2. Échantillons de manteau basés sur échantillon utilisé :
    1. Pour les filtres avec des cyanobactéries, régler la minuterie à bredouiller manteau pour 180 s directement sur.
    2. Pour les filtres avec les algues eucaryotes, c.-à-d. les euglènes, régler la minuterie à bredouiller manteau pour 120 s tout droit, puis 20 s sur trois côtés à un angle de 45 °.
    3. Pour les grands échantillons, c'est-à-dire, mouches chefs, régler la minuterie à bredouiller manteau pour 60 s tout droit, puis 30 s de chaque côté à un angle de 45 °.
      Remarque : Une fois terminée, revêtement talons doivent être gris clair.

6. l’imagerie

  1. Échantillons d’image à l’aide d’un microscope électronique à balayage, qui comprend un détecteur d’électrons secondaires (SE).
    1. Pour les cyanobactéries, appliquer les paramètres suivants : 3-5 kV accélérateur tension (AC), sonde de courant (PC) 20-30 et 5 mm distance de travail (WD). Pour les euglènes, utilisez 3 kV AC, 30 PC et WD de 5 mm. Pour les mouches, utilisez 5 kV AC, 30 PC et 5 à 10 mm WD.
  2. Ajustez le grossissement selon la taille de l’objet à visualiser ou de détail. Régler le stigmators, ouvertures et mise au point jusqu'à ce qu’une image claire est produite. Capturer l’image à l’aide de paramètres de haute résolution selon les instructions du fabricant du SEM.

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Résultats

Les cyanobactéries sont des procaryote groupe d’organismes qui sont essentiels pour le mondial du carbone, oxygène et azote cycles28,29. Des estimés 6000 espèces de cyanobactéries30, plus entourés d’une gaine mucilagineuse qui couvrent et relient les cellules et à d’autres structures31, qui, ainsi que de la forme, peut être résolu au microscope32

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Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole utilisant SEM afin d’obtenir des informations détaillées sur les caractéristiques morphologiques externes de trois types d’organismes que d’autres peuvent s’appliquer afin d’examiner les caractéristiques de nombreux types d’organismes ou de tissus. À chaque étape du protocole, il y a des points potentiels d’erreur qui peuvent survenir et sont décrits en détail ci-dessous.

Tandis que les volumes pour le fixateur et lavages donnés ici s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par une subvention de MLS et une bourse de chercheur de l’été à MAK du bureau de la recherche et des études supérieures à l’Université de Central Michigan. Cyanobactéries ont été fournis par le Zimba et laboratoire de plancton, une partie du centre d’études côtières, Texas A & M University à Corpus Christi. Euglènes ont été fournis par le laboratoire Triemer, Michigan State University.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
gold–palladiumTed Pella, Inc.91212
Silver conductive adhesive 503Electron Microscopy Sciences12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonateSigmaWHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, blackSigmaWHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonateSigmaWHA110606
aluminum weighing dish Fisher Scientific08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)Electron Microscopy Sciences75210
aluminum mounting stubs (25 mm)Electron Microscopy Sciences75186
Adhesive tabs Electron Microscopy Sciences76760
conductive carbon adhesive tabsElectron Microscopy Sciences77825
F/2 mediaCulture Collection of Algae at the University of Texas at Austinhttps://utex.org/products/f_2-mediumNo Catalog number given - see link 
AF6 mediaBigelow - National Center for Marin Algae and Microbiotahttps://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdfNo Catalog number given - see link 
Soil water mediumCarolina Biological Supply Company153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)VWR97062-208
Hummer 6.2 Sputter CoaterAnatech USAhttp://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		The company doesn't appear to sell this model any longer 

Références

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