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Method Article
Ce protocole est conçu pour évaluer la cytotoxicité de lymphocytes (cellules T voiture) redirigée immunothérapeutique contre les cellules cancéreuses structurés (sphéroïdes) 3D en temps réel.
L’immunothérapie est devenu un domaine d’intérêt croissant dans la lutte contre le cancer autrement impossibles à traiter. Parmi toutes les méthodes immunothérapeutiques, récepteur de l’antigène chimérique (voiture) redirigé NKT a obtenu les résultats plus spectaculaires, en particulier avec la pédiatrie B-la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-B). Les méthodes de validation classique de lymphocytes T de voiture reposent sur l’utilisation de la spécificité et les tests de fonctionnalité des cellules T de voiture contre les cellules cibles en suspension et dans des modèles de xénogreffes. Malheureusement, les observations faites in vitro sont souvent découplées de résultats obtenus in vivo et beaucoup d’effort et d’animaux puisse être épargné en ajoutant une autre étape : l’utilisation de la culture 3D. La production des sphéroïdes hors des cellules cibles potentielles qui imitent la structure 3D des cellules tumorales lorsqu’ils sont greffés dans le modèle animal représente une alternative idéale. Nous rapportons ici une méthode simple, abordable et fiable pour produire des sphéroïdes d’une lignée cellulaire de cancer colorectal transduite comme un outil de validation pour la thérapie cellulaire adoptive (exemplifié ici par les cellules CD19 voiture T). Cette méthode est couplée avec un système d’imagerie live avancé qui peut suivre la croissance de sphéroïde, cytotoxicité et tumeur de l’apoptose des cellules des cellules effectrices.
Transfert de cellules adoptifs (ACT) représente le traitement du cancer la prochain génération. Il repose sur l’injection de cellules effectrices (ou NK-cellules T) dans un patient. Ces cellules peuvent être génétiquement modifiés avec un récepteur qui va les guider vers leur cible, la tumeur et le détruire. Récemment, cette approche s’est avérée possible lorsqu’un récepteur d’antigène chimérique (voiture) dirigé contre le marqueur de cellules B CD19 a été introduit dans les cellules du patient T pour tuer son cancer1. Dans le cas de la voiture, qui est un récepteur artificiel, la conception se compose de fragments d’anticorps spécifiques, l’antigène binding domain réduit à un fragment de variable d’une chaîne unique désigné (scFv), entité liée à des domaines de signalisation de cellules T. Bien qu’il y a plusieurs dessins ou modèles, les versions les plus couramment utilisées dénommé comme deuxième génération modèles de voiture, se composent de CD3z pour la signalisation de TCR et un domaine de costimulation (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) 1 , 2. le domaine de l’immunothérapie réalisé la plupart de son attention à cette nouvelle forme de la loi lorsque les cellules CD19 voiture-T traitement efficacement de nombreux patients atteints de tumeurs malignes de lymphocytes B3,4. Suite à ce succès, les chercheurs ont essayé d’exploiter les conceptions semblables en ciblant les autres épitopes pour des tumeurs solides avec un succès limité. Malheureusement, la rareté des antigènes spécifiques de la tumeur et les micro-environnements tumeur plus sévères rendus voiture T cellules moins efficaces vers des tumeurs solides5.
Actuellement, les stratégies de validation plus couramment utilisés in vitro reposent sur des systèmes bidimensionnels (2D) qui portent uniquement sur un fragment des défis déjà mentionné de tumeur solide. Classiquement, 2D en vitro systèmes comportent un mélange de cellules de T de voiture et de lignées de cellules cancéreuses cible comme monocouches pour évaluer la fonctionnalité et la spécificité de ces cellules effectrices. Bien que ces stratégies sont des parties importantes et vitales des études, ils ne prennent pas en considération la morphologie complexe et une structure de tridimensionnelle (3D) des cellules du cancer6. Cellules cancéreuses cultivées dans des systèmes 3D, dénommé sphéroïdes, acquièrent de nouveaux caractères phénotypiques à travers des changements dans le gène expression profil7, susceptibles d’influencer la reconnaissance par les cellules effectrices redirigée. Birgersdotter et ses collègues ont démontré qu’une lignée de cellules de Hodgkin lymphome (HL) lorsqu’il est cultivé seulement dans un modèle de culture 3D acquiert un profil d’expression génique qui est semblable à la tumeur primitive échantillons8. Par conséquent, sphéroïdes ou 3D similaires culture offre des méthodologies plus pertinent dans des modèles in vitro par opposition aux systèmes 2D standards. Ces systèmes sont également semblables à des études in vivo qui sont considérés comme la dernière étape dans le processus de validation d’une voiture donnée. Considérant que les systèmes 2D ne parviennent pas à imiter la morphologie des grappes de cancer, sphéroïdes proposent des formations similaires afin d’évaluer la fonctionnalité des cellules de T de voiture avant modèles in vivo. Dans une étude, Pickl Al identifié qu’un modèle de sphéroïde de récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) surexprimant les cellules cancéreuses démontré des profils similaires de signalisation de modèles in vivo9. Cela soutient encore que les sphéroïdes offrent plus pertinentes et fermer-à vivo évaluation des cellules T de la voiture. En outre, validation de lymphocytes-T de voiture contre sphéroïdes peut aider à évaluer leur efficacité plus critique et empêcher que certaines des conceptions études in vivo prématurément10; contribuant ainsi, à la recherche sur le plan éthique concerné en sacrifiant moins d’animaux. En outre, protocoles utilisant des sphéroïdes ne sont pas plus chers que les systèmes 2D classiques et beaucoup plus rapide par rapport aux études classiques en vivo . Globalement, on peut prédire que l’inclusion d’études de sphéroïde va bientôt devenir une pratique standard pour relier les études in vitro et in vivo.
Nous présentons ici la préparation des sphéroïdes de la lignée de cellules cancéreuses du côlon HCT 116. Cette lignée cellulaire a été modifiée afin d’exprimer la molécule CD19 humaine qui la rend sensible aux cellules T voiture CD19 et de fournir une évaluation claire de l’assassinat à l’aide d’une construction de voiture cliniquement validée.
1. génération des sphéroïdes de lignée de cellules de Cancer Colorectal
2. génération des cellules CD19 voiture T
3. 3D tumeur sphéroïde Killing Assay
4. analyse d’images automatisé
Comme peut être vu dans la Figure 1, il est crucial de vérifier, par cytométrie en flux, le niveau d’expression du CD19 voiture sur les lymphocytes T (Figure 1 a) et le niveau de CD19 sur des lignées cellulaires tumorales HCT116 (Figure 1 b). La figure 2 illustre le résultat d’une expérience typique sphéroïde. Les appareils d’imagerie automatisée prend des...
L’utilisation des sphéroïdes comme un outil innovant pour valider le traitement du cancer futur est devenu un domaine d’intérêt croissant au cours des années. Sphéroïdes représentent une étape intermédiaire entre le classique 2D analyse in vitro et in vivo évaluation. La méthode plus détient beaucoup de promesse concernant leur puissance en termes de tumeur micro-environnement imitant ainsi que du gène7de profilage. Le protocole présenté dans cette publication est une adaptatio...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherche norvégien sous subventions #244388, #254817 et #284983 ; la société norvégienne de Cancer (#6829007) ; La région de norvégien de la santé du Sud-est sous Grant #17/00264-6 et #2016006.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |
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