Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Résumé

Ce protocole est conçu pour évaluer la cytotoxicité de lymphocytes (cellules T voiture) redirigée immunothérapeutique contre les cellules cancéreuses structurés (sphéroïdes) 3D en temps réel.

Résumé

L’immunothérapie est devenu un domaine d’intérêt croissant dans la lutte contre le cancer autrement impossibles à traiter. Parmi toutes les méthodes immunothérapeutiques, récepteur de l’antigène chimérique (voiture) redirigé NKT a obtenu les résultats plus spectaculaires, en particulier avec la pédiatrie B-la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-B). Les méthodes de validation classique de lymphocytes T de voiture reposent sur l’utilisation de la spécificité et les tests de fonctionnalité des cellules T de voiture contre les cellules cibles en suspension et dans des modèles de xénogreffes. Malheureusement, les observations faites in vitro sont souvent découplées de résultats obtenus in vivo et beaucoup d’effort et d’animaux puisse être épargné en ajoutant une autre étape : l’utilisation de la culture 3D. La production des sphéroïdes hors des cellules cibles potentielles qui imitent la structure 3D des cellules tumorales lorsqu’ils sont greffés dans le modèle animal représente une alternative idéale. Nous rapportons ici une méthode simple, abordable et fiable pour produire des sphéroïdes d’une lignée cellulaire de cancer colorectal transduite comme un outil de validation pour la thérapie cellulaire adoptive (exemplifié ici par les cellules CD19 voiture T). Cette méthode est couplée avec un système d’imagerie live avancé qui peut suivre la croissance de sphéroïde, cytotoxicité et tumeur de l’apoptose des cellules des cellules effectrices.

Introduction

Transfert de cellules adoptifs (ACT) représente le traitement du cancer la prochain génération. Il repose sur l’injection de cellules effectrices (ou NK-cellules T) dans un patient. Ces cellules peuvent être génétiquement modifiés avec un récepteur qui va les guider vers leur cible, la tumeur et le détruire. Récemment, cette approche s’est avérée possible lorsqu’un récepteur d’antigène chimérique (voiture) dirigé contre le marqueur de cellules B CD19 a été introduit dans les cellules du patient T pour tuer son cancer¹. Dans le cas de la voiture, qui est un récepteur artificiel, la conception se compose de fragments d’anticorps spécifiques, l’antigène binding domain réduit à un fragment de variable d’une chaîne unique désigné (scFv), entité liée à des domaines de signalisation de cellules T. Bien qu’il y a plusieurs dessins ou modèles, les versions les plus couramment utilisées dénommé comme deuxième génération modèles de voiture, se composent de CD3z pour la signalisation de TCR et un domaine de costimulation (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) ^{1 , 2}. le domaine de l’immunothérapie réalisé la plupart de son attention à cette nouvelle forme de la loi lorsque les cellules CD19 voiture-T traitement efficacement de nombreux patients atteints de tumeurs malignes de lymphocytes B^3,4. Suite à ce succès, les chercheurs ont essayé d’exploiter les conceptions semblables en ciblant les autres épitopes pour des tumeurs solides avec un succès limité. Malheureusement, la rareté des antigènes spécifiques de la tumeur et les micro-environnements tumeur plus sévères rendus voiture T cellules moins efficaces vers des tumeurs solides⁵.

Actuellement, les stratégies de validation plus couramment utilisés in vitro reposent sur des systèmes bidimensionnels (2D) qui portent uniquement sur un fragment des défis déjà mentionné de tumeur solide. Classiquement, 2D en vitro systèmes comportent un mélange de cellules de T de voiture et de lignées de cellules cancéreuses cible comme monocouches pour évaluer la fonctionnalité et la spécificité de ces cellules effectrices. Bien que ces stratégies sont des parties importantes et vitales des études, ils ne prennent pas en considération la morphologie complexe et une structure de tridimensionnelle (3D) des cellules du cancer⁶. Cellules cancéreuses cultivées dans des systèmes 3D, dénommé sphéroïdes, acquièrent de nouveaux caractères phénotypiques à travers des changements dans le gène expression profil⁷, susceptibles d’influencer la reconnaissance par les cellules effectrices redirigée. Birgersdotter et ses collègues ont démontré qu’une lignée de cellules de Hodgkin lymphome (HL) lorsqu’il est cultivé seulement dans un modèle de culture 3D acquiert un profil d’expression génique qui est semblable à la tumeur primitive échantillons⁸. Par conséquent, sphéroïdes ou 3D similaires culture offre des méthodologies plus pertinent dans des modèles in vitro par opposition aux systèmes 2D standards. Ces systèmes sont également semblables à des études in vivo qui sont considérés comme la dernière étape dans le processus de validation d’une voiture donnée. Considérant que les systèmes 2D ne parviennent pas à imiter la morphologie des grappes de cancer, sphéroïdes proposent des formations similaires afin d’évaluer la fonctionnalité des cellules de T de voiture avant modèles in vivo. Dans une étude, Pickl Al identifié qu’un modèle de sphéroïde de récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) surexprimant les cellules cancéreuses démontré des profils similaires de signalisation de modèles in vivo⁹. Cela soutient encore que les sphéroïdes offrent plus pertinentes et fermer-à vivo évaluation des cellules T de la voiture. En outre, validation de lymphocytes-T de voiture contre sphéroïdes peut aider à évaluer leur efficacité plus critique et empêcher que certaines des conceptions études in vivo prématurément¹⁰; contribuant ainsi, à la recherche sur le plan éthique concerné en sacrifiant moins d’animaux. En outre, protocoles utilisant des sphéroïdes ne sont pas plus chers que les systèmes 2D classiques et beaucoup plus rapide par rapport aux études classiques en vivo . Globalement, on peut prédire que l’inclusion d’études de sphéroïde va bientôt devenir une pratique standard pour relier les études in vitro et in vivo.

Nous présentons ici la préparation des sphéroïdes de la lignée de cellules cancéreuses du côlon HCT 116. Cette lignée cellulaire a été modifiée afin d’exprimer la molécule CD19 humaine qui la rend sensible aux cellules T voiture CD19 et de fournir une évaluation claire de l’assassinat à l’aide d’une construction de voiture cliniquement validée.

Protocole

1. génération des sphéroïdes de lignée de cellules de Cancer Colorectal

1. Monocouches de cellules laver HCT 116 (stablement transduites pour exprimer le Cluster de différenciation 19 (CD19) et protéine de Fluorescence verte (GFP)) avec phosphate buffered saline (PBS ; 5 mL pour un 25 cm² ou 10 mL pour un flacon de² 75 cm). Ajouter la trypsine (0,5 mL pour un 25 cm² ou 1 mL pour un flacon de² 75 cm) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
2. Vérifier le détachement des cellules au microscope et neutraliser l’enzyme dissociation cellulaire avec milieu de Roswell Park Memorial Institute 160 complet (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10 % FCS + gentamycine ; 10 mL pour un 25 cm² ou 20 mL pour un flacon de² 75 cm).
3. Suspension de cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension en pipettant également monter et descendre plusieurs fois avec 5 mL de milieu RPM1 1640 complet.
4. Compter les cellules à l’aide de bleu Trypan exclusion sur un compteur de cellules compatibles.
5. Suspension de cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans un milieu RPMI pour obtenir 5 x 10³ cellules/mL.
6. Transférer la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et pipeter 200 µL/puits dans un 96 puits autour des plaques de fond à l’aide d’une pipette multicanaux.
7. Transfert de la plaque de l’appareil d’imagerie automatisée à l’intérieur de l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO₂, 95 % d’humidité).
8. Ouvrez une session dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez Calendrier à acquérir | Lancement ajouter navire | Scannez le calendrier | Créer le navire : nouvelle.
9. Sélectionnez l’analyse Type : sphéroïde. Sélectionner les chaînes d’intérêt : Phase + fond clair (pour suivre la croissance de sphéroïdes), vert (pour suivre le signal de la tumeur, acquisition temps 300 ms) et rouge (pour suivre l’apoptose, acquisition temps 400 ms).
   1. Sélectionner l’agrandissement souhaité : 10 x.
   2. Choisissez le modèle de plaque et de sa position dans le tiroir. Sélectionnez la position des puits à l’image. Entrez la description de l’expérience : nom, type de cellules, nombre de cellules.
10. Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Reporter l’analyse jusqu'à ce que plus tard. Faites un clic droit sur la barre temporelle et sélectionnez l’option Set sélectionné Scan groupe intervalle et mis ajouter des scans chaque à 4 h et pour un total de 24 h. régler l’heure de départ souhaitée (au moins 1 h après incubation dans l’appareil d’imagerie automatisée).
11. Vérifier tous les 2 jours pour la croissance des sphéroïdes en ouvrant une session dans le logiciel d’imagerie.
    1. Choisissez l’option Vue Scans récents et cliquez deux fois sur l’expérience souhaitée. Sélectionnez fond clair dans le panneau couches image et utilisez l’image mesure caractéristiques outil pour mesurer le diamètre des sphéroïdes. Il faut compter 6 jours pour un sphéroïde atteindre la taille désirée : 0,5 mm de diamètre. Ajouter 50 µL de milieu RPMI complet / puits à jour 4 pour limiter l’effet de l’évaporation moyenne.

2. génération des cellules CD19 voiture T

1. Expansion des cellules CD19 voiture T
   Remarque : Expression stable des cellules CD19 voiture T a été acquise par transduction rétrovirale en vrac du donneur sain PBMC comme précédemment décrit¹⁶. La construction rétrovirale codant pour CD19 voiture est une voiture de deuxième génération et se compose de chaîne scFv fmc63, charnière CD8 et domaine transmembranaire, un domaine de costimulation 4-1BB et enfin un domaine CD3ζ.
   1. Pour développer, culture du T transduite cellules en présence d’anti-CD3/28 billes magnétiques avec une cellule au rapport de la perle de 1:1 pour 10 à 11 jours. Au cours de l’expansion, les cellules sont en milieu complet (VIVO X 15, 5 % sérum remplacement et IL-2 humaine recombinante de 100 U/mL).
      Remarque : La densité idéale pour un développement efficace est de 1 à 2 x 10⁶ cellules/mL. En fonction du nombre initial, les cellules peuvent être développés dans des flacons (flacons² 25 cm à 20 mL, 75 cm² flacons de 40 mL du volume total) dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO₂, 95 % d’humidité).
   2. Comme groupe témoin négatif pour les épreuves suivantes, notamment non-transduites PBMC (désignera comme Mock) du protocole extension parallèle aux cellules CD19 voiture T.
   3. Le jour 3, ajouter un milieu frais tous les jours et diviser les cellules en flacons de culture plus si nécessaire.
   4. Jour 10 – 11, cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant et combiner toutes les cellules dans un tube de 50 mL et remettre en suspension les cellules dans environ 30 mL de supports complets neufs.
   5. Placer le tube de 50 mL contenant les cellules remises en suspension sur un support magnétique pour séparer les billes magnétiques de milieu de culture.
   6. Attendre 2 à 3 min pour les perles de recueillir sur les bords du tube.
   7. Enlever le milieu de culture avec une pipette et le transfert dans un nouveau tube sans toucher les zones de collecte de billes magnétiques.
   8. Répétez les étapes concernant le retrait de la perle (2.1.5–2.1.7) une fois de plus pour limiter le nombre de billes dans le milieu de culture.
   9. Remettre en suspension et compter les cellules non vides, ajuster la densité de 1 à 2 x 10⁶ cellules/mL dans le milieu complet.
   10. Reposer les cellules au moins 4 h jusqu'à la nuit. Ensuite directement congeler à-80 ° C vers le bas et transférer les flacons dans un réservoir d’azote liquide le lendemain pour le stockage à long terme. Alternativement, on peut prolonger le reste jusqu'à toute la nuit pour une utilisation immédiate.
2. Contrôle d’expression CD19 voiture sur des cellules primaires de T
   1. Compter le nombre de NKT élargi que les chiffres peuvent varier légèrement après une culture ou modérément après gel/dégel.
   2. Transfert de 5 x 10⁵ cellules de deux voiture CD19 et Mock NKT primaire pour séparer les tubes de cytométrie de flux.
   3. Laver les cellules avec 200 μL de tampon de flux (2 % FBS dans du PBS) et centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min. répéter les étapes de lavage pour se débarrasser de tous les artefacts causés par le milieu de culture.
   4. Préparer l’anticorps primaire (biotine Goat anti-Mouse IgG, F(ab') ₂ Fragment spécifique) en effectuant la dilution de 1 : 200 dans le tampon de flux.
   5. Remettre en suspension les cellules de 100 μL de mélange d’anticorps par tube et incuber sur la glace pendant 15 min. Répétez l’étape précédente de laver deux fois pour éliminer les anticorps excédentaire.
   6. Préparer l’anticorps secondaire (streptavidine-PE) en dilution 1 : 400 dans le tampon de flux.
   7. Remettre en suspension les cellules de 100 μL de mélange d’anticorps par tube et incuber sur la glace pendant 15 min. Répétez l’étape précédente de laver deux fois pour se débarrasser de l’excès anticorps.
   8. Remettre en suspension les cellules dans 200 μL de tampon de flux par tube et de les analyser sur un cytomètre en flux.
   9. Utilisation des cellules T se moquer pour mettre en place la porte positif et négatif et analyser CD19 voiture transduites NKT en conséquence.

3. 3D tumeur sphéroïde Killing Assay

1. Après 6 jours ou une fois sphéroïdes atteignent la taille souhaitée, retirez la plaque de l’incubateur. À l’aide d’une pipette multicanaux, Retirez doucement 100 µL/puits de milieu IPMB 1640 complet des plaques sphéroïde.
   1. Pour cette étape, les pointes vers l’intérieur d’angle murale de la plaque 96 puits, en évitant tout contact avec le fond du puits afin de minimiser la perturbation des sphéroïdes. Restant de volume devrait être environ 100 µL.
2. Préparer une solution de 1 : 200 d’annexine V rouge en mélangeant 50 µL de l’annexine V rouge avec 9,95 mL du milieu RPMI 1640 complet.
3. Ajouter 100 µL/puits de la 1 : 200 solution annexine V rouge.
4. Transférer la plaque dans un incubateur (37° C, 5 % de CO₂, 95 % d’humidité) pendant 15 min.
5. Récolter les cellules T CD19 voiture transduits dans un tube de 15 mL et centrifuger à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension en pipettant également monter et descendre plusieurs fois avec 2 mL de milieu RPM1 1640 complet.
6. Compter les cellules à l’aide de bleu Trypan exclusion sur un compteur de cellules compatibles.
7. Suspension de cellules de centrifugation à 500 g pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans un milieu RPMI pour obtenir 2 x 10⁵ cellules/mL.
8. Transférer la suspension cellulaire à un réservoir stérile et verser 100 µL/puits dans un 96 puits rond plaque de sphéroïde de fond à l’aide d’une pipette multicanaux.
9. Transférer la plaque arrière de l’appareil d’imagerie automatisée à l’intérieur de l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO₂, 95 % d’humidité).
10. Ouvrez une session dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez calendrier afin d’acquérir.
    1. Faites un clic droit sur la chronologie de Scan et sélectionnez Modifier chronologie. Faites un clic droit sur le groupe de balayage et supprimez-le. Faites un clic droit sur le calendrier et sélectionnez option Set sélectionné Scan groupe intervalle et définir ajouter des scans chaque à 1,5 h et pour un total de 24 h.
    2. Régler l’heure de départ souhaitée (au moins 1 h après incubation dans l’appareil d’imagerie automatisée). Sélectionnez enregistrer les scans du calendrier.

4. analyse d’images automatisé

1. Connectez-vous à acquisition, choisissez l’option Vue récente analyse et sélectionnez l’option Lancer l’analyse . Sélectionnez créer nouveau définition d’analyse | Type d’analyse : sphéroïde. Cochez les canaux de l’Image afin d’analyser (Phase + fond clair, vert et rouge).
2. Sélectionnez au moins 10 images représentatives : en règle générale, 1 par État et par au moins 3 points dans le temps (début, milieu et fin de l’acquisition).
3. Aperçu par défaut analyser la procédure sur la pile de l’ensemble de l’image.
4. Modifier les paramètres pour masque fond clair. Les paramètres typiques sont : sensibilité 10, trou remplir 1 000 µm²min zone 1 000 µm². Un aperçu sur la pile de l’ensemble de l’image et vérifiez que les paramètres sélectionnés détecter les sphéroïdes avec précision.
5. Modifier les paramètres pour masque verte (GFP). Les paramètres typiques sont : chapeau haut de forme segmentation avec rayon 200 µm et seuil 3 GCU, bord scindé, trou remplir 5 000 µm², ajuster taille -2 pixels, zone min 3 000 µm². Un aperçu sur la pile de l’ensemble de l’image et vérifiez que les paramètres sélectionnés détecter les sphéroïdes avec précision.
6. Modifier les paramètres pour masque rouge (annexine V). Les paramètres typiques sont : chapeau haut de forme segmentation avec rayon 150 µm et seuil 2 CUU, bord scindé, trou remplir 5 000 µm², ajuster taille 0 pixels, zone min 1 000 µm². Un aperçu sur la pile de l’ensemble de l’image et vérifiez que les paramètres sélectionnés détecter les sphéroïdes avec précision.
7. Lancement de l’analyseur.
   1. Une fois l’analyse terminée, extrait de la mesure de l’intérêt. Sélectionnez le fichier analysé, puis l’option Paramètres du graphique . Sélectionnez les paramètres d’intérêt, l’analyse et le puits. En général, totale intensité rouge et verte sur fond clair territoire donne les mesures les plus précises en limitant le signal de fluorescence aux limites sphéroïdes déterminée par le masque de fond clair (Figure 3). Extraire les mesures choisies dans plusieurs format de fichier en cliquant sur «Exporter les données».
8. Procédez à l’extraction des images et des films en sélectionnant le fichier analysé et puis sélectionnez l’option exporter des Images et des films . Deux options sont disponibles, soit « comme affiché » pour récupérer des images et des films comme vu sur le logiciel d’imagerie (images habituellement composées), soit « sauvegardé » pour récupérer les données brutes pour analyse externe par le biais de logiciels de tierce-partie.

Résultats

Comme peut être vu dans la Figure 1, il est crucial de vérifier, par cytométrie en flux, le niveau d’expression du CD19 voiture sur les lymphocytes T (Figure 1 a) et le niveau de CD19 sur des lignées cellulaires tumorales HCT116 (Figure 1 b). La figure 2 illustre le résultat d’une expérience typique sphéroïde. Les appareils d’imagerie automatisée prend des...

Discussion

L’utilisation des sphéroïdes comme un outil innovant pour valider le traitement du cancer futur est devenu un domaine d’intérêt croissant au cours des années. Sphéroïdes représentent une étape intermédiaire entre le classique 2D analyse in vitro et in vivo évaluation. La méthode plus détient beaucoup de promesse concernant leur puissance en termes de tumeur micro-environnement imitant ainsi que du gène⁷de profilage. Le protocole présenté dans cette publication est une adaptatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience