L’incitation et l’évaluation d’un modèle murin de la myopie expérimentale

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons le processus complet de lunettes de vue myopie expérimentale chez la souris à l’aide de l’incitation nouvellement conçue et la technique nécessaire pour la réalisation des résultats stables et reproductibles dans la mesure des paramètres oculaire.

Résumé

Modèle murin de la myopie peut être un outil puissant pour la recherche de la myopie à cause de la manipulation génétique relativement facile. Une façon d’inciter la myopie chez les animaux est de mettre clairement moins les verres devant les yeux pendant des semaines (induite par la lentille myope, LIM). Cependant, les protocoles existants d’incitation et d’évaluation varient d’un laboratoire à. Ici, nous avons décrit une méthode très pratique et reproductible pour induire des lunettes LIM chez la souris à l’aide nouvellement conçu. Les correctifs de méthode permet à la lentille stablement en face de l’oeil de la souris tout en la lentille à être enlevé pour le nettoyage ou topique drug administration. Le phénotype est robuste et efficace, et la variance est faible. La méthode décrite ici peut être appliquée à des souris juste après le sevrage qui prolonge la durée possible des expériences. Nous avons également donné technique conseille d’obtenir des résultats reproductibles en réfraction et mesure la longueur axiale. Nous espérons que le protocole étape par étape décrit ici et l’article détaillé peut aider les chercheurs à réaliser des expériences de myopie avec une myopie plus fluide et rendre les données comparables dans l’ensemble de laboratoires.

Introduction

La prévalence de la myopie a considérablement augmenté récemment, alors que le mécanisme de son apparition et la progression sont encore largement inconnu¹. Le phénotype le plus caractéristique de la myopie est l’allongement de la longueur axiale (AL), ce qui augmente le risque de complications rétiniennes ou même cécité². Pour mieux comprendre la pathogénie de la myopie et de développer des traitements efficaces, des modèles animaux robustes et myopes et évaluation de phénotype stable sont nécessaires.

En bref, deux méthodes existent pour induire des États myopes chez les animaux : forme-privation myopie (FDM) et myopie induite par l’objectif (LIM)³. Les premiers diffuseurs devant le œil des endroits ou sutures la paupière pour obscurcir l’image, ce qui influe sur le développement normal de le œil, ce qui entraîne un phénotype myopie. Les derniers endroits moins lentilles devant le œil pour déplacer le point focal derrière la rétine. La rétine détecte le déplacement de l’accent et s’allonge le globe oculaire pour réaligner la rétine et le point focal. Pour FDM, après que la paupière est fermée ou le diffuseur a été fixé devant le œil, presque aucun entretien supplémentaire n’est nécessaire. Pour LIM, la lentille doit être enlevé pour le nettoyage afin du pour maintenir transparent. Ainsi, FDM est relativement facile d’être induit sur le plan technique. Cependant, les mécanismes de FDM et LIM sont différents, et quelle méthode imite la myopie chez l’homme est mieux encore en débat³. Un des points forts de LIM est le phénotype plus fort comparé à FDM, au moins dans le cas des souris⁴.

Les animaux qui ont été utilisées pour induire la myopie incluent poussins⁵singes⁶, musaraignes d’arbre⁷, cochons d’Inde⁸et souris⁴. Compte tenu de la possibilité de manipulation génétique, des anticorps disponibles abondantes et faible coût d’élevage, souris aurait pu être le premier choix comme le modèle animal de la myopie. Toutefois, par rapport aux autres grands animaux, fixation des lentilles ou diffuseurs devant le œil de la souris est relativement difficile, surtout pour les jeunes souris tels que droit après le sevrage. Pour les expériences nécessitant l’administration de médicaments topiques ou mesures provisoires yeux multiples, il faut aussi de l’image soient amovibles. Un autre défi est le petit changement morphologique du globe oculaire de souris, qui a besoin de techniques sophistiquées et dispositifs à évaluer. A ce jour, différents induisant et mesurer les protocoles utilisés dans les équipes de recherche différentes rendent difficile de comparer et de répéter les résultats à travers des laboratoires. Un protocole standard avec précision est nécessaire.

Des travaux précédents décrit plusieurs méthodes pour résoudre les lentilles ou les diffuseurs devant le œil de souris, tels que collage⁹, couture¹⁰ et lunette visiocasques cadre^11,12. Nous avons combiné l’exist visiocasques jumelles technics^11,12,13 avec notre cadre nouvellement conçu pour élaborer un protocole d’induire pour induire une myopie expérimentale robuste et efficace chez les souris. Le protocole peut être appliqué à des souris jeunes peu après le sevrage au 21e jour (p21). Nous avons également optimisé les processus d’évaluation stable et précise des phénotypes, y compris la réfraction et AL. Nous espérons que ce protocole normalisé peut aider à faire les souris myopes un modèle plus facilement accessible pour la recherche de la myopie.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique sur la recherche d’Animal de la Keio University School of Medicine ont adhéré à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux en ophtalmique et Vision Research, les lignes directrices sur l’expérimentation animale à Keio L’université et la recherche de l’Animal : Reporting de In Vivo des expériences (arrivée) lignes directrices pour l’utilisation des animaux en recherche.

1. assembler les lunettes pour les souris

1. Préparer les pièces nécessaires pour assembler les lunettes (Figure 1 a). Pour chaque souris, préparer tous les éléments suivants : cadre de bâton une tête-monté en nylon, un supérieur et un titane inférieur, deux lentilles avec des pouvoirs appropriés selon le but de l’expérience, une vis de taille M1.4 avec la longueur de 10 mm, un écrou de vis de taille M1.4, une plaine rondelle pour vis taille M1.4 avec l’épaisseur de 0,3 mm et deux bouts d’ongle artificiel (Table des matières).
   Remarque : Deux types de cadres existent avec des hauteurs différentes. Pour une souris, un cadre supérieur et un châssis inférieur sont utilisés comme un ensemble. Les cadres supérieurs doivent être mises au-dessus des niveaux inférieurs afin de créer les champs de vision symétrique. Montures et lentilles sont spécialement conçus et fabriqués par le groupe de recherche des auteurs. Ils sont disponibles en contactant les auteurs correspondantes du présent article. Autres pièces se trouvent dans les magasins de détail outil.
2. Assembler le cadre pour le œil droit et gauche séparément.
   1. Organiser la pointe de l’ongle pour faire face à la direction de l’extérieur pour atteindre le meilleur effet protecteur. Ajustez l’angle entre la pointe de l’ongle et le cadre à environ 130° pour éviter de masquer le champ de vision de souris (Figure 1 b). Respecter les conseils de l’ongle artificiel à l’armature à l’aide de colle cyanoacrylate.
      NOTE : Bouts d’ongle peuvent aider à protéger la lentille de rayer de la souris. La direction de la pointe de l’ongle doit être opposée parce que le cadre supérieur et le cadre inférieur sont utilisés pour le œil droit et le œil gauche, respectivement.
   2. Attendre au moins 12 heures laisser la colle sécher complètement, puis utilisez un coupe-ongles pour ajuster la forme de l’ongle conseils d’environ 1 cm × 1 cm en coupant et en coupe.
   3. Respecter l’objectif à l’armature à l’aide de colle cyanoacrylate. Mettez la lentille sur le cadre à la main et tenir le cadre horizontalement. Injecter de la colle cyanoacrylate, entre le bord de la lentille et laissez la propagation adhésive par la tension superficielle.
      NOTE : La colle va éroder la lentille et influencer sa transparence, alors assurez-vous que l’adhésif ne fait qu’effleurer la partie périphérique de la lentille. Utiliser lentille de plano 0 dioptrie (D) en tant que contrôle et moins objectif pour induire la myopie. L’effet de différentes puissances de moins de lentilles (–10 D à –50 D) a été décrit ailleurs⁴. Afin de maximiser l’incitation de la myopie, lentille-30 D est recommandé pour induire la myopie. FDM peut également être induite avec le même dispositif simplement en changeant la lentille dans le capuchon de microtubes de 1,5 mL comme le diffuseur.
3. Serrer la vis dans le manche en nylon ainsi que la rondelle du côté plat du bâton. Préparer les lunettes et les bâtons avant l’expérience respectivement et stocker pour une utilisation ultérieure (Figure 1C).
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

2. les mesures de la réfraction et de la Baseline de l’AL.

1. Appliquer une goutte d’agent mydriatique contenant 5 mg/mL tropicamide et chlorhydrate de phényléphrine 5 mg/mL de chaque côté du globe oculaire pour dilater la pupille. Attendez au moins 5 min avant l’anesthésie générale.
   NOTE : Dilater la pupille sous général anesthésie provoquera la cataracte réversible qui influe sur la mesure par la suite. Toujours dilater la pupille avant l’anesthésie générale et attendre au moins 5 min. Une goutte (environ 0,05 mL) de l’agent mydriatique suffit pour dilater la pupille de l’oeil de la souris, tandis que l’agent plus ne fera aucun mal aux étapes suivantes.
2. Mettez la souris sous anesthésie générale. Saisir la peau en arrière de la souris doucement pour empêcher la souris de heurter ses yeux jusqu'à ce qu’il est complètement anesthésié. Juger la profondeur de l’anesthésie générale est suffisant si la souris ne se déplace pas quand il est mis sur la table librement.
   Remarque : Une combinaison de midazolam (40 μg/100 μL), médétomidine (7,5 μg/100 μL) et de butorphanol tartrate (50 μg/100 μL) est utilisée ici pour une anesthésie générale chez les souris avec un volume d’injection intrapéritonéale de 0,01 mL/g. En général, moins de 5 min sont nécessaires pour les souris à s’endormir. Longue durée de l’anesthésie générale entraîne une température corporelle basse et ralentissement du rythme cardiaque. Pour éviter l’influence potentielle de l’anesthésie générale à la mesure, finition toutes les mesures dans les 10 min après l’injection d’anesthésique est recommandé. Le butorphanol fourni dans le cocktail anesthésique fournissent environ 4 heures de l’analgésie. Bonne recette pour l’anesthésie générale peut différentes institutions.
3. Mesurer la réfraction de le œil de la souris à l’aide d’un photorefractor infrarouge^4,9,14. Ajuster la direction de l’un des yeux souris pour garder la première image de Purkinje dans le centre de la pupille et mesurer la réfraction le long de l’axe optique. Après la mesure, mesurer l’oeil opposé avec les mêmes procédures (Figure 2 a).
   Remarque : La valeur mesurée pour la réfraction est fortement influencée par la position de l’oeil de la souris le long de l’axe optique. S’assurer que la première image de Purkinje est alignée au sein de ± 3 degrés du centre de la pupille. Le workbench du système domaine spectral optical cohérence tomographie par SD-peut être utilisé pour un ajustement de l’orientation de l’élève en réfraction mesures⁴.
4. Mesurer l’AL de l’oeil de la souris à l’aide d’un système de SD-OCT^4,15,16. Définir l’AL comme la distance entre le sommet cornéen à la limite plus brillants près du nerf optique (Figure 2 b).
   NOTE : Semblable à la mesure de la réfraction, l’AL est fortement influencé par la direction de l’oeil de la souris. Le sommet cornéen peut être confirmé par la réflexion de ponctuelles sur la surface de la cornée. La limite de la partie de la rétine seront très floue au point de nerf optique. Ajuster la direction un peu pour que la limite soit assez clair pour la mesure, mais pas trop loin du nerf optique.

3. fixation du châssis sur le crâne de souris.

1. Appliquer une goutte de 0,1 % purifiée sodium hyaluronate collyre pour prévenir le dessèchement sur chaque œil.
   NOTE : Collyre sur la surface de le œil va influencer les valeurs de réfraction et les mesures de longueur axiale. Ne pas utiliser le collyre après l’anesthésie jusqu'à ce que toutes les mesures sont effectuées.
2. Le menton de la souris anesthésié, mettez sur une pente d’argile ou quoi que ce soit peut être utilisé comme un oreiller pour faire le plan initial du crâne être horizontale.
3. Stériliser les cheveux et le cuir chevelu entre les oreilles et les yeux à l’aide de coton tige avec l’éthanol à 70 %.
4. Couper la peau entre les oreilles et les yeux pour exposer le crâne pour environ 0,8 cm² à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Utilisez la gravure dentaire liquide et coton tampon pour éliminer le périoste. Stériliser les ciseaux chirurgicaux et pince à épiler avec de l’éthanol 70 % avant l’intervention de chaque souris.
   Remarque : Tondre le cheveux et porter des gants stériles peuvent être nécessaires.  Vérifiez les dispositions du comité de protection des animaux concernés avant cette procédure. Dans la plupart des cas, le liquide de l’eau-forte dentaires se trouvent comme l’une des pièces jointes dans le système adhésif dentaire autopolymérisable. Si le liquide de l’eau-forte dentaire n’est pas disponible, utilisez l’éthanol à 70 %.
5. Assembler un ensemble d’images sans lentille pour aider à fixer le bâton sur la bonne position. Mettre les images sur la tête de la souris. Ajustez soigneusement la position des images pour s’assurer que les deux yeux sont dans le milieu de l’image vide.
6. Utilisez un système adhésif dentaire autopolymérisable pour fixer le bâton sur la tête de la souris. Veillez à ne pas laisser le liquide de l’écoulement de système collez dans l’oeil de la souris.
   Remarque : La méthode pour utiliser le système adhésif dentaire autopolymérisable est différente entre les produits. Se référer aux instructions du fabricant avec soin.
   Attention : Certains des réactifs dans le système adhésif dentaire peuvent être toxiques.
7. Attendre environ 5 min et enlever le cadre et l’écrou avec soin sans changer la position de la baguette (Figure 3 a).
8. Injecter le chlorhydrate d’atipamézole 0,75 mg/kg par voie intrapéritonéale pour aider la souris à la récupération de l’anesthésie plus rapidement. Placez la souris dans une cage individuelle jusqu'à ce que complètement guéri. N’abandonnez pas la souris jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Le protocole peut être suspendu ici.

4. ouverture de l’Induction de la myopie et de l’entretien par la suite

1. Attendez au moins 24 heures après la chirurgie pour laisser la souris guérissent complètement de l’anesthésie. Saisir le manche et mettre sur les cadres avec des lentilles. L’incitation débute à ce point dans le temps (Figure 3 b).
   Remarque : Afin de minimiser l’inconfort lors de la reprise de l’anesthésie et donner suffisamment de temps pour le système adhésif dentaire à coaguler, il est fortement recommandé de mettre sur le cadre après que les souris complètement récupéré de l’anesthésie. Le ciment résine du système adhésif couvrira entièrement la Coupe du cuir chevelu. Par conséquent, aucun traitement post-opératoire spécifique n’est nécessaire pour prévenir les infections et atténuer la douleur post-chirurgicale. Juste après la première fois de mettre sur le châssis, souris seront plus conscients de l’existence de la lentille et beaucoup de le rayer. Le comportement brut sera de retour à la normale après quelques heures. Les souris avec des lentilles peuvent être conservés avec la même densité pour les souris normales.
2. Retirez le cadre et nettoyer des lentilles et des bouts d’ongle avec des tampons de coton au moins deux fois par semaine pour conserver la transparence de la lentille.
   Remarque : Il n’est pas nécessaire de mettre la souris sous anesthésie pour enlever et mettre sur le châssis. Fournir un support pour les souris, de siéger, plutôt que d’avoir à les accrocher tout en travaillant avec eux pourrait réduire la détresse.
   1. Si une mesure provisoire est nécessaire, mettez la souris sous anesthésie et mesurer la souris comme décrite précédemment. L’incitation peut être poursuivie après la récupération de l’anesthésie de la souris.
3. Nettoyer la cage au moins deux fois par semaine.
   Remarque : Cette aide à maintenir la clarté de l’objectif. Mettre un filet entre la souris et le fond de la cage à filtrer les déchets alimentaires peut-être également être utile.
4. Surveiller la masse corporelle et le comportement brut. Comparez avec le même âge souris intacts au cours du processus d’ensemble expérimental.
   NOTE : À l’exception de certains comportements se gratter, aucune variation significative, y compris le poids du corps ne se trouve entre les souris d’expérience avec les souris non traitées.

Résultats

At a tout d’abord, vérifiez si toutes les pièces nécessaires sont préparés (Figure 1 a). Un exemple d’un morceau de lunettes assemblés est illustré dans la Figure 1 b. À l’exception de la partie principale des cadres et l’écrou, toutes les autres pièces sont jetables pour chaque souris. Un ensemble de lunettes dûment remplis est montré dans la Figure 1C. Changer l’angle entre le...

Discussion

Pour s’assurer que les lunettes à fixer solidement sur la tête de la souris, plusieurs étapes dans le présent protocole doivent être accordé une grande attention. Le périoste doit être retiré complètement avant d’utiliser le système adhésif dentaire. Le sang sur le crâne doivent également être nettoyé avec soin. Un peu fine tuning est acceptable tout de suite après l’application de l’adhésif, ne déplacez pas le bâton fréquemment avant le système adhésif sèche vers le haut. Suivez les instr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan