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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole détaille les étapes, les coûts et équipements nécessaires pour générer des e. coli-extraits cellulaires de base et mettre en œuvre en vitro réactions de synthèse de protéines dans les 4 jours ou moins. Pour tirer parti de la souplesse de cette plate-forme pour les applications larges, nous discutons des conditions de réaction qui peuvent être adaptées et optimisées.

Résumé

Au cours des 50 dernières années, la synthèse de protéine acellulaire (CFPS) est devenue une technologie puissante pour exploiter la capacité transcriptionnelle et translationnelle des cellules dans un tube à essai. En évitant la nécessité de maintenir la viabilité de la cellule et en éliminant la barrière cellulaire, PFC a été fondamentale aux applications émergentes en biofabrication de protéines traditionnellement difficiles, ainsi que des applications de prototypage rapide pour génie métabolique et la génomique fonctionnelle. Nos méthodes de mise en œuvre d’un e. coli-plateforme PFC permettre à nouveau aux utilisateurs d’accéder à bon nombre de ces applications. Nous décrivons ici les méthodes pour préparer l’extrait par l’utilisation de milieux enrichis, flacons déroutés et une méthode reproductible de la lyse cellulaire de base sonication accordable. Cet extrait peut ensuite servir pour l’expression de la protéine capable de produire 900 µg/mL ou plus de la protéine fluorescente de super dossier vert (sfGFP) dans seulement 5 h de montage expérimental à l’analyse des données, étant donné que les stocks de réactifs appropriés ont été préparés préalablement. Le coût estimatif de démarrage d’obtenir des réactifs est $ 4 500 qui soutiendront des milliers de réactions à un coût estimatif de 0,021 $ par µg de protéines produites ou 0,019 $ par µL de réaction. En outre, les méthodes d’expression de protéine en miroir la facilité de l’installation de réaction vue dans les systèmes disponibles dans le commerce grâce à l’optimisation des mélanges réactifs, à une fraction du coût. Afin de permettre à l’utilisateur de tirer parti de la souplesse de la plate-forme de produits forestiers certifiés pour des applications larges, nous avons identifié les divers aspects de la plate-forme qui peut être à l’écoute et optimisé selon les ressources disponibles et des résultats d’expression de protéine vous le souhaitez.

Introduction

Synthèse de protéine acellulaire (CFPS) a émergé comme une technologie qui a débloqué un certain nombre de nouvelles opportunités pour la production de protéines, génomique fonctionnelle, génie métabolique et plus encore dans les derniers 50 ans1,2. Par rapport à la norme en vivo plates-formes expression de protéine, CFPS offre trois avantages principaux : 1) la nature acellulaire de la plate-forme permet la production de protéines qui seraient potentiellement toxiques ou étrangers à la cellule3,4 ,5,6; 2) inactivation de l’ADN génomique et la mise en place d’un modèle d’ADN codant le gène d’intérêt canaliser toute l’énergie systémique au sein de la réaction à la production des ou des protéines d’intérêt ; et 3) la nature ouverte de la plate-forme permet à l’utilisateur de modifier et de surveiller les conditions de la réaction et la composition en temps réel7,8. Cet accès direct à la réaction prend en charge l’augmentation des systèmes biologiques avec des chimies élargis et conditions redox pour la production de nouvelles protéines et l’accordage des processus métaboliques2,9, 10. direct access permet également l’utilisateur de combiner la réaction de PFC avec tests d’activité dans un système single-pot des cycles de conception-construction-test plus rapide11. La capacité à effectuer la réaction de PFC dans les gouttelettes de faible volume ou sur appareils sur papier plus soutient les efforts de découverte de haut débit et de prototypage rapide12,13,14,15 ,,16. À la suite de ces avantages et de la nature de plug-and-play du système, CFPS unique a permis à une variété d’applications de biotechnologie telles que la production de protéines qui sont difficilement soluble express en vivo17, 18,19,20, détection des maladies21,22,23, sur demande la biofabrication18,24 ,25,26,27et l’éducation28,29, qui montrent la flexibilité et l’utilité de la plate-forme acellulaire.

Systèmes de PFC peuvent provenir d’une variété de lysats bruts de deux lignées de cellules procaryotes et eucaryotes. Cela permet diverses options dans le système de choix, chacun d'entre eux ont des avantages et inconvénients selon l’application des intérêts. Systèmes de CFPS varient également considérablement en productivité, coût et temps de préparation. Le plus couramment utilisé cellule extraits sont produites à partir de germe de blé, réticulocytes de lapin, des cellules d’insecte et cellules d’Escherichia coli , cette dernière étant la plus efficace à ce jour tout en produisant le meilleur rendement volumétrique de la protéine30 . Alors que les autres systèmes de PFC peuvent être avantageux pour leurs machines de modification post-traductionnelle innée, nouvelles applications à l’aide de l' e. coli-machines basé sont en mesure de combler le fossé en générant relativement phosphorylée et protéines glycosylées sur demande31,32,33,34,35.

Réactions de PFC peuvent être exécutées dans chaque lot, échange continu acellulaire (CECF) ou acellulaire (CFCF) formats de flux continu. Le format de lot est un système fermé, dont vie de réaction est limitée en raison de la diminution des quantités de réactifs et l’accumulation des sous-produits inhibiteurs de la réaction. Méthodes CECF et CFCF augmentent la durée de vie de la réaction et ainsi entraînent des rendements de protéine volumétrique accrue par rapport à la réaction de lot. Ceci est accompli en autorisant les sous-produits de la synthèse protéique à être retiré de la cuve de réaction alors que nouveaux réactifs sont fournis tout au long de la réaction2. Dans le cas de la CFCF, la protéine d’intérêt peut également être retirée de la chambre de réaction, tandis que dans la CECF, la protéine d’intérêt demeure dans la chambre de réaction, composé d’une membrane semi-perméable36,37. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour surmonter les piètres rendements volumétriques de difficile-à-express des protéines d’intérêt38,39,40,41,42, 43. Les difficultés à mettre en œuvre les approches CECF et CFCF sont que 1) alors qu’ils se traduire par une utilisation plus efficace des machines bio responsable de la transcription et la traduction, ils exigent notamment de plus grandes quantités de réactifs, ce qui augmente le coût global et 2) ils nécessitent des configurations plus complexes de réaction et d’équipements spécialisés par rapport à la lot format44. Afin d’assurer l’accessibilité pour les nouveaux utilisateurs, les protocoles décrits se concentrer sur le format de traitement par lots à des volumes de réaction de 15 µL avec des recommandations précises pour augmenter le volume de réaction à l’échelle de millilitre.

Les méthodes présentées ici permettent profanes avec des compétences de laboratoire de base (telles que les étudiants de premier cycle) à mettre en œuvre la croissance cellulaire, extrait préparation et format réaction configuration de lot pour un e. coli-système de PFC. Cette approche est rentable par rapport aux kits disponibles dans le commerce sans sacrifier la facilité d’installation basé sur kit de réaction. En outre, cette approche permet aux applications en laboratoire et sur le terrain. Lorsque vous décidez de mettre en œuvre des produits forestiers certifiés, nouveaux utilisateurs devraient évaluer soigneusement l’efficacité des systèmes d’expression de protéine conventionnelle pour l’investissement de démarrage, comme le PFC n’est peut-être pas supérieure dans tous les cas. Les méthodes CFPS décrites ici permettent à l’utilisateur d’appliquer directement une variété d’applications, y compris la génomique fonctionnelle, haut débit stable, la production de protéines qui sont insolubles pour in vivo de l’expression, mais aussi de champ applications, y compris les biocapteurs et trousses pédagogiques pour la biologie synthétique. Des applications supplémentaires, tels que l’ingénierie métabolique, tuning des conditions d’expression de protéine, détection de la maladie et mesurent-vers le haut à l’aide des méthodes CECF ou CFCF sont toujours possibles mais peuvent exiger l’expérience avec la plateforme PFC pour une modification supplémentaire de la réaction conditions. Nos méthodes de conjuguer croissance en milieux enrichis et flacons déroutés, et des méthodes relativement rapides et reproductibles de la lyse cellulaire par le biais de la sonication, suivie d’une configuration de réaction CFPS simplifiée qui utilise des prémélanges optimisé45. Même si les méthodes de croissance cellulaire ont devenu quelque peu normalisées dans ce domaine, procédés de lyse cellulaire varient considérablement. En plus de la sonication, les méthodes de lyse courantes sont utilisation d’une presse Français, un homogénéisateur, batteurs de perle, ou lysozyme et autres perturbations biochimiques et physiques méthodes46,47,48, 49. à l’aide de nos méthodes, environ 2 mL d’extrait cellulaire brut sont obtenus par 1 L de cellules. Cette quantité d’extrait cellulaire peut prendre en charge quatre cents réactions de CFPS 15 µL, chaque producteur ~ 900 µg/mL de protéine sfGFP journaliste du plasmide de modèle pJL1-sfGFP. Cette méthode coûte $ 0,021/µg de sfGFP produit ($.019/µL de réaction), à l’exclusion du coût du travail et des équipements (la Figure 1). À partir de l’éraflure, cette méthode peut être implémentée en 4 jours par une seule personne et répétez les réactions PFC peuvent être complétées en heures (Figure 1). En outre, le protocole peut être transposé en volume pour les plus gros lots de préparation du réactif aux besoins de l’utilisateur. Ce qui est important, le protocole présenté ici peut être implémenté par laboratoire formé profanes tels que les étudiants de premier cycle, comme elle exige seulement des compétences du laboratoire de base. Les procédures décrites ci-dessous et la vidéo qui l’accompagne ont été spécifiquement développés pour améliorer l’accessibilité de la plate-forme de PFC d’e. coli pour une utilisation large.

Protocole

1. médias préparation et croissance cellulaire

  1. Jour 1
    1. Cellules d’Escherichia coli BL21*(DE3) Streak d’un glycérol stock sur une gélose LB et incuber pendant au moins 18 h à 37 ° C.
    2. Préparer 50 mL de médias LB et stériliser la solution sur un cycle de liquid pendant 30 minutes à 121 ° C. Conserver à température ambiante.
  2. Jour 2
    1. Préparer 750 mL de 2 x YTP médias et 250 mL de 0,4 M de D-Glucose solution comme indiqué dans les informations supplémentaires.
    2. Versez les 2 médias de la x YTP dans une fiole dérouté stérilisés à l’autoclave de 2,5 L et la solution de D-Glucose dans une bouteille en verre stérilisés à l’autoclave de 500 mL. Autoclave les deux solutions selon un cycle de liquide pendant 30 minutes à 121 ° C.
    3. Veiller à ce que les deux solutions stériles sont stockées à 37 ° C si la croissance cellulaire est effectuée le jour suivant, afin de maximiser les taux de croissance après l’inoculation. Ne pas combiner des solutions avant l’inoculation.
      Remarque : Les Solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant 1-2 d si nécessaire, bien que les médias x YTP 2 est très sujette à la contamination.
    4. Démarrer une culture nuitée de BL21 (de3) en inoculant 50 mL de médias LB avec une seule colonie de BL21 (de3) à l’aide d’une boucle stérilisé et stérile pour éviter toute contamination.
    5. Placer les 50 mL de la culture BL21*(DE3) LB dans un 37 ° C 250 tr/min, secouant incubateur et croître durant la nuit pendant 15 à 18 h.
    6. Préparer et stériliser tout le matériel nécessaire pour les jours 3 et 4, y compris : deux bouteilles de centrifugeuse 1 L, 4 tubes de coniques de froid 50 mL x (poids et masses records de trois) et nombreux microtubes de 1,5 mL.
  3. Jour 3
    1. Retirer la culture nuit 50 mL de BL21*(DE3) dans des livres de l’incubateur agitateur et mesurer l' OD600 sur un spectrophotomètre à l’aide d’un 01:10 dilution avec LB media. Calculer le volume d’une culture nécessaire d’ajouter à 1 L de médias pour un départ de l’OD600 de 0,1 (par exemple, si un OD600 d’un 01:10 dilution est lu comme 0,4, inoculer 25 mL de la non dilué de l’OD600 = 4,0 culture nuit dans 1 L de 2 x YTP G).
    2. Sortir les chauffée 2 x YTP les médias et les solutions de D-Glucose de l’incubateur de 37 ° C ainsi que les 50 mL de culture LB. Utilisant une technique stérile, verser délicatement la solution de D-Glucose dans les médias x YTP 2 (en évitant les côtés du ballon dérouté).
      Remarque : L’Addition de D-Glucose termine la recette pour 1 L de 2 x YTPG.
    3. Maintien technique stérile, ensemencer le 1 L de solution de 2 x YTPG avec la quantité appropriée de la culture de 50 mL pour commencer la culture de 1 L à un 0.1 OD600. Placer immédiatement la culture 1 L inoculés dans un 37 ° C, agitation incubateur à 200 tr/min.
    4. Prendre la première OD600 lecture après la première heure de croissance (phase de latence typique prend 1 h). Ne pas diluer la culture. Continuer à prendre des mesures OD600 environ toutes les 20-30 min OD600 jusqu'à 0,6.
    5. En arrivant à OD600 = 0,6, ajouter 1 mL de 1 M IPTG (concentration finale dans la culture de 1 L = 1 mM) à la culture de x YTPG 2.
      NOTE : Induction idéal OD600 est 0,6 ; Toutefois, une fourchette de 0,6 à 0,8 est acceptable. L’induction de l’IPTG est pour la production endogène de T7 RNA polymérase (T7RNAP).
    6. Après l’induction, mesurer l' OD600 environ toutes les 20-30 min jusqu'à ce qu’il atteigne 3.0.
      Remarque : Le refroidissement le centrifuger à 4 ° C pendant cette période. Préparer le tampon S30 froid comme il est indiqué dans les informations complémentaires. Si la mémoire tampon S30 est préparée à l’avance, veiller à ce que la TNT n’est pas ajoutée jusqu’au jour d’utilisation.
    7. Une fois que l' OD600 atteint 3,0 (Figure 2 a), versez la culture dans une bouteille de centrifugeuse 1 L froid dans un bain d’eau glacée. Préparer une bouteille de centrifugeuse 1 L rempli d’eau d’un poids égal à utiliser comme un équilibre dans la centrifugeuse.
      NOTE : Valeurs d’Absorbance varient de l’instrument-à-instrument. Alors que l' OD600 de récolte de BL21 (de3) n’est pas une variable sensible, il est recommandé que l’utilisateur évaluer et optimiser cette variable mesure de dépannage. Spectrophotomètres plus susceptible lectures de600 OD relativement faibles par rapport aux plus petits spectrophotomètres axée sur la cuvette.
    8. Centrifuger les bouteilles de 1 L pendant 10 min à 5 000 x g et 10 ° C à granules des cellules.
    9. Lentement de décanter le liquide surnageant et la jeter conformément aux procédures des déchets biologiques de l’institution. Placez la pastille sur la glace.
    10. À l’aide d’une spatule stérile, gratter le culot de la bouteille de la centrifugeuse et le transférer dans un tube conique froid 50 mL.
    11. Ajouter 30 mL de tampon de S30 froid dans le tube conique et resuspendre le culot cellulaire au vortex avec saccades (20-30 s) et de périodes de repos (1 min) sur la glace jusqu'à ce que complètement remises en suspension avec aucun morceaux.
    12. Une fois que le culot est resuspendu pleinement, utiliser un autre tube conique de 50 mL avec de l’eau comme un équilibre et une centrifugation pendant 10 min à 5000 x g et 10 ° C (préalablement refroidi à 4 ° C).
      Remarque : Ceci termine le 1st 3 lavages nécessaires lorsqu’ils pêchent les cellules.
    13. Versez le liquide surnageant et la jeter conformément aux procédures des déchets biologiques de l’institution. Resuspendre le culot avec 20-25 mL de froid S30 mémoire tampon et centrifuger pendant 10 min à 5 000 x g et 10 ° C (préalablement refroidi à 4 ° C).
      Remarque : Ceci termine 2ème de 3 lavages.
    14. Encore une fois, versez le liquide surnageant et la jeter conformément aux procédures des déchets biologiques de l’institution. Ajouter exactement 30 mL de tampon de S30 et vortex à nouveau à resuspendre le culot.
    15. En utilisant les 3 tubes coniques pré-pesés, froid 50 mL et une pipette sérologique avec une pipette stérile, aliquote 10 mL du mélange tampon pellet/S30 resuspendues dans chacun des 3 tubes coniques.
      NOTE : Fractionner les cellules en 3 tubes n’est pas nécessaire, mais cette étape se traduit par petites boulettes de cellule (~ 1 g) pour une commodité accrue à des étapes ultérieures.
    16. Centrifuger tous les tubes, à l’aide de balances appropriées selon les besoins, pendant 10 min à 5000 x g et 10 ° C (préalablement refroidi à 4 ° C).
      Remarque : Ceci termine l’étape de lavage final.
    17. Versez le liquide surnageant et la jeter conformément aux procédures des déchets biologiques de l’institution. Enlever l’excès de tampon S30 en essuyant soigneusement l’intérieur du tube à fond conique et boucher avec un tissu propre ; Évitez de toucher le culot.
    18. Réévaluer les tubes sur une balance analytique et noter le poids de granule final sur chaque tube.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade. Les pellets peuvent être flash congelés dans l’azote liquide et stockées à-80 ° C pendant un an jusqu’au moment de la préparation de l’extrait.

2. préparation d’extrait cellulaire brut - jour 4

  1. Pour la préparation de l’extrait, garder les cellules froid sur la glace au cours de chaque étape. Ajouter 1 mL de tampon de S30 froid par 1 g de masse cellulaire de la pastille. Veiller à ce que le dithiothréitol (DTT) a été complété au tampon S30 à une concentration finale de 2 mM.
    Remarque : Le refroidissement la microcentrifugeuse à 4 ° C pendant cette période.
  2. Resuspendre le culot cellulaire au vortex avec saccades (20-30 s) et de périodes de repos (1 min) sur la glace jusqu'à ce que complètement remises en suspension. Si remise en suspension est difficile, laisser les boulettes sur la glace pendant 30 min décongeler.
  3. Transfert de 1,4 mL de cellules resuspendues dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
  4. Placer un tube de 1,5 mL contenant 1,4 mL de cellules resuspendues dans un bain d’eau glacée dans un bécher. Laisser agir pendant 45 s sur suivie de 59 s éteint pendant 3 cycles totales, avec une amplitude fixée à 50 %. Fermer et retourner les tubes à mélanger doucement pendant les périodes d’arrêt. Au total, livrer 800-900 J d’énergie dans chaque tube de microtubes de 1,5 mL contenant 1,4 mL de cellules resuspendues (Figure 3 a et 3 b).
    Remarque : Cette étape est sensible au type sonicateur et le modèle utilisé et doit être optimisé si le matériel est différent de celui indiqué pour cette procédure. Deux approches complémentaires peuvent être utilisés pour intensifier la quantité d’extrait préparé au cours de cette étape : 1) multiples microtubes de 1,5 mL peuvent être sonication en parallèle, et/ou 2) plus gros volumes peuvent être sonication en tubes coniques (jusqu'à 15 mL de cellule remise en suspension par tube) , mise à l’échelle de la quantité d’énergie fournie comme décrit précédemment, 29,45.
  5. Immédiatement après que sonication est terminée, ajouter 4,5 µL de 1 M DTT (complétant un TNT supplémentaires de 2 mM) dans le 1,4 mL de lysat et inverser plusieurs fois pour mélanger. Placer le tube sur la glace. Répétez les étapes 2.4 et 2.5 pour les tubes supplémentaires de cellules resuspendues avant de procéder à une centrifugation.
  6. Microcentrifugeuse échantillons à 18 000 x g et 4 ° C pendant 10 min (Figure 3).
  7. Pipeter le surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Ne pas déranger le culot ; Il est préférable de laisser certaines surnageant pour maintenir la pureté qu’afin de perturber le culot dans les efforts pour maximiser le rendement.
  8. Incuber le surnageant de l’étape précédente à 250 tr/min et 37 ° C pendant 60 min par du ruban adhésif les tubes sur la plateforme vibrante de l’incubateur (c’est la réaction de ruissellement).
  9. Microcentrifugeuse échantillons à 10 000 x g et 4 ° C pendant 10 min.
  10. Retirez le surnageant sans déranger le culot et le transférer dans un nouveau tube. Créer plusieurs 100 µL d’extraits d’extrait pour le stockage.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, et l’extrait peut être flash congelés dans l’azote liquide et stockées à-80 ° C pendant jusqu'à une année jusqu'à ce que nécessaire pour les réactions de la PFC. Au moins 5 cycles de gel-dégel peuvent subir sans que cela nuise pour extraire la productivité (Figure 4).

3. synthèse des proteines acellulaires lot Format réactions

  1. Dégel Solutions une et B ADN modèle, BL21 (de3) extrait (si surgelés), T7RNAP et une partie aliquote d’eau moléculaire de catégorie.
    Remarque : Modèle de réaction CFPS se trouvent dans les Informations complémentaires. Recettes des solutions A et B sont fournis dans les Informations complémentaires et correspondent à des concentrations spécifiques pour nombreux réactifs soutenir le système d’énergie de PANOx-SP basé de PFC. Le rôle de chaque réactif et la variation acceptable dans ces concentrations de réactif qui peut prendre en charge des produits forestiers certifiés ont été déterminés50. Un protocole de purification T7RNAP se trouvent dans les informations complémentaires51. T7RNAP supplémentaire peut augmenter le rendement volumétrique mais n’est pas nécessaire si la T7RNAP est induite au cours de la croissance cellulaire. Matrice d’ADN de plasmide (pJL1-sfGFP) peut être préparé à l’aide d’un kit maxiprep avec deux lavages à l’aide du tampon de lavage dans le kit, suivi d’un post-traitement ADN-nettoyage à l’aide d’un kit de purification de PCR (Figure 2 b). Matrices d’ADN linéaires utilisable également dans les réactions de la PFC.
  2. L’étiquette la quantité nécessaire de microtubes nécessaire pour les réactions de la PFC.
    Remarque : Les réactions peuvent être réalisées dans différentes tailles de bateau, mais un petit vaisseau peut diminuer les rendements volumétrique de protéine (Figure 2). Amplifier une réaction dans le même récipient de taille peut-être également réduire les rendements volumétriques, en fonction de la diminution de l’échange d’oxygène, due à une diminution du volume rapport surface. Lors de l’augmentation de volume de réaction au-dessus de 100 μL, il est recommandé d’utiliser le fond plat plats 31,37,52.
  3. Ajouter 2,2 µL de la Solution A, 2,1 µL de Solution B, 5 µL de BL21*(DE3) extrait, 0,24 μg de T7RNAP (concentration finale 16 μg/mL), 0,24 ng de la matrice d’ADN (concentration finale de 16 ng/mL) et eau pour porter le volume final à 15 µL.
    NOTE : Vortex Solutions A et B fréquemment lors de l’installation de réaction pour éviter la sédimentation des composants et faire en sorte que chaque réaction reçoit une homogène aliquote de chaque solution. Éviter l’agitation l’extrait, plutôt inverser le tube pour mélanger.
  4. Après que tous les réactifs ont été ajoutées à la réaction, mélanger chaque tube en pipette verticalement ou doucement l’agitation tout en veillant à ce que le mélange réactionnel final est combiné en un seul cordon 15 µL au bas du tube de microtubes de 1,5 mL.
  5. Placer chaque réaction dans l’incubateur à 37 ° C sans agiter pendant 4 h ou 30 ° C durant la nuit.
    NOTE : Réactions réussies peuvent être qualitativement évaluées visuellement basé sur la couleur verte du produit sfGFP dans le mélange réactionnel de PFC (Figure 3D). Expression de la protéine d’intérêt peut également être confirmée par SDS-PAGE (la Figure 2).

4. dosage de la protéine de journaliste, [sfGFP]

  1. Charger 48 µL de 0,05 M HEPES, pH 8, dans chaque bien nécessaire pour la quantification (effectuée en général en trois exemplaires par tube de réaction).
  2. Supprimer les réactions de l’incubateur. Pipette de haut en bas pour mélanger chaque réaction, puis transférer 2 µL de réaction dans les 48 µL de 0,05 M HEPES, pH 8. Pipette de haut en bas, à nouveau dans le puits pour mélanger.
  3. Une fois que toutes les réactions sont chargées et mélangées, placer la plaque 96 puits dans le fluorimètre et mesurer la fluorescence de point de terminaison sfGFP.
    Nota : Les longueurs d’onde d’Excitation et d’émission pour la quantification de fluorescence sfGFP sont 485 nm et 510 nm, respectivement.
  4. À l’aide d’une courbe d’étalonnage générée précédemment, déterminer le [sfGFP] d’après les relevés de fluorescence obtenue.
    NOTE : Instructions pour générer la courbe d’étalonnage de concentration de sfGFP contre l’intensité de la fluorescence sont fournies dans les informations complémentaires (supplémentaire Figure 3). Les utilisateurs devront établir une courbe d’étalonnage pour leur instrument, étant donné que la sensibilité de l’instrument peut varier.

Résultats

Nous avons présenté une sonication basée sur e. coli extrait protocole de préparation qui peut être effectué sur une période de quatre jours, avec la Figure 1 montrant la ventilation procédurale au cours de chaque journée. Il n’y a malléabilité aux étapes qui peut être accomplie chaque jour avec différents points de suspension, mais nous avons trouvé ce flux de travail la plus efficace d’exécuter. En outre, les granules cellulaire...

Discussion

La synthèse protéique acellulaire est devenue une technologie puissante et propice pour une variété d’applications allant de la biofabrication de prototypage rapide de systèmes biochimiques. L’ampleur des demandes est pris en charge par la capacité à contrôler, manipuler et d’augmenter la machinerie cellulaire en temps réel. En dépit de l’impact grandissant de cette technologie de plate-forme, adaptation large est restée lente en raison des nuances techniques dans la mise en œuvre des méthodes. Grâc...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Remerciements

Auteurs tient à remercier Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher et Tony Turretto pour le support technique, Wesley Kao, Layne Williams et Christopher Hight pour discussions utiles. Auteurs reconnaissent également de financement du projet de loi et Linda Frost fonds, centre pour les Applications de la biotechnologie Chevron biotechnologie appliquée recherche subvention de dotation, Cal Poly recherche, savantes, et programme de subvention des activités créatives (RSCA 2017), et la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconnaît les subventions supérieures de l’Université California état. MCJ reconnaît l’Army Research Office W911NF-16-1-0372, National Science Foundation accorde MCB-1413563 et MCB-1716766, l’armée de l’Air recherche laboratoire centre d’Excellence Grant FA8650-15-2-5518, la subvention de l’agence défense menace la réduction HDTRA1-15-10052/P00001, la David and Lucile Packard Foundation, le programme d’enseignant-chercheur de Camille Dreyfus, le ministère de l’énergie BER Grant DE-SC0018249, le programme de sciences humaines de frontières (RGP0015/2017), la subvention ETOP DOE Joint Genome Institute, et le Consortium biomédicale de Chicago avec prise en charge par les fonds de Searle à la Chicago Community Trust pour la prise en charge.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs

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