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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, les auteurs rapportent une in vitro de cellules B au modèle de différenciation de cellules de plasma.

Résumé

Plasmocytes (PCs) sécrètent de grandes quantités d’anticorps et se développent à partir des cellules de B qui ont été activés. SCP est rares cellules localisées dans la moelle osseuse ou de la muqueuse et assurent l’immunité humorale. En raison de leur faible fréquence et de l’emplacement, l’étude de la SCP est difficile chez l’homme. Nous avons signalé un B PC modèle de différenciation in vitro à l’aide de certaines combinaisons de cytokines et l’activation des molécules qui permettent de reproduire la différenciation des cellules séquentielles survenant in vivo. Dans ce modèle in vitro, mémoire des cellules B (MBCs) permet de différencier en pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts PCs (PBs), au début et enfin, dans la longue durée de vie avec un phénotype PCs, fermer à leurs homologues chez les individus sains. Nous avons construit également un libre accès bioinformatique outils pour analyser les informations principales de données LGE liées à la différenciation de PC. Ces ressources peuvent être utilisées pour étudier les humain B à la différenciation de PC et dans la présente étude, nous avons étudié la régulation de l’expression génique des facteurs épigénétiques pendant B humaine à la différenciation de PC.

Introduction

La différenciation des cellules B à plasmocytes (PCs) est essentielle à l’immunité humorale et protéger l’hôte contre l’infection1. B à la différenciation de la PC est associée à des changements majeurs dans la capacité de la transcription et le métabolisme pour accueillir à la sécrétion d’anticorps. Les facteurs de transcription qui contrôlent B à la différenciation de PC ont été largement étudiées et révélées réseaux exclusifs y compris spécifiques PC et B transcription factors (TFs)2. Dans les cellules de B, PAX5, BCL6 et BACH2 TFs sont les gardiens des lymphocytes B identité2,3. Induction IRF4, PRDM1 , codant pour BLIMP1 et XBP1 PC TF va éteindre les gènes de cellules B et induire une coordonnée sécrétant des anticorps cellule programme transcriptionnel3,4,5. Ces changements de transcriptional coordonnés sont associés à Ig gènes transcription activation avec un passage de la forme liée à la membrane à la forme sécrétée des immunoglobulines chaîne lourde2,3, 4. B à la différenciation de la PC est lié à l’induction de gènes impliqués dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi fonctionne concomitante avec l’activation de la protéine dépliée réponse (UPR) connue pour jouer un rôle clé dans le PC en accueillant la synthèse de sécrétion d’immunoglobulines6,7. Le TF XBP1 joue un rôle majeur dans cette adaptation cellulaire8,9,10.

Les cellules B et les PC est des acteurs clés de l’immunité humorale. Comprendre le biologique des processus qui contrôlent la production et la survie des cellules de plasma normales est essentiel dans les interventions thérapeutiques qui doivent assurer des réponses immunitaires efficaces et empêcher l’auto-immunité ou un déficit immunitaire. PC sont des cellules rares avec les premiers stades de différenciation se déroulant dans des lieux anatomiques qui entravent la caractérisation biologique complet, en particulier chez l’homme. À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, nous avons rapporté un B in vitro au modèle de différenciation de PC. Ce modèle reproduit la différenciation cellulaire séquentielle et la maturation qui se produisent dans les différents organes en vivo11,12,13. Dans un premier temps, les cellules B mémoire sont activés pendant quatre jours par CD40 ligand, oligodeoxynucleotides et cytokines combinaison et se différencient en preplasmablasts (PrePBs). Dans un second temps, preplasmablasts sont amenées à se différencier en plasmablasts (PBs) en supprimant la stimulation CD40L et oligodeoxynucleotides et changer la combinaison de cytokine. Dans une troisième étape, les plasmablasts sont induites à se différencier dans les premiers PC en changeant la cytokine combinaison11,12. Une quatrième étape a été introduite pour obtenir la pleine maturités PCs en cultivant ces premiers PCs avec milieu de la moelle osseuse des cellules stromales conditionnés ou sélectionné des facteurs de croissance,13. Ces PC mature pourrait survivre plusieurs mois in vitro et sécrètent des quantités élevées d’immunoglobuline (Figure 1). Fait intéressant, notre modèle in vitro récapitule les modifications de transcriptional coordonnées et le phénotype du B différent stades de PC qui peuvent être détectées in vivo11,12,13,14 ,,15. PC sont des cellules rares et notre modèle de différenciation in vitro permet d’étudier les humain B à la différenciation de PC.

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Protocole

Le protocole suit les directives conformément à la déclaration d’Helsinki et l’accord du Centre hospitalier de l’Université de Montpellier pour les ressources biologiques.

1. dans le modèle de différenciation pour le plasmocyte Vitro normale

Remarque : SCP est générés par une culture de quatre étapes11,12,13.

  1. Différenciation et l’amplification de lymphocytes b
    1. Utiliser des cellules du sang périphérique chez des volontaires sains pour mémoire purification de cellules B.
    2. Diluer 7,5 mL de sang par 24,5 mL du milieu RPMI 1640.
    3. Ajouter 12,5 mL de gradient de densité de température ambiante (par exemple, gradient de Ficoll) dans un tube conique stérile de 50 mL. Doucement, superposer le gradient de densité avec les 32 mL de sang dilué. Réduire au minimum le mélange des deux phases.
    4. Centrifuger 20 min à 500 x g avec le frein au large. Recueillir les PBMC de l’interface gradient de densité du plasma dilué/et placer les cellules dans un tube stérile de 50 mL et compléter jusqu'à 45 mL avec la solution saline équilibrée de Hank.
    5. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. Avec précaution, retirez le surnageant et garder le diabolo.
    6. Ajouter 45 mL de sérum de veau foetal RPMI1640/10% (FCS) et centrifuger 5 min à 500 x g. Avec précaution, retirez le surnageant et garder le diabolo. Ajouter 30 mL de FCS PBS/2%.
    7. Supprimer CD2 + des cellules à l’aide de billes magnétiques anti-CD2. Ajouter 4 perles pour cellule une seule cible. Incuber 30 min à 4 ° C.
      1. Cellules séparées de perle-bondissent des cellules non liés à l’aide d’un aimant pour la demande de séparation de cellules. Prélever des cellules non liés et laisser incuber le culot cellulaire avec anti CD19 APC et anti anticorps CD27 PE 15 minutes à 4 ° C (2 µL d’anticorps de 106 cellules).
      2. Laver deux fois dans le sérum de chèvre PBS/10%.
      3. Supprimer les événements contaminantes sur les parcelles les FSC et SSC. Tracer les maillots sur FSC-A vs FSC-H et SSC-A vs QUE SSC-H parcelles pour enlever les débris et de sélectionner la population totale de leucocytes. Sélectionnez les cellules mémoire B CD19/CD27 et CD19+CD27+.
      4. Purifier MBCs à l’aide d’un trieur de cellules avec une pureté de 95 %.
    8. Effectuez toutes les étapes de la culture à l’aide de FCS IMDM et 10 %, additionné de 50 mg/mL 5 mg/mL et transferrine humaine l’insuline humaine.
    9. Plaque purifiée MBCs en plaques 6 puits culture (1,5 x 105 MBCs/mL à 5 mL/puits), pendant 4 jours, avec IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) et IL-15 (10 ng/mL).
      1. Ajouter Phosphorothioate CpG ODN 2006, histidine-étiquetée recombinante humaine CD40L solubles (sCD40L ; 50 ng/mL) et anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) pour l’activation de MBCs (Figure 1). Activation par sCD40L ou ODN seulement avec la même cocktail de cytokine cède à plus faible amplification12. La combinaison des signaux d’activation décrite ici au plomb pour le nombre maximal d’activé les cellules B et PrePBs11,12 (Figure 1).
      2. Pour le profil d’expression génique, purifier CD38 /CD20–– PrePBs, au jour 4, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).
  2. Génération de cellules plasmablastique
    1. Au jour 4, compter les cellules.
    2. Cellules de plaques en plaques de culture de 12 puits à 2,5 x 105/ml à 2 mL/puits.
    3. Induire la différenciation par l’enlèvement des oligonucléotides CpG et sCD40L et ajout d’un nouveau milieu de culture avec une cytokine nouveau cocktail dont IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) et IL-15 (10 ng/mL) (Figure 1). Cellules en culture pendant 3 jours (du 4 au jour 7) à 37 ° C.
    4. Pour le profil d’expression génique, purifier CD38+/CD20– PBs, au jour 7, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).
  3. Première génération de cellules de plasma
    1. Au 7e jour, compter les cellules.
    2. Assiette de cellules dans des boîtes de culture 12-puit à 5 x 105/ml à 2 mL/bien.
    3. Différencier les PB dans les premiers PC à l’aide de milieu de culture fraîche à l’IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) et IFN-α (500 U/mL) pendant 3 jours à 37 ° C. Pour le profil d’expression génique, purifier CD20–/CD38+/CD138+ PC précoce, au jour 10, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).
  4. Génération de longue durée de vie des cellules de plasma
    1. Se différencient PCs précoce en PCs a longtemps vécus en changeant les conditions de culture.
    2. Culture de cellules dans des boîtes de culture 12-puit à 5 x 105/ml à 2 mL/bien ou en plaques 24 puits culture dans 1 mL/bien à 37 ° C, à l’aide d’IL-6 et des cellules stromales conditionné medium et avril (200 ng/mL).
    3. Obtenir stromal milieu conditionné par cellule en cultivant des cellules stromales pendant 5 jours avec milieu de culture. Filtrer le surnageant de culture de cellules stromales (0,2 µm) et congeler.
    4. Ajouter 50 % des médias de conditionnées en cellules stromales aux cultures de PC avec renouvellement chaque semaine. Généré PCs de longue durée de vie pourraient être maintenus pour mois13. La survie à long terme de PC pourrait être obtenue avec l’IL-6 et avril uniquement comme signalé13.
    5. Sécrétion d’Ig mesure de cytométrie tri PCs.
    6. La culture de PCs à 106 cellules/mL pendant 24 h et récolter le surnageant de culture. Mesurer les IgG et IgA, à l’aide humaine enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) trousses11,12,13. La sécrétion d’IgG médiane, varie de 10 pg/cellule/jour à 10 à 17 pg/cellule/jour à jour 6013.

2. moléculaire Atlas de B à la différenciation de PC

Remarque : Nous avons construit un accès commode et outils bioinformatiques pour extraire et visualiser les informations principales de données Affymetrix GEP associées à PC différenciation (GenomicScape)15. GEP sont accessibles au public de base de données ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) y compris purifiée MBCs, PrePBs, PBs et EPCs : E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 et E-MEXP-3034 et BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape est un outil Internet disponible gratuitement.

  1. Sélection de B au dataset de PC
    1. Sélectionnez B au dataset de PC dans le menu de Parcourir les données dans l’outil de bioinformatique de libre accès GenomicScape (http://www.genomicscape.com) appelé les cellules B humaines de plasma. Visualisation du profil d’expression génique de gènes unique ou une liste de gènes est disponible à l’aide de l’outil d’Expression-Coexpression rapport dans les Outils d’analyse disponibles dans la page d’accueil.
  2. Analyse sous surveillance et analyse en composantes principales (PCA)
    1. Sélectionnez Analysis Tools | webSAM pour charger l’outil SAM.
    2. Choisir le dataset les cellules B humaines de plasma , puis sélectionnez les groupes d’échantillons à comparer.
    3. Utiliser les différents filtres disponibles pour appliquer les options de filtrage d’intérêt.
    4. Pour comparer les profils d’expression génique avec outil de SAM, modifier les options de filtrage y compris changement de pli, nombre de permutations, taux de fausse découverte et le type de comparaison. GenomicScape va calculer l’analyse et de fournir des gènes différentiellement exprimés entre groupes sélectionnés.
    5. Exécuter l’analyse en composantes principales en sélectionnant Analyse en composantes principales dans le menu Outils de l’analyse .
    6. Choisir le dataset les cellules B humaines de plasma , puis sélectionnez les groupes d’intérêt.
    7. Coller une liste de gènes d’intérêt ou de certains gènes selon la variance. Pour coller une liste de gènes, sélectionnez analyser une liste de gènes/Ncrna, cliquez ici... Genomicscape calculera PCA qui pourrait être visualisé et téléchargé.

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Résultats

La procédure globale de différenciation in vitro de PC normale est représentée dans la Figure 1. En utilisant le protocole présenté ici, nous pourrions produire une quantité suffisante de cellules qui ne peut pas être obtenu avec ex vivo des échantillons humains. Bien que le rôle du réseau complex de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation de PC a été étudié, les mécanismes qui régissent les principaux réseaux de transc...

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Discussion

Chez l’homme, PC sont rares cellules avec des stades de différenciation qui ont lieu dans des endroits anatomiques qui entravent la caractérisation biologique complet. Nous avons développé un B in vitro au modèle de différenciation de PC à l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes où les différentes combinaisons de molécules d’activation et de cytokines sont appliquées par la suite afin de reproduire la différenciation des cellules séquentielles qui se produisent dans la différents organes/t...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de Français INCA (Institut National du Cancer) Institut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) et ITMO Cancer (MM & TT).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD2 magnetic beadsInvitrogen11159D
Anti-CD138-APCBeckman-Coulter B49219
Anti-CD19-APCBD555415
Anti-CD20-PBBeckman-Coulter B49208
Anti-CD27-PEBD555441
Anti-CD38-PEBeckman-Coulter A07779
Anti-histidineR&D SystemsMAB050
CpG ODN(PT)SigmaT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human TransferinSigma-AldrichT3309
IFN-αMerckIntron A
IMDMGibco31980-022
Recombinan Human CD40L-hiR&D Systems2706-CL
Recombinant Human APRILR&D Systems5860-AP-010
Recombinant Human IL-10R&D Systems217-IL-
Recombinant Human IL-15Peprotech200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D Systems202-IL-
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06

Références

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