Identification des substrats de Kinase CK2 roman en utilisant une approche biochimique polyvalente

Résumé

L’objectif de ce protocole est à étiqueter, enrichir et identifier les substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex tel qu’un lysat cellulaire ou l’homogénat tissulaire. Cette méthode s’appuie sur des aspects uniques de la CK2 biologie à cet effet.

Résumé

L’étude des relations de kinase-substrat est essentielle pour avoir une compréhension complète des fonctions de ces enzymes et leurs cibles en aval dans les États physiologiques et pathologiques. CK2 est une kinase de sérine/thréonine évolutivement conservés avec une liste croissante de centaines de substrats impliqués dans plusieurs processus cellulaires. En raison de ses propriétés pléiotropes, identifier et caractériser un ensemble complet de substrats CK2 a été particulièrement difficile et reste un obstacle à l’étude de cette enzyme importante. Pour relever ce défi, nous avons élaboré une stratégie expérimentale polyvalente qui permet l’enrichissement ciblée et identification des substrats de CK2 putatifs. Ce protocole tire parti de la spécificité unique double co-substrat de CK2 permettant thiophosphorylation spécifique de ses substrats dans une cellule ou un tissu lysat. Ces substrats protéiques sont ensuite alkylées, immunoprécipitée et identifié par liquide chromatography/tandem la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Nous avons déjà utilisé cette approche pour identifier avec succès des substrats CK2 de Drosophila ovaires et ici nous étendre l’application du présent protocole aux cellules de glioblastome humain, illustrant la capacité d’adaptation de cette méthode pour étudier la rôles biologiques de cette kinase dans divers organismes modèles et systèmes expérimentaux.

Introduction

Protéines kinases sont des éléments clés des cascades de transduction de signal. La phosphorylation des protéines substrat de ces enzymes suscite des réactions biologiques qui régissent les événements critiques contrôlant la division cellulaire, métabolisme et la différenciation, entre autres. CK2 est une exprimée de façon ubiquitaire, acidophiles sérine/thréonine kinase qui est conservé de la levure à l’homme et qui joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, allant de la régulation transcriptionnelle de progression du cycle cellulaire à l’apoptose^{1 ,2,3}. L’enzyme est un hétérotétramère composé de deux α catalytique (ou α') sous-unités et deux de sous-unités β réglementaire⁴. En plus d’être hautement pléiotrope, CK2 présente deux autres caractéristiques inhabituelles qui compliquent l’analyse, à savoir l’activité constitutive⁵ et co-substrat double spécificité⁶. Cette dernière propriété CK2, dote de la capacité d’utiliser GTP comme ATP pour la phosphorylation de protéines substrats.

Délétion génétique des sous-unités catalytiques ou réglementaires de CK2 chez la souris entraîne la létalité embryonnaire indiquant qu’elle joue un rôle crucial lors du développement et de l’organogénèse^7,8. CK2 est également surexprimé dans plusieurs types de cancer et représente donc un prometteur cible thérapeutique^9,10,11. En effet, des inhibiteurs spécifiques cette activité cible de la kinase CK2 sont actuellement sous enquête pour ce but^12,13,14. Alors que l’inhibition de la CK2 est une option viable, étant donnée sa nature pléiotropique, alternative et peut-être une approche plus rationnelle consisterait à cibler des substrats CK2 critiques qui sous-tendent la progression de certains cancers. Par conséquent, l’identification complète et la caractérisation de protéines substrats CK2 serait un bénéfice notable pour élucider l’ou les fonctions spécifique de cette kinase dans un type particulier de tissu ou une tumeur.

Nous décrivons ici une méthode biochimique polyvalente pour l’identification des substrats CK2 auprès d’un échantillon biologique complex comme une cellule ou un tissu lysat. Ce protocole tire parti de la spécificité du double co-substrat de CK2 par utilisation de l’analogue de GTP GTPγS (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) qui ne peuvent pas utiliser les autres kinases endogènes. Cela permet effectivement de la kinase à « étiqueter » ses substrats au sein de cet échantillon subséquentes d’isolement et d’identification.

Protocole

Remarque : Assurez-vous que le matériel requis est disponibles et correctement préparé (voir Table des matières).

1. préparation

1. Lyse mécaniquement échantillon de tissu (1-2 mg de tissu dans 100 µL de tampon de lyse, tableau 1) ou cultivé des cellules (plaque de 10 cm qui est confluente de 80 à 90 % dans 350 µL de tampon de lyse), l’objectif étant de recueillir un total de 900 µL de l’échantillon pour l’expérience. Notez que ce volume est en léger excès de ce qui est nécessaire pour l’expérience décrite ci-dessous.
2. Tournez en bas les échantillons par centrifugation à 17 500 x g pendant 3 minutes à 4 ° C. Une fois terminé, transférer 270 µL du liquide surnageant dans chacun des trois nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,7 mL. Il y aura environ 90 µL restant. Enlever 40 µL à être utilisé comme un « contrôle d’entrée » et le place dans un nouveau tube. Placez tous les échantillons sur la glace.

2. analyse de kinase : thiophosphorylation et alkylation

1. Identifier les trois tubes contenant 270 µL de chaque comme suit : « kinase rxn », « GTPγS seulement », et « PNBM (mésylate de p-nitrobezyl) seulement ». Préparer les réactions de la kinase.
   1. Au tube « kinase rxn », ajouter 2,7 µL (équivalent à 1 350 U) de CK2, puis ajouter 2,7 µL de 2,5 mM GTPγS.
   2. Au tube « GTPγS seulement », ajouter 2,7 µL de 2,5 mM GTPγS et puis ajouter 2,7 µL de tampon de lyse.
   3. Au tube « PNBM seulement », ajoute 5,4 µL de tampon de lyse. Mettez tous les tubes pour mélanger et ensuite placer immédiatement sur la glace.
2. Incuber tous les trois tubes pendant 1 min dans un bain d’eau de 30 ° C. Après l’incubation, ajouter 13,5 µL de 12 mg/mL de PNBM à tous les trois tubes. Inverti pour mélanger les échantillons. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 1 h.
3. Après le début de l’incubation à l’étape 2.2, préparer les colonnes dessalement dès que possibles car le processus prend environ 45 min.

3. préparation du dessalage des colonnes

1. Préparer au départ colonnes (3 pour cette expérience de l’exemple) en retournant chaque colonne plusieurs fois à remettre en suspension le Sephadex G-25 résine dans le tampon de stockage. Laissez la résine de régler par assemblage de chaque colonne sur un socle de pince et laissez-la reposer pendant environ 5 min.
2. Après décantation de la résine Sephadex G-25, enlever les bouchons du haut et le bas de la colonne pour laisser le tampon de stockage à vidange par gravité et ont un tube placé au-dessous de l’ouverture du bas pour recueillir le cheminement pour jeter.
3. Une fois que le tampon de conservation est épuisée, ajouter environ 2,7 mL de tampon de lyse afin d’équilibrer les colonnes. Recueillir le cheminement et le jeter. Répéter 3 fois. Suite à l’équilibrage final, les colonnes sont prêts pour l’étape 4.1.

4. Elimination des PNBM

1. Une fois les 1 h d’incubation (étape 2.2) et préparation (étape 3) de la colonne complètes, appliquer les échantillons aux colonnes. L’étiquette de chaque colonne comme suit : « kinase rxn », « GTPγS uniquement » et « PNBM seulement ». Charger l’ensemble de chaque échantillon sur sa colonne respective. Recueillir et éliminer les intermédiaires.
2. Laver les échantillons en ajoutant 420 µL de tampon de lyse dans chaque colonne. Laisser le tampon de lyse filtrer à travers la colonne et recueillir le cheminement pour jeter. Après cette étape de lavage, placer les tubes dans la position pour la collecte d’échantillons.
3. Éluer les échantillons en ajoutant 500 µL de tampon de lyse à chaque colonne. Recueillir le cheminement qui contient maintenant des thiophosphorylated et des substrats CK2 alkylés.

5. immunoprécipitation : Partie I

1. Préparer les échantillons pour l’immunoprécipitation par première suppression 80 µL pour obtenir un exemple de chacun des elutions respectifs (« kinase rxn », « GTPγS uniquement » et « PNBM seulement ») recueillies à l’étape 4.3 « contrôle d’élution d’entrée ». Après le retrait de 80 µL de chaque échantillon, il y aura environ 420 µL restant par échantillon.
   1. Diviser chaque échantillon en 2 tubes de 200 µL de chaque. Etiqueter chaque tube respective : « kinase rxn anti-thiophosphate ester », « kinase rxn IgG », « Ester d’anti-thiophosphate GTPγS », « GTPγS IgG », « Ester d’anti-thiophosphate PNBM » et « PNBM IgG ».
2. Ajouter 2,8 µg d’anti-thiophosphate ester anticorps contre chacun des tubes anti-thiophosphate ester-étiquetés et 2,8 µg d’isotype des anticorps de contrôle pour chacun des tubes IgG marquée. Placer les tubes sur un rotateur à 4 ° C pendant 2 h.
3. Débutez la préparation des billes de protéine A/G durant les dernier 15 min de la 2 h d’incubation à l’étape 5.2.

6. la protéine A/G d’agarose préparation de perle

1. Brièvement, vortex le tube de rangement pour perles sont complètement remises en suspension. Couper l’extrémité d’un P200 de pipette à l’aide d’une lame de rasoir propre afin d’augmenter la jauge grosseur. Ajouter 100 µL de la boue de perle par immunoprécipitation dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,7 mL. Pour cet exemple, un total de 6 tubes sont nécessaires.
2. Centrifuger les tubes à 17 500 g pendant 1 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et le jeter. Remettre en suspension les perles dans 200 µL de tampon de lyse et brièvement vortex. Répétez le spin et laver 3 fois les étapes.
3. Après le lavage final, placez les perles sur la glace jusqu'à la fin de l’incubation à l’étape 5.2.

7. immunoprécipitation : Partie II

1. Après le 2 h d’incubation de l’étape 5.2, tournez en bas les échantillons à 17 500 x g pendant 3 min à 4 ° C. Après centrifugation ajouter 200 µL de chaque échantillon dans les tubes avec les perles lavés. Placer les tubes sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 h.
2. Après l’incubation de 1 h, centrifuger les tubes à 17 500 g pendant 1 min à 4 ° C. Ensuite retirez 40 µL de surnageant de chaque échantillon et enregistrez sous un « contrôle de l’appauvrissement de la couche » (total 6 tubes). Enlever le reste du liquide surnageant et jeter. Prendre soin de ne pas pour déranger les perles.
3. Laver les échantillons en ajoutant 200 µL de tampon de lyse et mélangé au vortex brièvement. Puis centrifuger à 17 500 g pendant 1 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et le jeter. Répéter le lavage et essorage étapes 3 fois. Prendre soin de ne pas pour déranger les perles au cours de ces étapes.
4. Après avoir terminé les étapes de lavage, ajouter 50 µL de tampon de 2 x dans chaque échantillon contenant des perles. Pour tous les autres échantillons, ajouter 8 µL de 6 x solution tampon : « contrôle d’entrée », « contrôles d’entrée d’élution » et « l’appauvrissement contrôles ».
5. Une fois que le tampon est ajouté aux tubes, pipette de haut en bas pour mélanger et faire chauffer tous les échantillons à 95 ° C pendant 5 min avant de procéder à la SDS-PAGE.

8. analyse/Validation des résultats

1. Validez l’alkylation réussie CK2 dépendant thiophosphorylation.
   1. Pour déterminer l’efficacité de la médiation CK2 thiophosphorylation à l’étape 2.2, effectuez SDS-PAGE et éponger occidental en exécutant 15-20 µL de « élution contrôles d’entrée » recueillies à l’étape 5.1 sur un gel de polyacrylamide de 12,5 %.
   2. Sonde de membranes avec les anticorps suivants : anti-thiophosphate ester, anti-CK2α et anti-GAPDH (ou autre contrôle de chargement approprié). Si cette étape s’est déroulée, un signal d’ester renforcée anti-thiophosphate devrait être évident dans la voie de « kinase rxn » par rapport aux deux autres voies (Figure 2).
2. Visualiser des substrats putatifs enrichis de CK2 et déterminer l’identité de la protéine.
   1. Afin d’évaluer si les mesures d’immunoprécipitation ont réussi, exécutez 25-30 µL des échantillons élué de perles dans étape 7.4 sur un gel de polyacrylamide 12,5 % distinct. S’assurer que tout le matériel est propre et porter des gants en tout temps au cours de cette étape pour minimiser la contamination.
   2. Le gel avec le bleu de Coomassie tache bleu pour visualiser les protéines enrichies de différentes étapes du protocole expérimental (Figure 3). À l’aide de nouvelles lames de rasoir, soigneusement l’accise bandes uniques présentes dans la voie de « kinase rxn anti-thiophosphate ester IP », notant leurs poids moléculaires approximatifs.
   3. Soumettre ces bandes pour l’identification des protéines par liquide chromatography/tandem la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) (Figure 4). S’il existent des anticorps dirigés contre les protéines identifiées, confirmer les résultats de la spectrométrie de masse par SDS-PAGE et immunoblotting d’input, épuisés et fractions IP recueillies dans le cadre du protocole (Figure 4).

Résultats

Un diagramme schématique de la procédure expérimentale est fourni à la Figure 1. Fondement de la technique est la capacité inhabituelle de CK2 utiliser GTP pour le transfert du groupe phosphoryle. Addition d’exogène CK2 holoenzyme avec l’analogue de GTP, GTPγS, d’un lysat cellulaire conduit à thiophosphorylation de substrats endogènes de CK2. Traitement ultérieur du lysat avec l’alkylants réactif p- nitrobenzyle mésylate (PNBM) g?...

Discussion

Nous décrivons ici une méthode relativement simple et biochimique pour l’identification des substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex. Les étapes critiques du présent protocole sont basées sur les propriétés enzymatiques inhabituelles de CK2 et comprennent thiophosphorylation CK2 dépendant des protéines substrat spécifique à l’aide de GTPγS et leurs immunoprécipitation ultérieure et identification. Avec ces résultats, nous avons démontré l’utilité...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mg/mL PNBM	Abcam	ab138910	40.5 µL
2.5 mM GTPγS	Sigma-Aldrich	G8634-1MG	5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-373894	1:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32233	1:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody	Abcam	ab22758	1:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab92570	Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºC	ThermoScientific	Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436
cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor	Roche	11836170001
Lysis Buffer	See recipe below	See recipe below	30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control)	Cell Signaling Technology	2729S	Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap Column	GE Healthcare	28-9180-10	3 columns
Protein A/G Plus Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003	600 µL
Recombinant human CK2 holoenzyme	New England Biolabs	P6010S	2.7 µL
Rotator	Labnet: Mini Labroller	Mini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cells	ATCC	CRL-1690
Water bath pre-set to 30ºC	Shel Lab	H20 Bath Series Model# SWB15