Modèle de souris de deux vaisseaux Occlusion d’ischémie-reperfusion cérébrale

Résumé

Un modèle murin d’ischémie-reperfusion cérébrale est mis en place pour étudier la physiopathologie des accidents vasculaires cérébraux. Nous distalement ligaturer l’artère cérébrale moyenne droite et artère carotide commune droite et restaurer le flux sanguin après 10 ou 40 min d’ischémie.

Résumé

Dans cette étude, un modèle de souris de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCA) est utilisé pour étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale. Un modèle de souris fiable et reproductible est utile pour étudier la physiopathologie de l’ischémie-reperfusion cérébrale et de déterminer des stratégies thérapeutiques potentiels pour les patients atteints d’accident vasculaire cérébral. Variations dans l’anatomie du cercle de Willis de C57BL/6 mâles affecte leur volume d’infarctus après lésion cérébrale induite d’ischémie. Des études ont indiqué qu’occlusion distale du MCA (OACM) peut remédier à ce problème et entraîner une taille de l’infarctus stable. Dans cette étude, nous établissons un modèle de souris de deux vaisseaux occlusion d’ischémie-reperfusion cérébrale par l’intermédiaire de l’interruption de la circulation sanguine vers la droite MCA. Nous distalement ligaturer le MCA droite et artère carotide commune droite (CCA) et de restaurer le flux sanguin après une certaine période d’ischémie. Cette lésion d’ischémie-reperfusion provoque un infarctus de taille stable et un déficit comportemental. Les cellules du système immunitaires périphérique infiltrent le cerveau ischémique dans le délai de l’infiltration de 24h. En outre, la perte de neurones dans la zone corticale est moindre pour une plus longue durée de reperfusion. Par conséquent, ce modèle de deux-bateau occlusion est approprié pour étudier la réponse immunitaire et la récupération neuronale au cours de la période de reperfusion après une ischémie cérébrale.

Introduction

Le modèle de souris de l’ischémie-reperfusion cérébrale est l’une des approches expérimentales plus largement utilisés pour étudier la physiopathologie des induite par l’ischémie cérébrale lésion¹. Car l’ischémie-reperfusion cérébrale active le système immunitaire périphérique, les cellules du système immunitaires périphérique s’infiltrer dans le cerveau ischémique et causent des dommages neuronaux². Ainsi, un modèle de souris fiable et reproductible qui imite l’ischémie-reperfusion cérébrale est nécessaire pour comprendre la physiopathologie des accidents vasculaires cérébraux.

C57BL/6J (B6) souris sont la souche plus couramment utilisée dans les expériences de course car ils peuvent facilement être génétiquement manipulés. Il existe deux modèles courants d’OACM/reperfusion qui imitent la condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Le premier est le modèle de filament d’intraluminale d’OACM proximale, où il est employé un filament de silicium enduit d’occlure intravasculaire le flux sanguin dans le MCA ; le filament occlusion est ensuite supprimé pour restaurer le flux de sang³. Une durée courte occlusion entraîne une lésion de la région sous-corticale, considérant qu’une plus longue durée de l’occlusion provoque un infarctus dans les régions corticales et sous-corticales. Le second modèle est le modèle de ligature d’OACM distal, qui implique la ligature extravasculaire du MCA et CCA pour réduire la circulation sanguine par l’intermédiaire de la MCA, après quoi la circulation sanguine est rétablie par la suppression de la suture et anévrisme clip⁴. Dans ce modèle, un infarctus est causé dans les aires corticales, et le taux de mortalité est faible. Car la ligature du modèle OACM/reperfusion nécessite craniotomie afin d’exposer le site de la MCA distale, le site peut être facilement confirmé, et tente de déterminer si le flux sanguin dans le MCA distale est perturbé au cours de la procédure est simple.

B6 souris présentent des variations considérables dans l’anatomie de leur cercle de Willis ; Cela pourrait affecter le volume d’un infarctus après ischémie-reperfusion cérébrale^5,6,7. Actuellement, ce problème peut être surmonté grâce à la ligature du MCA distale⁸. Dans cette étude, nous établir une méthode d’occlusion de l’écoulement de sang MCA et permettant de reperfusion après une période d’ischémie. Deux vaisseaux occlusion du modèle d’ischémie-reperfusion cérébrale induit une ischémie transitoire du territoire MCA par ligature du MCA distale droite et droite CCA, avec débit sanguin restauré après une certaine période d’ischémie. Ce modèle OACM/reperfusion provoque un infarctus de taille stable, une grande partie de cerveau-infiltration de cellules immunitaires dans le cerveau ischémique et un déficit comportemental après ischémie – reperfusion cérébrale⁴.

Protocole

L’utilisation des comités de l’Academia Sinica et Université de médecine de Taipei et le soin des animaux institutionnelle a approuvé ce protocole pour l’utilisation des animaux d’expérimentation.

1. modèle OACM/reperfusion

1. Fournir les souris avec libre accès à l’eau et chow jusqu'à ce que la chirurgie.
2. Autoclave l’intervention chirurgicale des outils et assainir la table de chirurgie et équipements à l’aide d’éthanol à 70 %. Porter un masque chirurgical et des gants stériles. Utilisez un stérilisateur sec perle pour restériliser les outils chirurgicaux si plusieurs chirurgies de souris seront déroulera dans une expérience.
3. Anesthésier une souris âgés de 8 à 12 semaines (masse : 25 à 30 g) à l’aide d’hydrate de chloral de 0,8 %, par une injection intrapéritonéale. Assurez-vous que la souris anesthésiée n’a pas un réflexe de pédale (selon les essais à l’aide d’une pincée de pied ferme) après l’anesthetization.
4. La pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pour la souris alors qu’il est sous anesthésie.
5. Utiliser un système de tension artérielle non invasive pour surveiller la tension artérielle de la souris.
6. Utiliser un système de monitorage physiologique pour surveiller sa température rectale et les gaz du sang artériel. Maintenir la température corporelle à 36,5 ± 0,5 ° C.
7. Injecter par voie sous-cutanée la souris avec un antibiotique prophylactique (céfazoline 25 mg/kg)⁸.
8. Placez votre souris dans la position couchée sur le coussin chauffant.
9. Utiliser des tondeuses électriques pour exposer la peau en se rasant la fourrure de la souris sur la région du cou ventrale, ainsi que dans la région située entre le œil droit et l’oreille droite.
10. Utiliser la crème épilation pour effacer la fourrure du corps de la souris et de désinfecter le site chirurgical en alternance scrbus avec povidione-iode et de l’éthanol à 70 %.
11. Utiliser des ciseaux iris pour couper une incision de 1 cm de long médiane au niveau du col.
12. Forceps iris permet de disséquer attentivement la CCA contre les nerfs vagues sans causer de dommage physique.
13. Utiliser des sutures soie de 5-0 pour isoler le CCA.
14. Faire une incision de 0,3 cm du cuir chevelu au point médian entre le œil droit et l’oreille droite.
15. Utilisez microciseaux pour couper le muscle temporal pour exposer l’os zygomatique et squamosal.
16. Sous un microscope à dissection stéréo, utilisez un microforages pour créer un trou de 2 mm de diamètre directement au-dessus de la MCA distale du côté droit.
17. Ligaturer le tronc de la MCA distale de droite à l’aide d’une suture de 10-0.
18. Occlure la CCA à droite à l’aide d’un clip d’anévrisme non traumatique.
19. Après 10 ou 40 min d’ischémie, retirer le clips pour anévrisme et la suture pour restaurer le flux sanguin à la MCA et CCA.
20. Utilisez un trombone de suture pour sceller l’incision de la peau sur la tête.
21. Sceller les incisions de la peau du col utérin à l’aide d’une suture simple suivie en fermant la peau du cou avec suture ou agrafes⁹.
22. Injecter par voie sous-cutanée de buprénorphine (0,1 mg/kg) pour le soulagement de douleur⁹.
23. Maintenir la température du corps de la souris à 36,5 ± 0,5 ° C sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu’il a pleinement récupéré de l’anesthésie. Ne pas retourner l’animal qui a subi une chirurgie à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il reprend conscience suffisante.
24. Placez votre souris dans la cage autoclavée afin qu’il peut librement accéder à l’eau et chow après que elle a entièrement récupéré.

2. la coloration avec le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium

1. Anesthésier la souris avec 0,8 % d’hydrate de chloral par une injection intrapéritonéale.
2. Utilisez des ciseaux d’exploitation pour décapiter l’animal.
3. Exposer le crâne à l’aide de ciseaux iris à faire une incision dans la peau de la tête.
4. Usage d’utilisation des ciseaux pour couper la partie antérieure de l’os frontal.
5. Utiliser des iris ciseaux pour découper le crâne le long de la suture sagittale.
6. Utilisez un rongeur d’OS pour repousser le frontal et l’os pariétal et exposer le cerveau.
7. Forceps iris permet de disséquer le cerveau.
8. Utilisez une matrice de cerveau de souris et de lames de rasoir pour obtenir des tranches coronales de 2 mm.
9. Colorer les tranches de cerveau pendant 10 min à 37 ° C avec du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium 2 % (TTC) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate.
10. Rincez le cerveau 2 x avec 10 % de formol.
11. Difficulté le cerveau dans du formol 10 % à la température ambiante pendant 24 h.

3. mesure de la taille de l’infarctus

1. Organiser les sections sur une lame de plastique propre et orienter les tronçons rostral caudal.
2. Numérisez les diapositives à l’aide d’un scanner. Placez une règle métrique et assurez-vous qu’il est visible sur l’image numérisée. Retournez la diapositive et numériser le verso.
3. Calculer l’aire d’infarctus du myocarde de chaque section à l’aide de logiciels ImageJ.
   1. Ouvrez le fichier image et mettre en place l’échelle de l’image.
   2. Sélection à main levée permet de sélectionner la zone de l’infarctus.
   3. Les régions de gestionnaire d’intérêt (ROI) permet de mesurer l’aire d’intérêt.
4. Les zones d’infarctus du myocarde pour chaque section de la somme et multipliez le résultat par l’épaisseur de coupe pour estimer le volume total d’infarctus du myocarde.

4. analyse statistique

1. GraphPad Prism 6 permet de déterminer la signification statistique de Student t-test.
   Remarque : Les barres d’erreur sur les graphiques à barres représentent les erreurs-types de la moyenne (SEM).
2. Utilisation G * puissance 3.1 pour calculer la taille de l’échantillon approprié et effectuer une analyse de puissance¹⁰.

Résultats

Cette procédure OACM/reperfusion produit un infarctus cortical dans le voisinage de la MCA droite et causé un déficit comportemental. Différents niveaux de volume induite par l’ischémie du myocarde (Figure 1 aB) et la perte neuronale (Figure 1D) ont été créés dans le cortex cérébral de la zone droite de MCA à travers une augmentation de la durée de la ligature. Cette blessure OACM/...

Discussion

Le modèle de souris OACM/reperfusion est un modèle animal couramment employé pour imiter une ischémie transitoire chez l’homme. Ce modèle animal peut être appliqué à des souches de souris transgéniques et knock-out pour étudier la physiopathologie des accidents vasculaires cérébraux. Plusieurs étapes dans le protocole sont particulièrement critiques. (1) la microforages doivent être utilisé avec précaution lorsque vous créez un trou dans le crâne, par des mesures inappropriées facilement causant une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone rongeur	Diener		Friedman
Buprenorphine	Sigma	B-044
Cefazolin	Sigma	1097603
Chloral hydrate	Sigma	C8383
Dissection microscope	Nikon	SMZ-745
Electric clippers	Petpro
10% formalin	Sigma	F5304
Germinator dry bead sterilizer	Braintree Scientific
Iris Forceps	Karl Klappenecker		10 cm
Iris Scissors	Diener		9 cm
Iris Scissors STR	Karl Klappenecker		11 cm
Microdrill	Stoelting	FOREEDOM K.1070
Micro-scissors-Vannas	HEISS	H-4240	blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrix	World Precision Instruments
Non-invasive blood pressure system	Muromachi	MK-2000ST
Operating Scissors STR	Karl Klappenecker		14 cm
Physiological Monitoring System	Harvard Apparatus
Razor blades	Ever-Ready
Stoelting Rodent Warmers	Stoelting	53810	Heating pad
Suture clip	Stoelting
Tweezers	IDEALTEK		No.3
Vetbond	3M	15672	Surgical glue
10-0 suture	UNIK	NT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877