Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Résumé

Nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires. Ce dispositif permet l’analyse des réponses cellulaires aux signaux solubles dans les microenvironnements 3D avec des gradients chimioattractant définis. Les organoïdes sont meilleurs que les cellules simples à la détection des faibles entrées bruyantes.

Résumé

Diverses limitations des systèmes de culture cellulaire 2D ont suscité l’intérêt pour la culture cellulaire 3D et les plateformes d’analyse, qui imiteraient mieux la complexité spatiale et chimique des tissus vivants et imitent les fonctions tissulaires in vivo. Les progrès récents dans les technologies de microfabrication ont facilité le développement d’environnements in vitro en 3D dans lesquels les cellules peuvent être intégrées dans une matrice extracellulaire bien définie (ECM) et un ensemble défini de biomolécules solubles ou matricielles associées. Cependant, les barrières technologiques ont limité leur utilisation généralisée dans les laboratoires de recherche. Ici, nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs simples pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires dans des microenvironnements 3D avec un gradient chimioattractant défini. Nous illustrons l’utilisation de cette plate-forme pour l’analyse de la réponse des cellules épithéliales et des organoïdes aux gradients de facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance épidermique (EGF). Les gradients du FEM étaient stables dans les dispositifs pendant plusieurs jours conduisant à la formation dirigée des branches dans les organoïdes du sein. Cette analyse nous a permis de conclure que la détection de gradient collectif par groupes de cellules est plus sensible par rapport aux cellules individuelles. Nous décrivons également la méthode de fabrication, qui ne nécessite pas d’installations de photolithographie ni de techniques de lithographies douces avancées. Cette méthode sera utile pour étudier les comportements cellulaires 3D dans le contexte de l’analyse du développement et des états pathologiques, y compris le cancer.

Introduction

Dans l’environnement physiologique, les cellules sont incorporées dans une matrice extracellulaire (ECM) et exposées à une pléthore de biomolécules. Les interactions entre les cellules et le microenvironnement environnant régulent les processus intracellulaires contrôlant divers phénotypes, y compris la migration, la croissance, la différenciation et la survie^1,2. Beaucoup a été appris sur les comportements cellulaires dans une culture de cellules 2D conventionnelles. Cependant, avec l’avènement de l’imagerie intravitale et l’expérimentation de cellules incorporées dans des hydrogels 3D, des différences importantes dans les comportements cellulaires ont été reconnues dans les cultures 2D in vitro simplifiées par rapport aux environnements de tissus 3D. Alors que les cellules interagissent avec les fibres ECM et sentent leurs propriétés mécaniques dans la matrice 3D, la rigidité matérielle du gel n’est pas une variable totalement indépendante dans un système in vitro 2D. La dimensionnalité modifie la formation d’adhérence focale, ce qui entraîne une morphologie et un comportement différents des cellules. En outre, les cellules sur une surface 2D sont exposées à moins de signaux de signalisation que les cellules ouvertes à toutes les directions en 3D.

Ces limitations ont accru les intérêts pour les systèmes 3D qui représentent la complexité spatiale et chimique des tissus vivants et mieux prédire les fonctions tissulaires in vivo. Ils ont été développés sous de nombreuses formes à partir d’organoïdes comme microstructures cellulaires auto-assemblées à des cellules aléatoirement intercalées dans ECM^3,4. Les progrès récents dans les technologies de microfabrication ont facilité l’avènement de différents types de systèmes de culture 3D^5,6,7,8,9 pour l’étude des changements phénotypiques et réponses cellulaires aux signaux solubles; Cependant, les barrières technologiques limitent l’utilisation généralisée dans les laboratoires de recherche. Dans de nombreux cas, les procédés de fabrication exigent des techniques de photolithographie et des connaissances de fond pour la lithographie douce. En outre, divers facteurs doivent être contrôlés pour construire avec succès un dispositif et pour obtenir une fonction optimale de l’appareil sur une longue période de temps.

Notre méthode décrit comment construire un dispositif 3D de RPDB pour incorporer des cellules et des organoïdes multicellulaires dans un microenvironnement 3D avec des gradients chimioattractant définis, puis analyser les réponses épithéliales au FEM¹⁰. Nos données révèlent que la capacité des organoïdes à réagir aux gradients de l’EGF peu profonds découle du couplage chimique intercellulaire par des jonctions d’interstices. Il suggère le potentiel des organoïdes pour la détection plus précise des intrants faibles et bruyants spatialement classés. Le processus de fabrication ne nécessite pas d’installation de salle blanche ni de techniques de photolithographie. Cependant, le dispositif 3D de la PDA comprend les facteurs nécessaires de l’environnement physiologique 3D. Cette méthode sera utile pour étudier les comportements cellulaires 3D et il a un grand potentiel de recherche avec différents types de cellules, chimioattractants, et les combinaisons ECM.

Protocole

Tous les travaux sur les animaux ont été menés conformément aux protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux, Université Johns Hopkins, école de médecine.

1. fabrication du dispositif méofluidique

1. Concevez le masque du moule pour le dispositif de PDA à l’aide d’un logiciel de CAO 3D.
2. Imprimez le moule à l’aide d’un équipement de stéréolithographie avec une résine résistante à la chaleur.
   Remarque: les procédures décrites ici ont été effectuées par un service commercial d’impression 3D.
3. Mélanger soigneusement une solution monomère de la RPDB avec l’agent de durcissement dans un ratio de 10:1. 3 mL de mélange de RPDB était nécessaire pour la fabrication de l’appareil. Le volume total dépend du nombre de moules à fabriquer.
4. Dégazer le mélange en appliquant un aspirateur à l’aide d’un aspirateur de laboratoire interne ou d’une pompe à vide dans un dessiccateur à vide pendant 1 heure.
5. Tamponnez la surface du moule avec un ruban adhésif pour enlever la poussière, puis versez le mélange de RPDB dans le moule. Si des bulles sont introduites dans le processus, répéter le dégazage dans le dessiccateur sous vide. Les bulles piégées entre les piliers du moule peuvent être enlevées en les faisant piquer avec une aiguille pointue.
   Remarque: le processus de dégazage à température ambiante doit être effectué en moins d’une heure.
6. Guérir le RPDB en chauffant à 80 ° c pendant 2 heures. Laisser refroidir le moule à température ambiante.
7. Coupez la limite entre le moule et le RPDB avec une lame, puis épluchez soigneusement le RPDB du moule.
8. Coupez la partie de la RPDB pour qu’elle s’adapte à la lèvre de 22 mm x 22 mm et percez un trou à l’entrée.
   Remarque: le protocole peut être suspendu ici.
9. Nettoyez la partie du RPDB et la bavette de 22 mm x 22 mm en essuyant les surfaces à l’aide de tissus à faible charpie et de 70% d’éthanol. Enlevez ensuite les grosses particules de poussière en tamponnant avec un ruban adhésif.
10. Stériliser la partie de la RPDB et la lamelle soit par autoclavage (121 ° c pendant 8 minutes humides, 15 minutes sèches) ou par exposition à la lumière UV pendant 1 heure.
11. Traitez la surface inférieure de la partie de la RPDB et le feuillet de recouvrement avec le pistolet de décharge corona pendant 5 min dans le capot de culture de tissu et puis les liant ensemble.
    ATTENTION: posez tout matériau non conducteur tel que la mousse de polystyrène sur le fond et enlevez tous les matériaux de conduite pendant ce processus. Injecter du collagène dans l’appareil immédiatement, dans les 5 minutes, après le traitement pour augmenter la liaison entre le gel de collagène et la Coverslip de verre.

2. préparation des cellules: isolement mammaire primaire organoïde

NOTE: les détails de l’isolement mammaire organoïde peuvent être trouvés dans un travail précédent¹¹. Tout type de cellule unique ou organoïde peut être préparé selon leurs propres protocoles d’isolement/détachement.

1. Hachez le tissu de la glande mammaire des souris avec un scalpel jusqu’à ce que le tissu se détend et le secouer pendant 30 min à 37 ° c dans 50 mL de solution de collagénase/trypsine (10 mL par souris) dans DEME/F12 additionné de 0,1 g de trypsine, 0,1 g de collagénase , 5 mL de FBS, 250 μL de 1 μg/mL d’insuline et 50 μL de 50 μg/mL de gentamicine.
2. Centrifuger la solution de collagénase/trypsine à 1 250 x g pendant 10 min. Enlever le surnageant par aspiration. Disperser les cellules dans 10 mL de DMEM/F12 et centrifuger à 1 250 x g pendant 10 min. Après avoir enlevé le DMEM/F12 par aspiration, Resuspendre les cellules dans 4 mL de DMEM/F12 supplémentés avec 40 μL de DNase (2 unités/μL).
3. Agiter la solution DNase à la main pendant 2-5 min, puis centrifuger à 1 250 x g pendant 10 min.
4. Séparer les organoïdes des cellules individuelles par quatre centrifugations différentielles (impulsion à 1 250 x g et arrêter la centrifugeuse 3-4 s après avoir atteint la vitesse prévue). Entre chaque impulsion, aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de DMEM/F12.
5. Re-suspendre le culot final dans la quantité désirée de milieu de croissance de DMEM/F12 avec 1% de pénicilline/streptomycine et 1% d’insuline-transferrine-sélénium-X pour la préparation de collagène.

3. préparation et injection de collagène

Remarque: d’autres types de gels ECM peuvent être préparés selon leurs propres protocoles de gélification.

1. Préparer la solution de collagène de type I (3,78 mg/mL), 10x DMEM, solution de NaOH 1 N, milieu de croissance normal sur glace.
   Remarque: conserver sur la glace jusqu’à la fin de la procédure.
2. Ajouter 6 μL de solution de NaOH à 1 N, 200 μL de milieu de croissance et 50 μL de 10x DMEM dans un tube de microcentrifugation préréfrigérée et mélanger soigneusement la solution.
3. Ajouter 425 μL de collagène dans la solution prémélangée et mélanger soigneusement par pipetage.
4. Centrifugez brièvement le mélange de collagène (moins de 5 secondes) pour séparer et retirer les bulles du mélange.
5. Maintenez la solution de collagène neutralisée sur la glace pendant 1 heure pour induire la formation de fibres.
6. Ajouter 50 μL de suspension cellulaire dans le mélange de collagène et mélanger soigneusement.
   NOTE: la concentration finale de collagène est de 2 mg/mL.
7. Injecter la solution à l’aide de 200 μL de pipettage à travers l’entrée du dispositif de RPDB jusqu’à ce que toute la chambre soit remplie. Si le mélange de collagène déborde dans les interstices des piliers, découpez l’excès de gel de collagène avec une lame chirurgicale pointue après gelation.
8. Maintenir l’appareil dans l’incubateur à 37 ° c avec 5% de CO₂ pendant 1 heure pour induire la gelation.
9. Remplissez les réservoirs des deux côtés avec un milieu de croissance et conservez l’appareil dans l’incubateur à 37 ° c avec 5% de CO2 jusqu’à ce que l’imagerie confocale soit exécutée.

4. imagerie 3D et quantification

1. Installer une chambre de culture d’imagerie à cellules vivantes sur un microscope confocale et prérégler la température et le CO₂ à 37 ° c et 5%, respectivement. Pour obtenir de l’humidité, ajouter de l’eau dans le réservoir de la chambre et placer les lingettes humides dans la chambre si nécessaire.
2. Placer le dispositif de la RPDB dans la chambre et ajouter le FEM à l’un des réservoirs en tant que «source» du FEM dans la formation de gradient. L’autre réservoir servira un «évier» nécessaire au développement de la distribution du FEM classée spatialement. 2,5 nM de FEM a été ajouté dans l’évier pour faire le gradient de 0,5 nM/mm dans cette étude.
3. Définissez la plage de Z-Stack couvrant le volume des organoïdes d’intérêt et démarrez l’imagerie.
   ATTENTION: pour éviter la phototoxicité, essayez une intensité laser plus faible en imagerie confocale ou utilisez des techniques d’imagerie multi-photons.
4. Reconstruire une image 3D à partir de piles d’images 2D en utilisant soit un logiciel commercial ou un programme sur mesure. Mesurez la longueur et l’angle des branches s’étendant des organoïdes ou la migration des cellules individuelles. Ici, effectuer la quantification en dessinant un contour à main levée autour du corps organoïde en utilisant ImageJ.

Résultats

Le FEM est un régulateur essentiel de la morphogenèse ramification dans les glandes mammaires et un chimioattractant critique guidant la migration des cellules épithéliales du sein dans la croissance invasive du cancer. Nous avons utilisé les dispositifs fluidiques mésoscopiques décrits ci-dessus pour étudier la réponse des cellules aux gradients de FEM définis (figure 1a, B)¹⁰. L’appareil produit une zone ...

Discussion

La fabrication de moules de PDA a été réalisée à l’aide d’un service commercial d’impression 3D, mais peut également être réalisée par une imprimante 3D haut de gamme en interne. Parmi les différentes méthodes de fabrication 3D, la stéréolithographie est recommandée pour la génération de moules haute résolution. Étant donné que la polymérisation du RPDB se produit à une température élevée (80 ° c), les matériaux doivent être suffisamment résistants thermiquement, ce qui devrait être exp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935