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Résumé

Les effets trans et multigénérationnels des produits chimiques persistants sont essentiels pour juger de leurs conséquences à long terme sur l'environnement et sur la santé humaine. Nous fournissons de nouvelles méthodes détaillées pour étudier les effets trans et multigénérationnels en utilisant le nématode caenorhabditis elegans.

Résumé

L'information sur les toxicités des produits chimiques est essentielle à leur application et à la gestion des déchets. Pour les produits chimiques à faibles concentrations, les effets à long terme sont très importants pour juger de leurs conséquences sur l'environnement et sur la santé humaine. En démontrant des influences à long terme, les effets des produits chimiques au fil des générations dans des études récentes fournissent de nouvelles perspectives. Ici, nous décrivons des protocoles pour étudier des effets des produits chimiques sur plusieurs générations utilisant le nématode libre Caenorhabditis elegans. Deux aspects sont présentés : (1) les études d'effets multigénérationnels (TG) et (2) multigénérationnelles, dont cette dernière est séparée des études d'effet multigénérationnels (MGE) et multigénérationnelles résiduelles (MGR). L'étude sur l'effet TG est robuste dans un but simple pour déterminer si l'exposition chimique aux parents peut entraîner des conséquences résiduelles sur la progéniture. Une fois que les effets sont mesurés sur les parents, des solutions d'hypochlorite de sodium sont utilisées pour tuer les parents et garder la progéniture afin de faciliter la mesure de l'effet sur la progéniture. L'étude sur l'effet TG est utilisée pour déterminer si la progéniture est affectée lorsque son parent est exposé aux polluants. L'étude d'effet MGE et MGR est systématique pour déterminer si l'exposition générationnelle continue peut entraîner des réponses adaptatives chez les enfants au fil des générations. Le ramassage et le transfert soigneux sont utilisés pour distinguer les générations afin de faciliter la mesure de l'effet sur chaque génération. Nous avons également combiné des protocoles pour mesurer le comportement de locomotion, la reproduction, la durée de vie, les changements biochimiques et d'expression génique. Quelques exemples d'expériences sont également présentés pour illustrer les études d'effets trans et multigénérationnels.

Introduction

L'application et la gestion des déchets de produits chimiques dépendent fortement de l'information sur leurs effets à certaines concentrations. Notamment, le temps est un autre élément essentiel entre les effets et les concentrations. C'est-à-dire que les produits chimiques, en particulier ceux à faibles concentrations dans les environnements réels, ont besoin de temps pour provoquer des effets mesurables1. Par conséquent, les chercheurs organisent différentes longueurs de la durée d'exposition dans les expériences animales, et couvrent même l'ensemble du cycle de vie. Par exemple, les souris ont été exposées à la nicotine pendant 30, 90 ou 180 jours pour étudier ses effets toxiques 2. Pourtant, de telles durées d'exposition ne suffisent toujours pas à élucider les effets à long terme des polluants (p. ex., les polluants organiques persistants [POP]) qui peuvent durer sur des générations d'organismes dans l'environnement. Par conséquent, les études sur les effets au fil des générations gagnent de plus en plus d'attention.

Il y a deux aspects principaux dans les études d'effets générationnels. La première est l'étude d'effet transgénérationnel (TG) qui peut tester avec robustesse si l'exposition chimique aux parents peut entraîner des conséquences sur la progéniture3. La deuxième est une étude multigénérationnelle d'effet qui est plus systématique avec des considérations dans l'exposition et les effets résiduels. D'une part, les effets d'exposition multigénérationnelle (MGE) sont utilisés pour illustrer les réponses adaptatives chez les animaux aux environnements difficiles à long terme. D'autre part, les effets résiduels multigénérationnels (MGR) sont utilisés pour démontrer les conséquences résiduelles à long terme après l'exposition, puisque l'exposition maternelle est accompagnée d'une exposition à l'embryon à la première progéniture et d'une exposition à la lignée germinale à la seconde progéniture qui fait la troisième progéniture comme la première génération complètement hors de l'exposition4.

Bien que les mammifères (p. ex. les souris) soient des organismes modèles dans les études de toxicité, en particulier en ce qui concerne les êtres humains, leur application dans l'étude des effets générationnels est assez longue, coûteuse et éthiquement préoccupante 5. En conséquence, les organismes, y compris le crustacé Daphnia magna6, l'insecte Drosophila melanogaster7 et le poisson zèbre Danio rerio8, offrent des choix alternatifs. Pourtant, ces organismes n'ont pas de similitudes avec les êtres humains, ou ont besoin d'équipement spécifique dans les études.

Caenorhabditis elegans est un petit nématode libre (environ 1 mm de longueur) avec un cycle de vie court (environ 84 h à 20 oC)9. Ce nématode partage de nombreuses voies biologiques conservatrices pour les êtres humains, et donc il a été largement utilisé pour illustrer les effets de divers stress ou toxiques10. Notamment, 99,5% des nématodes sont hermaphrodites rendant ces organismes extrêmement appropriés dans l'étude des effets générationnels, par exemple, les effets TG des métaux lourds et des sulfonamides3,11, effets MGE des nanoparticules d'or et de lourds métaux12 et température13, effets MGR de sulfonamide14, et les deux effets MGE et MGR de l'irradiation gamma15 et lindane4. En outre, des résultats comparables ont été trouvés entre les effets des produits chimiques (par exemple, zearalenone) sur le développement et la reproduction des souris et C. elegans16,17, ce qui fournirait un avantage à extrapoler effets de ce petit animal pour les êtres humains.

Les études d'effet TG et MG prennent du temps et nécessitent une conception et des performances soigneuses. Notamment, des différences existaient dans les choix de stade de vie, les conditions d'exposition et les méthodes de séparation des générations dans les études susmentionnées. Ces différences ont entravé la comparaison directe entre les résultats et entravé une interprétation plus poussée des résultats. Par conséquent, il est impératif d'établir des protocoles uniformes pour guider les études sur les effets TG et MG, et aussi de fournir une vue d'ensemble pour révéler des modèles similaires de divers substances toxiques ou polluants dans les conséquences à long terme. L'objectif excédentaire des protocoles actuels démontrera des processus opérationnels clairs dans l'étude des effets trans et multigénérationnels avec C. elegans. Les protocoles profiteront aux chercheurs intéressés à étudier les effets à long terme des substances toxiques ou polluantes.

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Protocole

1. Culture E. coli OP50

  1. Préparer une solution d'hydroxyde de sodium de 1 M en dissolvant 4 g d'hydroxyde de sodium dans 100 ml d'eau.
  2. Préparer le bouillon de lysogénie (LB) moyen en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure et 10 g de chlorure de sodium avec 1 L d'eau ultrapure dans un flacon conique de 1 L. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium de 1 M.
  3. Aliquot le milieu liquide LB de l'étape1.2 à 20 flacons coniques (volume maximal admissible: 100 ml) avec 50 ml milieu dans chaque. Couvrir les flacons coniques de papier kraft.
  4. Stériliser le milieu liquide LB à 121 oC et 0,105 MPa pendant 20 min. Refroidir le milieu LB jusqu'à la température ambiante.
  5. Pipette 200 L des suspensions bactériennes (voir l'étape 1.8) ou choisir une petite colonie d'agars (à l'étape 2.14) à l'aide d'une boucle isolante, placez-la dans le milieu LB.
  6. Incuber le milieu LB en secouant à 150 tr/min à 37 oC pour 24-48 h. Le milieu LB passera d'un liquide brun transparent à une suspension de couleur kaki turbide.
  7. Utilisez les suspensions bactériennes de 80 % du total des flacons pour fournir E. coli OP50 comme aliment nématode à utiliser à l'étape 2.11.
  8. Conserver le reste des flacons contenant les suspensions bactériennes dans un réfrigérateur à 4 oC. Pipette 200 l des suspensions LB sur le côté supérieur du milieu LB frais (étape 1.4) et répéter l'étape1.6 pour l'incubation ultérieure.

2. Culture C. elegans

REMARQUE: Culture C. elegans en utilisant selon les étapes 2.1 à 2.11 basé sur les méthodes standard18.

  1. Dissoudre 22,8 g de K2HPO4x 3H2O dans 100 ml d'eau distillée stérile.
  2. Dissoudre 6,8 g de KH2PO4 dans 50 ml d'eau distillée stérile.
  3. Mélangez les solutions des étapes 2.1 et 2.2, pour préparer 1 M K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH 6.0, 150 mL au total).
  4. Préparer 1,0 M MgSO4 en dissolvant 1,232 g de MgSO4x 7H2O dans 5 ml d'eau distillée stérile, et la stériliser en filtrant la solution à travers un filtre à membrane jetable stérile de 0,22 m dans un récipient stérile.
  5. Préparer 1 M CaCl2 en dissolvant 0,554 g de CaCl2 sur 5 ml d'eau distillée stérile, et la stériliser en filtrant les solutions à travers un filtre à membrane jetable stérile de 0,22 m dans un récipient stérile.
  6. Préparer une solution de cholestérol de 1 M en dissolvant 0,025 g de cholestérol dans 5 ml d'éthanol absolu, et la stériliser en filtrant la solution à travers un filtre à membrane jetable stérile de 0,22 m dans un contenant stérile.
  7. Préparer l'agar du milieu de croissance nématode (NGM) en ajoutant 17 g de poudre d'agar, 2,5 g de peptone et 3 g de chlorure de sodium dans un flacon conique de 1 L contenant 1 L d'eau ultrapure. Ajouter 25 mL de K2HPO4-KH2PO4 solution de l'étape 2.3.
  8. Stérilisez l'agar NGM de l'étape 2.7 à 121 oC avec 0,105 MPa pour 20 min.
  9. Refroidir l'agar NGM à environ 50 oC, ajouter 1 ml de 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, et 5 mg/mL de cholestérol-éthanol solution des étapes 2.4 à 2.6 dans le milieu et les mélanger soigneusement.
  10. Verser 10 mL de ngM de gélose moyenne par plat dans 100 plats stériles Petri (6,0 cm de diamètre). Refroidir le milieu dans les plats Petri à température ambiante pour former une gélose solide.
  11. Pipette 170 l des suspensions bactériennes de l'étape 1.7 sur l'agar NGM susmentionné à l'aide d'une pointe stérile. Secouez légèrement l'agar NGM pour répartir le support LB uniformément sur la surface d'agar NGM.
  12. Inoculer l'agar NGM avec le côté supérieur vers le haut à 37 oC pendant 8-12 h pour former une pelouse bactérienne.
  13. Utilisez la plupart de l'agar avec des pelouses bactériennes de l'étape 2.12 aux nématodes de culture dans l'étape 2.15 ou 2.19.
  14. Entreposer 1 ou 2 agars vers le haut pour éviter l'évaporation et la contamination de l'eau dans les réfrigérateurs à 4 oC afin de maintenir la bactérie dans la contamination.
  15. Lorsqu'il y a moins de 2 000 nématodes sur les agars NGM de stockage (d'expériences antérieures ou doués d'autres laboratoires), coupez un sixième de l'agar NGM qui contient C. elegans avec une pointe stérile et transférez-le sur des agars NGM nouvellement préparés avec des agars bactériens pelouse (à partir de l'étape 2.13). Gardez les agars NGM vers le bas dans un incubateur de 22 oC pour la culture suivante.
  16. Lorsqu'il y a plus de 2 000 nématodes sur l'agar NGM, rincer les nématodes de l'agar NGM avec 2 ml d'eau stérile dans des tubes de centrifugeuse. L'apport de 2 ml d'eau se traduira par une sortie d'environ 1,5 ml.
  17. Laisser les nématodes s'installer dans les tubes de centrifugeuse pendant 30 min. Jeter 1 ml des supernatants par pipetting et ajouter 1 ml d'eau stérile dans chaque tube pour laver les granulés (c.-à-d. les nématodes).
  18. Déposer les nématodes dans les tubes de centrifugeuse pendant 30 min. Jeter 1 ml des supernatants par pipetting. Ajouter 1 ml d'eau stérile dans chaque tube pour resuspendre les nématodes.
  19. Distribuer les suspensions de nématode (environ 1,5 ml au total) en pipetting 150 L sur chaque nouvelle gélose NGM avec pelouse bactérienne (à partir de l'étape 2.13), ce qui rend 8-10 nouveaux agars NGM au total.
  20. Gardez les agars NGM de l'étape 2.19 vers le haut dans un incubateur de 20 oC pendant la nuit, puis vers le bas vers le bas pour la culture suivante.
  21. Répétez l'étape 2.15 ou l'étape 2.16-2.20 tous les trois jours.

3. Préparer les œufs synchronisés et les larves l3 de C. elegans

  1. Rincer les nématodes gravidés et les œufs nouvellement produits des agars NGM en tubes de centrifugeuse stériles, avec 2 ml d'eau stérile sur chaque gélose NGM, ce qui donne environ 1,5 ml de sortie.
  2. Déposer les nématodes dans les tubes de centrifugeuse pendant 30 min, puis jeter 85% des supernatants par pipetting.
  3. Préparer des solutions d'hypochlorite de sodium en dissolvant 0,6 g de NaOH et 5 ml de NaOCl (4-6% de gradients actifs, voir le Tableau des matériaux pour plus de détails) avec 25 ml d'eau pour amener le NaOH à 0,5 M et NaOCl à 1%.
  4. Mélanger les granulés de l'étape 3.2 (marquer le volume comme V0) avec 7 fois V0 de solutions d'hypochlorite de sodium à partir (étape 3.3, c.-à-d., rapport de volume de 1:7)19.
  5. Agiter les tubes de centrifugeuse toutes les 2 min pendant 10-15 min pour lyser les larves et les nématodes adultes; la couleur des suspensions de nématode tournera de turbide à clair.
  6. Centrifuger les tubes à 700 x g pendant 3 min à 20 oC, puis jeter les supernatants par pipetting.
  7. Resuspendre les granulés dans 5 fois V0 d'eau stérile pour laver les œufs synchronisés par âge. Centrifugeuse à 700 x g pendant 3 min à 20 oC, puis jeter les supernatants.
  8. Répétez l'étape 3.7 deux fois.
  9. Ajouter 1 fois V0 d'eau stérile dans les tubes pour resuspendre les œufs synchronisés par âge.
  10. Distribuez les suspensions d'œufs en pipetting 50 L sur chaque nouvel agars NGM avec pelouse bactérienne à partir de l'étape 2.13. Gardez les agars NGM en haut dans un incubateur de 20 oC pendant 30 min, ce qui permet à l'eau de s'évaporer ou d'être adsorbée par la pelouse bactérienne. Ensuite, faire les agars NGM vers le bas pour la culture suivante. Marquez le temps comme l'heure de l'œuf(oeufT ).
  11. Préparer K-medium en dissolvant 3 g de NaCl et 2,36 g de KCl dans 1 L d'eau. Stériliser le milieu à 121 oC et 0,105 MPa pendant 20 min et le refroidir à température ambiante.
  12. Lorsque le temps atteint 36 h aprèsl'œufT, les nématodes atteindront le stade des larves De L3 (nématodes L3)20. Rincer les nématodes des agars NGM dans des tubes de centrifugeuse, avec 2 ml d'eau stérile sur chaque gélose NGM, ce qui donne environ 1,5 ml de sortie.
  13. Après un règlement de 30 min, remplacer 85% des supernatants (par pipetting) par K-medium à partir de 2 h pour digérer la nourriture dans les tripes3.
  14. Jetez les supernatants. Utilisez K-medium (à partir de l'étape 3.11) pour ajuster les suspensions de nématode à environ 200 nématodes par 100 L pour les expériences ultérieures.

4. Utiliser C. elegans pour l'étude des effets transgénérationnels

  1. Préparer des solutions chimiques avec 5 niveaux de concentration et un solvant ou un contrôle absolu, c'est-à-à-d. 6 groupes au total.
  2. Ajoutez 100 L de solutions de contrôle ou de produits chimiques avec 10 puits comme répliques dans chaque groupe (c.-à-d. 60 puits au total) dans la zone médiane d'une microplaque stérile de 96 puits pour éviter les effets de bord.
  3. Diluer les suspensions nématodes de l'étape 3.14 avec K-medium de l'étape 3.11 par 10 fois. Ajouter des suspensions de nématode de 100 l à chacun des 60 puits de l'étape 4.2. Marquez le temps comme t0.
  4. Lorsque le temps atteint 24 h après t0, comptez les nématodes vivants et morts dans les puits. Calculer la concentration létale médiane (LC50).
  5. Préparer une série de 5 concentrations inférieures à 10 % des valeurs Du LC50.
  6. Ajouter 100 l de solutions de contrôle ou chimiques (à partir de l'étape 4.5) avec 10 puits comme répliques dans chaque groupe (c.-à-d., 60 puits au total) dans la zone médiane d'une microplaque stérile de 96 puits pour éviter les effets de bord.
  7. Ajouter 100 l de K-medium contenant environ 200 nématodes L3 (à partir de l'étape 3.14) à chacun des 60 puits de l'étape 4.6. Marquez l'heure comme T0.
  8. Effectuer l'exposition pendant 24 à 96 h depuis T0.
  9. Après l'exposition, recueillir les nématodes de cinq puits de chaque groupe dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml par tuyauterie (c.-à-d. 6 tubes au total).
  10. Régler les nématodes pendant 30 min, jeter les supernatants par pipetting, et resuspendre et laver les nématodes au fond avec 1 ml d'eau stérilisée.
  11. Régler les nématodes pendant 30 min, jeter les supernatants par pipetting et utiliser les nématodes au fond pour les mesures de l'indicateur (voir la section 7) de la génération parente exposée marquée comme F0.
  12. Recueillir, régler et laver (en rependant) les nématodes des cinq puits restants dans chaque groupe à l'étape 4.9 selon l'étape 4.10.
  13. Régler les nématodes à partir de l'étape 4.12 pendant 30 min. Jetez les supernatants par pipetting et ajoutez 100 l d'eau stérile pour resuspendre les nématodes. Transférer les suspensions de nématode uniformément sur trois agars NGM nouvellement préparés avec pelouse bactérienne à partir de l'étape 2.13.
  14. Incuber les nématodes pendant 36 h pour devenir gravid et effectuer la synchronisation de l'âge selon les étapes 3.1-3.9. Incuber les œufs synchronisés sur les agars NGM respectifs avec la pelouse bactérienne de l'étape 2.13 pendant 36 h.
  15. Rincer les nématodes sur les agars NGM de l'étape 4.14 dans six tubes de centrifugeuse.
  16. Régler les nématodes pendant 30 min, et jeter les supernatants par pipetting. Suspendre et laver les granulés avec 1 ml d'eau stérilisée.
  17. Régler les nématodes pendant 30 min, et jeter les supernatants par pipetting. Utilisez les nématodes en bas pour les mesures de l'indicateur (voir la section 7) de la génération de descendants marqués Comme T1.

5. Utiliser C. elegans pour l'étude multigénérationnelle sur l'exposition (MGE)

  1. Mélanger 99,0 mL d'agars NGM (à partir de l'étape 2.9) avec 1 ml de solutions de contrôle ou chimiques (concentrations faibles et élevées dans le protocole actuel à titre d'exemples, c'est-à-d., trois groupes au total).
  2. Verser les quelque 10 ml de ngM agar medium par plat de l'étape 5.1 dans 100 plats stériles Petri (6,0 cm de diamètre). Refroidir le milieu dans les plats Petri à température ambiante pour former une gélose solide.
  3. Suspensions bactériennes Pipette sur l'agar selon l'étape 2.11.
  4. Mettre de côté les couvercles supérieurs de la vaisselle Petri et exposer la pelouse bactérienne à la lumière UV (145 W/cm2) dans l'armoire de biosécurité pendant 15 min.
  5. Choisissez une petite colonie à l'aide d'une boucle isolante, placez-la dans le milieu LB à partir d'agars à l'étape 1.4. Incuber le milieu LB en secouant à une vitesse de 150 tr/min à 37 oC pendant 24 h pour confirmer la croissance bactérienne négligente, validant l'étape de mise à mort 5.4.
  6. Pipette les œufs synchronisés par l'âge à partir de l'étape 3.9 sur les agars (à partir de l'étape 5.4). Marquez le début de l'exposition à la génération parente F0 et marquez le jour 0 (D0).
  7. Incuber les agars pendant 3 d à 20 oC. Ensuite (c.-à-d., sur D3), utilisez les nématodes matures pour mesurer les effets en F0 (voir la section 7).
  8. Toujours sur D3, choisissez des nématodes matures F0 sur de nouveaux agars NGM (à partir de l'étape 5.4) à l'aide d'une tige de verre, dont l'extrémité est équipée d'un fil de fibre fabriqué par l'homme plié dans un anneau.
  9. Sur D4, choisissez et jetez les nématodes F0 matures des agars NGM. Marquez les nématodes de la progéniture nouvellement éclos dans ces 24 h (de D3 à D4) comme F1 pour faire l'expérience d'une exposition de deuxième génération.
  10. Sur D6, mesurer les indices (voir la section 7) des nématodes matures F1 qui ont été exposés pendant 3 jours.
  11. Sur D9, répétez les étapes 5.8-5.10, utilisez des nématodes F1 pour reproduire les vers F2 et mesurer les effets sur les nématodes F2.
  12. Sur D12, répétez l'étape 5.11, utilisez des nématodes F2 pour reproduire les vers F3 et mesurer les effets sur les nématodes F3. De la même façon, reproduire la progéniture et mesurer les effets MGE sur la génération dela progéniture n th (Fn).

6. Utiliser C. elegans pour l'étude multigénérationnelle des effets résiduels (MGR)

  1. Répétez les étapes 5.1-5.7. Sur D3, choisissez des nématodes matures F0 sur de nouveaux agars NGM sans produits chimiques ajoutés (à partir de l'étape 2.13).
  2. Sur D4, choisissez et jetez les nématodes F0 matures. Marquez les nématodes de la progéniture nouvellement éclos dans ces 24 h sous forme de nématodes T1.
  3. Sur D6, mesurer les indices (voir la section 7) des nématodes matures T1 qui ont augmenté pendant 3 jours.
  4. Sur D9, répétez les étapes 6.2-6.3, utilisez des nématodes T1 pour reproduire les nématodes T2 et mesurer les effets dans les nématodes T1.
  5. Sur D12, répétez les étapes 6.4, utilisez des nématodes T2 pour reproduire les nématodes T3 et mesurer les effets dans les nématodes T2. De la même manière, reproduire la progéniture et mesurer les effets MGR sur les nématodes de la génération de la progéniture (Tn) de F0, ou les nématodes nth offspring (Tn') du Fn à partir de l'étape 5.12.

7. Indicateurs de mesure

  1. Mesurer le comportement de locomotion.
    1. Rincer les nématodes des agars NGM à l'aide d'eau stérile et les ramasser dans des tubes de centrifugeuse. Régler les nématodes pendant 30 min, jeter les supernatants et utiliser les nématodes dans les granulés pour la mesure de l'effet.
    2. Resuspendre les nématodes dans les granulés avec 1 ml d'eau stérile et les pipette sur les agars NGM sans pelouse bactérienne à partir de l'étape 2.10.
    3. Utilisez un microscope disséquant pour marquer les nématodes pour la fréquence de flexion du corps (nombre de) (BBF) qui se réfère à l'époque où l'ampoule postérieure du pharynx change de direction le long de la direction verticale du chemin de déplacement dans un intervalle de 60 s.
    4. Utilisez le microscope disséquant pour marquer le mouvement d'inversion (RM) qui se réfère aux moments où la direction de déplacement change au-dessus de 90 degrés, y compris les virages en arrière et les virages Omega (OT) dans un intervalle de 60 s. L'OT se réfère au mouvement lorsque la tête du nématode touche ou touche presque sa queue faisant la forme nématode comme la lettre grecque Omega ( .
      REMARQUE : Au moins 6 nématodes ont été examinés pour chaque traitement dans chaque réplique expérimentale.
Exemples d'effets MGE (F0 à F3) sur la reproduction et la durée de vie avec 3 groupes (un contrôle et deux traitements d'exposition).
jourNuméro d'agar NGM pour l'étude MGEexplication
duréereproduction
0 (en)30 (exposition F0)10 répliques pour chaque groupe, marqué comme F0-1-1-0 à F0-3-10-0, avec le dernier chiffre pour afficher les jours de survie.
1 Fois30 (F0 survivre 1 d)F0-1-1-0 à F0-3-10-0 devrait être changé à F0-1-1-1 à F0-3-10-1.
2 (en)30 (F0 survivre 2 d)F0-1-1-1 à F0-3-10-1 devrait être changé à F0-1-1-2 à F0-3-10-2.
Pas besoin de transférer des nématodes F0 jusqu'à 3 j.
3 (en)30 (F0 survivre 3 d, effacé après le transfert et la collecte des nématodes)Après 3 d, les nématodes F0 sont matures et 36 nouveaux agars NGM (avec 2 nématodes sur chaque agar) sont utilisés pour observer leur survie et leur reproduction.
36 (F0-1-1-3 à F0-3-12-3)Des expériences préliminaires devraient être effectuées pour organiser le nombre de nématodes F0, assurant au moins 200 descendants pour succéder à des opérations multigénérationnelles.
Notamment, si les effets MGR sont étudiés, les nématodes F0 doivent être transférés sur des agars NGM clairs sans exposition chimique, et il convient de noter que T1 commencer.
La plupart des nématodes F0 sont collectés pour mesurer les indices chimiques et génétiques et les 30 agars en F0 sont effacés.
4 ( en plus)36 (F0-1-1-4 à F0-3-12-4)36 (F1-1-1-1 à F1-3-12-1)La mesure de la durée de vie et de la reproduction nécessite un transfert quotidien.
Les nématodes parentaux sur F0-1-1-3 à F0-3-12-3 sont choisis sur de nouveaux agars NGM marqués comme F0-1-1-4 à F0-3-12-4.
Les nématodes de progéniture restants (c.-à-d., F1 dans MGE, ou T1 dans MGR) dans F0-1-1-3 à F0-3-12-3 agars ont augmenté pour 1 d, et les marqueurs sont changés à F1-1-1-1 à F1-3-12-1. Ces agars sont également utilisés pour surveiller la durée de vie de la F1 avec transfert quotidien.
5 Annonces36 (F0-1-1-5 à F0-3-12-5)36 (F1-1-1-2 à F1-3-12-2)Les nématodes sur F1-1-1-1 à F1-3-12-1 agars ont grandi pour 2 d et deviennent facilement observables et les nématodes sont comptés, et les marqueurs sont changés en F1-1-1-2 à F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 à F0-3-12-4)Les nématodes de progéniture dans F0-1-1-4 à F0-3-12-4 agars ont grandi pendant 1 d.
6 Annonces36 (F0-1-1-6 à F0-3-12-6)36 (F0-1-1-4 à F0-3-12-4, effacé après compté)Nematodes sur F1-1-1-2 à F1-3-12-2 agars ont grandi pour 3 d et les marqueurs sont changés à F1-1-1-3 à F1-3-12-3. Notamment, les nématodes de F1 commencent à reproduire la F2 ce jour-là, les nématodes de F1 devraient être transférés sur de nouveaux agars NGM faisant F2-1-1-0 à F1-3-12-0. Pour les études MGR, T2 commence aujourd'hui.
36 (F1-1-1-3 à F1-3-12-3)36 (F0-1-1-5 à F0-3-12-5)Cela peut être retardé par l'exposition chimique, et donc des changements flexibles devraient être effectués dans chaque expérience pour assurer suffisamment de nématodes pour les générations suivantes.
36 (F2-1-1-0 à F1-3-12-0)Les nématodes de progéniture sur F0-1-1-4 à F0-3-12-4 agars ont grandi pendant 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes soient comptés.
Les nématodes de progéniture sur F0-1-1-5 à F0-3-12-5 agars ont grandi pendant 1 d.
7 Annonces36 (F0-1-1-7 à F0-3-12-7)36 (F0-1-1-5 à F0-3-12-5, effacé après compté)Les nématodes de progéniture sur F0-1-1-5 à F0-3-12-5 agars ont grandi pendant 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes soient comptés.
36 (F1-1-1-4 à F1-3-12-4)36 (F0-1-1-6 à F0-3-12-6)Le nombre global de nématodes en F1-1-1-1 à F1-3-12-1 agars, F0-1-1-4 à F0-3-12-4 agars et F0-1-1-5 à F0-3-12-5 sont utilisés pour calculer la reproduction initiale de F0.
36 (F2-1-1-1 à F2-3-12-1)Les nématodes de progéniture sur F0-1-1-6 à F0-3-12-6 agars ont grandi pendant 1 d.
Les nématodes F2 sur F2-1-1-0 à F1-3-12-0 ont grandi pour 1 d et leurs marqueurs sont changés en F2-1-1-1 à F2-3-12-1.
8 Annonces36 (F0-1-1-8 à F0-3-12-8)36 (F0-1-1-6 à F0-3-12-6, effacé après compté)Les nématodes de progéniture sur F0-1-1-6 à F0-3-12-6 agars ont grandi pendant 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes soient comptés.
36 (F1-1-1-5 à F1-3-12-5)36 (F0-1-1-7 à F0-3-12-7)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-7 à F0-3-12-7 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F2-1-1-2 à F2-3-12-2)36 (F1-1-1-4 à F1-3-12-4)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-4 à F1-3-12-4 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-1 à F2-3-12-1, changé en F2-1-1-2 à F2-3-12-2 après compté)Les nématodes F2 sur F2-1-1-1 à F2-3-12-1 ont grandi pour 2 d, les nématodes sont comptés et leurs marqueurs sont changés en F2-1-1-2 à F2-3-12-2.
9 (en)36 (F0-1-1-9 à F0-3-12-9)36 (F0-1-1-7 à F0-3-12-7, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-7 à F0-3-12-7 agars ont grandi pendant 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes soient comptés.
36 (F1-1-1-6 à F1-3-12-6)36 (F1-1-1-4 à F1-3-12-4, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-4 à F1-3-12-4 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-3 à F2-3-12-3)36 (F0-1-1-8 à F0-3-12-8)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-8 à F0-3-12-8 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F3-1-1-0 à F3-3-12-0)36 (F1-1-1-5 à F1-3-12-5)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-5 à F1-3-12-5 agars ont grandi pour 1 d.
Les nématodes F2 sur F2-1-1-2 à F2-3-12-2 ont augmenté pendant 3 jours et leurs marqueurs sont changés à F2-1-1-3 à F2-3-12-3. Les nématodes F2 commencent à se reproduire aujourd'hui et ils sont transférés à 36 nouveaux agars NGM sont nécessaires et marqués comme F3-1-1-0 à F3-3-12-0. Pour les études MGR, T3 commence aujourd'hui.
10 Ans et plus36 (F0-1-1-10 à F0-3-12-10)36 (F0-1-1-8 à F0-3-12-8, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-8 à F0-3-12-8 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-7 à F1-3-12-7)36 (F1-1-1-5 à F1-3-12-5, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-5 à F1-3-12-5 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-4 à F2-3-12-4)36 (F0-1-1-9 à F0-3-12-9)Le nombre global de nématodes en F2-1-1-1 à F2-3-12-1, F1-1-1-4 à F1-3-12-4 agars et F1-1-1-5 à F1-3-12-5 sont utilisés pour calculer la reproduction initiale de F1.
36 (F3-1-1-1 à F3-3-12-1)36 (F1-1-1-6 à F1-3-12-6)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-9 à F0-3-12-9 agars ont grandi pendant 1 d.
Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-6 à F1-3-12-6 agars ont grandi pour 1 d.
Le nématode de progéniture sur F3-1-1-0 à F3-3-12-0 agars ont grandi pour 1 d et les marqueurs sont changés en F3-1-1-1 à F3-3-12-1.
Notamment, la reproduction des nématodes F0 diminuera considérablement après les premiers jours. Par conséquent, le transfert de nématode n'est pas strictement nécessaire pour être tous les jours après D10 et peut être effectué tous les 2 jours. Pourtant, la survie exige encore une observation quotidienne.
La même règle s'applique également en F1 (T1, T1'), F2 (T2, T2') et F3 (T3, T3').
11 Ans, états-unis (36 (F0-1-1-11 à F0-3-12-11)36 (F0-1-1-9 à F0-3-12-9, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-9 à F0-3-12-9 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-8 à F1-3-12-8)36 (F1-1-1-6 à F1-3-12-6, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-6 à F1-3-12-6 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-5 à F2-3-12-5)36 (F0-1-1-10 à F0-3-12-10)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-10 à F0-3-12-10 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F3-1-1-2 à F3-3-12-2)36 (F1-1-1-7 à F1-3-12-7)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-7 à F1-3-12-7 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-4 à F2-3-12-4)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-4 à F2-3-12-4 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F3-1-1-1 à F3-3-12-1, changé en F3-1-1-2 à F3-3-12-2 après comptage)Les nématodes sur F3-1-1-1 à F3-3-12-1 agars ont grandi pour 2 d, les nématodes sont comptés et les marqueurs sont changés en F3-1-1-2 à F3-3-12-2.
12 Ans, états-unis36 (F0-1-1-12 à F0-3-12-12)36 (F0-1-1-10 à F0-3-12-10, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-10 à F0-3-12-10 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-9 à F1-3-12-9)36 (F1-1-1-7 à F1-3-12-7, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-7 à F1-3-12-7 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-6 à F2-3-12-6)36 (F2-1-1-4 à F2-3-12-4, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-4 à F2-3-12-4 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-3 à F3-3-12-3)36 (F0-1-1-11 à F0-3-12-11)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-11 à F0-3-12-11 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F4-1-1-0 à F4-3-12-0)36 (F1-1-1-8 à F1-3-12-8)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-8 à F1-3-12-8 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-5 à F2-3-12-5)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-5 à F2-3-12-5 agars ont grandi pendant 1 d.
Les nématodes sur F3-1-1-2 à F3-3-12-2 agars ont grandi pour 3 d et les marqueurs sont changés en F3-1-1-3 à F3-3-12-3. Les nématodes F3 commencent à se reproduire aujourd'hui et ils sont transférés à 36 nouveaux agars NGM sont nécessaires et marqués comme F4-1-1-0 à F4-3-12-0. Pour les études MGR, la progéniture de F3 (c'est-à-dire T1') commence aujourd'hui.
13 (en)36 (F0-1-1-13 à F0-3-12-13)36 (F0-1-1-11 à F0-3-12-11, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-11 à F0-3-12-11 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-10 à F1-3-12-10)36 (F1-1-1-8 à F1-3-12-8, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-8 à F1-3-12-8 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-7 à F2-3-12-9)36 (F2-1-1-5 à F2-3-12-5, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-5 à F2-3-12-5 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-4 à F3-3-12-4)36 (F0-1-1-12 à F0-3-12-12)Le nombre global de nématodes en F3-1-1-1 à F3-3-12-1, F2-1-1-4 à F2-3-12-4 agars et F2-1-1-5 à F2-3-12-5 sont utilisés pour calculer la reproduction initiale de F2.
36 (F4-1-1-1 à F4-3-12-1)36 (F1-1-1-9 à F1-3-12-9)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-12 à F0-3-12-12 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F2-1-1-6 à F2-3-12-6)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-9 à F1-3-12-9 agars ont grandi pour 1 d.
Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-6 à F2-3-12-6 agars ont grandi pendant 1 d.
Les nématodes de progéniture de F3 sur F4-1-1-0 à F4-3-12-0 ont augmenté pour 1 d, et les marqueurs sont changés en F4-1-1-1 à F4-3-12-1.
14 (en)36 (F0-1-1-14 à F0-3-12-14)36 (F0-1-1-12 à F0-3-12-12, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-12 à F0-3-12-12 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-11 à F1-3-12-11)36 (F1-1-1-9 à F1-3-12-9, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-9 à F1-3-12-9 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-8 à F2-3-12-8)36 (F2-1-1-6 à F2-3-12-6, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-6 à F2-3-12-6 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-5 à F3-3-12-5)36 (F4-1-1-1 à F4-3-12-1, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F4-1-1-1 à F4-3-12-1 ont augmenté pendant 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes soient comptés. Pour les études MGR, les nématodes T1' ont augmenté de 2 d, et commenceront à reproduire T2' le lendemain (D15), et T2' commencera à reproduire T3' sur D18. La durée de vie du type sauvage C. elegans est par exemple de 15 jours. Ensuite, la fin de la durée de vie T3' sera sur D33.
36 (F0-1-1-13 à F0-3-12-13)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-13 à F0-3-12-13 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F1-1-1-10 à F1-3-12-10)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-10 à F1-3-12-10 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-7 à F2-3-12-7)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-7 à F2-3-12-7 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F3-1-1-4 à F3-3-12-4)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-4 à F2-3-12-4 agars ont grandi pour 1 d.
15 Annonces36 (F0-1-1-15 à F0-3-12-15)36 (F0-1-1-13 à F0-3-12-13, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-13 à F0-3-12-13 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-12 à F1-3-12-12)36 (F1-1-1-10 à F1-3-12-10, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-10 à F1-3-12-10 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-9 à F2-3-12-9)36 (F2-1-1-7 à F2-3-12-7, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-7 à F2-3-12-7 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-6 à F3-3-12-6)36 (F3-1-1-4 à F3-3-12-4, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-4 à F3-3-12-4 agars ont grandi pour 2d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F0-1-1-14 à F0-3-12-14)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-14 à F0-3-12-14 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F1-1-1-11 à F1-3-12-11)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-11 à F1-3-12-11 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-8 à F2-3-12-8)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-8 à F2-3-12-8 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F3-1-1-5 à F3-3-12-5)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-5 à F2-3-12-5 agars ont grandi pendant 1 d.
16 Annonces36 (F0-1-1-15 à F0-3-12-15, plus)36 (F0-1-1-14 à F0-3-12-14, effacé après compté)La durée de vie du type sauvage C. elegans est par exemple de 15 jours. Par conséquent, F0 aurait dû tous mourir avant le jour 16 depuis l'exposition.
36 (F1-1-1-13 à F1-3-12-13)36 (F1-1-1-11 à F1-3-12-11, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-14 à F0-3-12-14 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-10 à F2-3-12-10)36 (F2-1-1-8 à F2-3-12-8, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-11 à F1-3-12-11 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-7 à F3-3-12-7)36 (F3-1-1-5 à F3-3-12-5, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-8 à F2-3-12-8 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F0-1-1-15 à F0-3-12-15)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-5 à F3-3-12-5 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-12 à F1-3-12-12)Le nombre global de nématodes en F4-1-1-1 à F4-3-12-1, F3-1-1-4 à F3-3-12-4 agars et F3-1-1-5 à F3-3-12-5 sont utilisés pour calculer la reproduction initiale de F3.
36 (F2-1-1-9 à F2-3-12-9)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-15 à F0-3-12-15 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F3-1-1-6 à F3-3-12-6)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-12 à F1-3-12-12 agars ont grandi pour 1 d.
Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-9 à F2-3-12-9 agars ont grandi pour 1 d.
Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-6 à F2-3-12-6 agars ont grandi pendant 1 d.
17 Annonces36 (F1-1-1-14 à F1-3-12-14)36 (F0-1-1-15 à F0-3-12-15, effacé après compté, plus)Les nématodes de progéniture de F0 sur F0-1-1-15 à F0-3-12-15 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés. Il n'y aura plus de progéniture F0.
36 (F2-1-1-11 à F2-3-12-11)36 (F1-1-1-12 à F1-3-12-12, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-12 à F1-3-12-12 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-8 à F3-3-12-8)36 (F2-1-1-9 à F2-3-12-9, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-9 à F2-3-12-9 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-6 à F3-3-12-6, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-6 à F3-3-12-6 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-13 à F1-3-12-13)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-13 à F1-3-12-13 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-10 à F2-3-12-10)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-10 à F2-3-12-10 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F3-1-1-7 à F3-3-12-7)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-7 à F2-3-12-7 agars ont grandi pendant 1 d.
18 ans, états-unis qui36 (F1-1-1-15 à F1-3-12-15)36 (F1-1-1-13 à F1-3-12-13, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-13 à F1-3-12-13 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-12 à F2-3-12-12)36 (F2-1-1-10 à F2-3-12-10, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-10 à F2-3-12-10 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-9 à F3-3-12-9)36 (F3-1-1-7 à F3-3-12-7, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-7 à F3-3-12-7 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-14 à F1-3-12-14)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-14 à F1-3-12-14 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-11 à F2-3-12-11)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-11 à F2-3-12-11 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F3-1-1-8 à F3-3-12-8)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-8 à F2-3-12-8 agars ont grandi pour 1 d.
Dans les études MGR, T2' va commencer à reproduire T3' aujourd'hui. La durée de vie du type sauvage C. elegans est par exemple de 15 jours. Ensuite, la fin de la durée de vie T3' sera sur D33.
19 ans, états-unis qui36 (F1-1-1-15 à F1-3-12-15, plus)36 (F1-1-1-14 à F1-3-12-14, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-14 à F1-3-12-14 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-13 à F2-3-12-13)36 (F2-1-1-11 à F2-3-12-11, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-11 à F2-3-12-11 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-10 à F3-3-12-10)36 (F3-1-1-8 à F3-3-12-8, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-8 à F3-3-12-8 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F1-1-1-15 à F1-3-12-15)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-15 à F1-3-12-15 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F2-1-1-12 à F2-3-12-12)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-12 à F2-3-12-12 agars ont grandi pendant 1 d.
36 (F3-1-1-9 à F3-3-12-9)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-9 à F2-3-12-9 agars ont grandi pour 1 d.
20 Ans, états-unis36 (F2-1-1-14 à F2-3-12-14)36 (F1-1-1-15 à F1-3-12-15, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F1 sur F1-1-1-14 à F1-3-12-14 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont effacés après que les nématodes sont comptés. Il n'y aura plus de progéniture F1.
36 (F3-1-1-11 à F3-3-12-11)36 (F2-1-1-12 à F2-3-12-12, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-12 à F2-3-12-12 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-9 à F3-3-12-9, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-9 à F3-3-12-9 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-13 à F2-3-12-13)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-13 à F2-3-12-13 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F3-1-1-10 à F3-3-12-10)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-10 à F2-3-12-10 agars ont grandi pendant 1 d.
21 Ans, états-unis36 (F2-1-1-15 à F2-3-12-15)36 (F2-1-1-13 à F2-3-12-13, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-13 à F2-3-12-13 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-12 à F3-3-12-12)36 (F3-1-1-10 à F3-3-12-10, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-10 à F3-3-12-10 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F2-1-1-14 à F2-3-12-14)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-14 à F2-3-12-14 agars ont grandi pour 1 d.
36 (F3-1-1-11 à F3-3-12-11)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-11 à F2-3-12-11 agars ont grandi pour 1 d.
22 Ans36 (F2-1-1-15 à F2-3-12-15, plus)36 (F2-1-1-14 à F2-3-12-14, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-14 à F2-3-12-14 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-13 à F3-3-12-13)36 (F3-1-1-11 à F3-3-12-11, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-11 à F3-3-12-11 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-12 à F3-3-12-12)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-12 à F2-3-12-12 agars ont grandi pendant 1 d.
23 Ans, états-unis36 (F3-1-1-14 à F3-3-12-14)36 (F2-1-1-15 à F2-3-12-15, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F2 sur F2-1-1-15 à F2-3-12-15 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés. Il n'y aura plus de progéniture F2.
36 (F3-1-1-12 à F3-3-12-12, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-12 à F3-3-12-12 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-13 à F3-3-12-13)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-13 à F2-3-12-13 agars ont grandi pour 1 d.
24 Ans, états-unis36 (F3-1-1-15 à F3-3-12-15)36 (F3-1-1-13 à F3-3-12-13, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-13 à F3-3-12-13 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-14 à F3-3-12-14)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-14 à F2-3-12-14 agars ont grandi pour 1 d.
25 Annonces36 (F3-1-1-15 à F3-3-12-15, plus)36 (F3-1-1-14 à F3-3-12-14, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-14 à F3-3-12-14 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
36 (F3-1-1-15 à F3-3-12-15)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-15 à F2-3-12-15 agars ont grandi pendant 1 d.
26 Annonces36 (F3-1-1-15 à F3-3-12-15, effacé après compté)Les nématodes de progéniture de F3 sur F3-1-1-15 à F3-3-12-15 agars ont grandi pour 2 d, et les agars sont dégagés après que les nématodes sont comptés.
Notamment, dans les études MGR, la première progéniture non exposée de F3 (c.-à-d., T3') serait née sur D18. La durée de vie du type sauvage C. elegans est par exemple de 15 jours. Ensuite, la fin de la durée de vie T3' sera sur D33.
Les études MGE et MGR couvriront plus de jours lorsque la durée de vie du nématode sera plus longue.

Tableau 1 : Liste des marqueurs et de leurs définitions.

  1. Mesurer la reproduction et la durée de vie dans les études d'effet MGE.
    1. Sur D0, répétez l'étape 5.6. Marquez les agars (3 groupes avec 10 répliques dans chacun) comme Fx-a-b-c, où x se réfère au nombre de génération, un se réfère au nombre de groupe (1 pour le contrôle, 2 pour la faible concentration et 3 pour la forte concentration ); b se réfère à la réplique de 1 à 10; et c se réfère à la durée d'exposition (0 indique le début). Pour D0, marque les agars comme F0-1-1-0 à F0-3-10-0. Les lecteurs peuvent consulter le tableau 1 pour obtenir des renseignements détaillés.
    2. Sur D1, vérifiez la croissance des nématodes sur les agars, et changer les marqueurs de F0-1-1-0 à F0-3-10-0 à F0-1-1-1 à F0-3-1.1.
    3. Sur D2, vérifiez la croissance des nématodes sur les agars, et changez les marqueurs F0-1-1-2 en F0-3-10-2.
    4. Sur D3, choisissez 24 nématodes F0 de chaque groupe sur 12 nouveaux agars NGM avec deux gélose NGM de l'étape 5.4. Marquez les agars comme F0-1-1-3 à F0-3-12-3.
    5. Sur D4, transférer les deux nématodes parent de F0-1-1-3 à F0-3-12-3 en s'appuyant sur de nouveaux agars NGM de l'étape 5.4. Marquez le nouveau agars NGM comme F0-1-1-4 à F0-3-12-4. Changer les marqueurs de F0-1-1-3 à F0-3-12-3 à F1-1-1-1 à F1-3-12-1 pour représenter la progéniture de F0 (c.-à-d., F1) dans le premier jour depuis F0 commencer à se reproduire.
    6. Sur D5, utilisez un microscope disséquant pour compter les nématodes sur F1-1-1-1 à F1-3-12-1 agars où les nématodes ont grandi 2 jours. Laissez F1-1-1-1 à F1-3-12-1 agars pour reproduire F2 pour les générations successives.
    7. Transférez les deux nématodes parentde de F0-1-1-4 à F0-3-12-4 agars en s'appuyant sur de nouveaux agars NGM de l'étape 5.4. Mark NGM agars comme F0-1-1-5 à F0-3-12-5. Changer les marques de F0-1-1-4 à F0-3-12-4 à F1-1-1-2 à F1-3-12-2 pour représenter la progéniture de F0 (c.-à-d., F1) dans le deuxième jour depuis F0 commencer à se reproduire.
    8. Sur D6, comptez les nématodes sur F1-1-1-2 à F1-3-12-2 agars. Transférez les nématodes parentde de F0-1-1-5 à F0-3-12-5 agars à F0-1-1-6 à F0-3-12-6. Changer les marqueurs de F0-1-1-5 à F0-3-12-5 à F1-1-1-3 à F1-3-12-3 pour représenter la progéniture de F0 (c.-à-d., F1) dans le troisième jour depuis F0 commencer à se reproduire.
    9. Les nématodes sur F1-1-1-1 à F1-3-12-1 agars ont augmenté pendant 3 jours. Utilisez-les pour reproduire F2 dans les études d'effet MGE successives. De la même manière, utilisez des nématodes F2 pour reproduire F3 pour poursuivre les études d'effet MGE.
    10. De la même façon, transférez les deux nématodes parentaux tous les jours et comptez les nématodes de la progéniture le lendemain, jusqu'à ce que les nématodes parentdans 6 agars NGM (c.-à-d. la moitié du total des agars dans chaque groupe) arrêtent la reproduction.
    11. Calculer le nombre total de descendants sur toute la durée de reproduction comme la taille totale de la couvée. Utilisez le numéro de la progéniture dans les 3 premiers jours pour représenter la reproduction initiale des parents.
    12. Utilisez le jour où la reproduction du nématode parent s'arrête dans 6 agars NGM pour estimer la durée de reproduction. Utilisez les jours où chaque parent a survécu comme durée de vie.
    13. Obtenir la reproduction initiale, la durée de reproduction, la taille totale de la couvée et la durée de vie de F1 de la même manière que pour F0. De même, en répétant la procédure susmentionnée, la reproduction et l'information sur la durée de vie de F2 (à Fn) peuvent être obtenues.
  2. Mesurer la reproduction et la durée de vie dans les études d'effet MGR.
    1. Effectuer l'étape 7.2.4 avec les agars NGM de l'étape 5.4 changé à ceux de l'étape 2.13.
  3. Mesurer les indices biochimiques.
    1. Rincer les nématodes des agars NGM avec de l'eau stérile et les ramasser dans des tubes de centrifugeuse. Régler les nématodes pendant 30 min et jeter les supernatants. Utilisez les nématodes dans les granulés pour la mesure de l'effet.
    2. Ajouter 1 ml de salline tamponnée de phosphate glacé (PBS, pH 7,0) dans les nématodes (pellets) dans les tubes centrifugeurs de 1,5 mL pour laver les nématodes.
    3. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 5 min à 4 oC, et jetez soigneusement les supernatants à l'eau avec une pipette.
    4. Congelez les granulés par l'azote liquide ou dans un congélateur de -80 oC.
    5. Homogénéiser les granulés à l'aide de pilons dans un bain de glace. Utilisez un PBS glacé de 200 ll pour laver les liquides résiduels sur le pilon dans le tube de centrifugeuse avant d'enlever le pilon.
    6. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 5 min à 4 oC à nouveau, et utiliser les supernatants pour déterminer les activités ou les quantités de produits biochimiques avec les kits commerciaux (voir le Tableau des matériaux pour plus de détails).
    7. Mesurer les quantités de la protéine totale (TP) dans les échantillons, et utiliser les résultats comme dénominateur pour représenter d'autres indicateurs biochimiques, de sorte que la différence entre les nombres de nématodes parmi les échantillons peut être éliminée.
  4. Mesurer l'expression des gènes.
    1. Répétez les étapes 7.4.1 à 7.4.4. Isoler l'ARN total des échantillons de nématode à l'aide d'un kit commercial d'extraction de l'ARN (voir le Tableau des matériaux pour plus de détails) selon les instructions du fabricant21.
    2. Utilisez l'ARN pour synthétiser l'ADNc selon les instructions du fabricant21.
    3. Analyser l'échantillon d'ADNc dans la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (RT-PCR) à l'aide de kits SYBR Green RT-PCR selon les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux)21.
    4. Quantifiez les niveaux d'expression relatifs des gènes choisis par la méthode 2-CT 22, et traitez les niveaux d'expression du pib-2 (ou autre gène de référence) comme référence négative.

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Résultats

Ici, nous décrivons des protocoles pour étudier les effets des produits chimiques au cours des générations utilisant C. elegans dans les études d'effet transgénérationnel (TG), multigénérationnelle (MGE) et multigénérationnelle résiduelle (MGR). Nos propres résultats de recherche sont présentés comme des exemples. Une étude présente les effets TG des métaux lourds sur le comportement de locomotion3. Les deux autres études présentent les...

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Discussion

Afin de mener avec succès le protocole décrit, les suggestions suivantes doivent être prises en considération. Effectuer l'ensemble des opérations expérimentales dans un environnement stérile. Une mauvaise exploitation peut entraîner la contamination des souches d'E. coli, par exemple, les champignons et les acariens peuvent entraver la croissance normale de C. elegans et donc affecter les résultats expérimentaux. Dans la section décrivant la culture de C. elegans, observez l'échel...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier du National Science and Technology Major Project for Water Pollution Control and Treatment (2017ZX07201004) et du Programme international de coopération en sciences et technologies de la Chine (No. 2016YFE0123700).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
 agar powderOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 
96-well sterile microplateCostar?Corning?America
Autoclave sterilizerTomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinetLongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China10043-52-4
centrifuge  5417REppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubesAxygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterolSinopharm chemical reagent company Ltd, China57-88-5
Dimethyl sulfoxideVETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America67-68-5
disodium hydrogen phosphateSinopharm chemical reagent company Ltd, China7558-79-4
ethanolSinopharm chemical reagent company Ltd, China64-17-5
FilterThermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubatorYiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, China16788-57-1
kraft paper
Mcroplate ReaderBoitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, China10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TDBM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
PipetteEppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China7447-40-7
potassium dihydrogen phosphateSinopharm chemical reagent company Ltd, China7778-77-0
Qiagen RNeasy kitsQiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kitsQiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China7647-14-5
sodium hydroxideSinopharm chemical reagent company Ltd, China1310-73-2
sodium hypochlorite solutionAladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China7681-52-9
tryptoneOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK73049-73-7
yeast extractOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK119-44-8

Références

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