Un modèle orthotopic de souris orthopique d'hépatocyteonon oncogène du cancer hépatocellulaire surgissant dans le cadre de l'inflammation et de la fibrose hépatiques

Résumé

Ici, nous décrivons le développement d'un modèle de murine médicalement pertinent du cancer du foie récapitulant les dispositifs immunisés typiques du cancer hépatocellulaire (HCC).

Résumé

L'absence d'un modèle animal cliniquement pertinent traitant des caractéristiques immunitaires typiques du cancer hépatocellulaire (HCC) a considérablement entravé l'élucidation des mécanismes sous-jacents et le développement de stratégies immunothérapeutiques novatrices. Pour développer un modèle animal idéal récapitulant le HCC humain, les souris mâles immunocompétentes C57BL/6J reçoivent d'abord une injection de tétrachlorure de carbone (CCl₄) pour induire la fibrose hépatique, puis reçoivent des hépatocytes oncogènes histologiquement normaux de jeunes mâles Souris transgéniques d'antigène de T (TAg)-genos (MTD2) par inoculation intra-splénique (ISPL). Les androgènes produits chez les souris mâles destinataires à la puberté initient l'expression de TAg sous le contrôle d'un promoteur foie-spécifique. En conséquence, les hépatocytes transférés deviennent des cellules cancéreuses et forment des masses de tumeur dans le cadre de la fibrose/cirrhose de foie. Ce nouveau modèle imite l'initiation et la progression humaines de HCC dans le contexte de la fibrose/cirrhose de foie et reflète les dispositifs les plus typiques de HCC humain comprenant le dysfonctionnement immunisé.

Introduction

Le cancer hépatocellulaire (HCC) est le type de cancer le plus rapidement croissant aux États-Unis (US)^1,2,3. Chaque année, environ 850 000 nouveaux cas sont diagnostiqués^4,5 et 700 000 patients meurent de cette maladie mortelle^6,7,8,9,10 , ce qui en fait la deuxième cause de décès lié au cancer dans le monde. La gestion de HCC inclut la résection chirurgicale, la transplantation, l'ablation, la chimioembolization, ou les thérapies systémiques, telles que le sorafenib^11. Le diagnostic et la gestion tôt avec la résection ou la transplantation chirurgicale ont l'avantage global de survie le plus élevé^4. Malheureusement, la majorité des patients présents à un stade ultérieur et nécessitent une prise en charge avec ablation, chimioembolisation ou sorafenib¹². Sorafenib, un inhibiteur de la tyrosine kinase récepteur (RTKI), a été approuvé par la Food and Drug Administration en 2008 comme la seule thérapie médicamenteuse systémique disponible pour le traitement de HCC non résécable. Bien que le médicament ne prévoit qu'une légère augmentation de la survie globale, de 7,9 à 10,7 mois¹³, il a fourni une nouvelle stratégie thérapeutique qui pourrait être utilisé pour gérer HCC.

Manipuler le système immunitaire pour éliminer les cancers établis est un domaine en croissance rapide dans la recherche sur le cancer¹⁴. Les études de point de contrôle immunitaire ont considérablement avancé le développement de médicaments immunothérapeutiques dans le traitement du cancer^15,16. La FDA a approuvé l'utilisation d'anticorps (Abs) contre l'antigène cytotoxique T-lymphocyte 4 (CTLA-4), la protéine de mort cellulaire programmée 1 (PD-1), et son ligand PD-L1 pour le traitement du mélanome, du cancer du poumon, du cancer de la tête et du cou, et du cancer de la vessie^{17, 18 ans, états-unis} qui ^{, 19 ans, états-unis} qui ^{, 20}. Les essais cliniques de monothérapie ou de thérapie combinée utilisant un ou plusieurs anticorps contre PD-1, PD-L1, ou CTLA-4 pour le traitement du HCC avancé sont en cours^21,22,23, et certains essais ont donné des résultats favorables. En 2017, la FDA a accordé l'approbation accélérée pour l'anticorps anti-PD-1 pour traiter les patients HCC, qui sont la résistance au sarafenib, mais le taux de réponse global de cette thérapie est seulement 14,3%. D'autres stratégies n'ont pas été traduites en pratique clinique pour le moment^24,25. Surmonter la tolérance immunitaire profonde induite par la tumeur pour améliorer la thérapie de point de contrôle immunitaire²⁶; prédire l'efficacité du traitement de contrôle immunitaire; prévenir les effets indésirables liés au système immunitaire; l'optimisation de l'itinéraire, de la posologie et de la fréquence de l'administration; et trouver des combinaisons efficaces de thérapies^27,28,29 restent toutes des tâches extrêmement difficiles.

Il existe plusieurs approches conventionnelles utilisées pour induire HCC dans les modèles de souris actuellement et sont utilisés en fonction de la question de recherche particulière de l'enquêteur³⁰. Les modèles chimiquement induits de souris de HCC avec des composés génotoxiques imitent la malignité injury-induite. Les modèles de xénogreffe par l'implantation ectopique ou orthotopic des lignées de cellules de HCC sont appropriés pour le criblage de drogue. Un certain nombre de souris génétiquement modifiées ont été conçues pour étudier la physiopathologie de HCC. Les souris transgéniques exprimant des gènes viraux, des oncogènes et/ou des facteurs de croissance permettent d'identifier les voies impliquées dans l'hépatocarcinogenèse. En raison des limitations inhérentes, ces modèles ne récapitulent pas les caractéristiques immunitaires typiques vues dans HCC humain, qui a considérablement empêché l'élucidation des mécanismes sous-jacents et le développement des stratégies immunothérapeutiques innovatrices^{14 ,15}. Nous avons récemment créé un modèle de murine cliniquement pertinent. Ce nouveau modèle imite non seulement l'initiation et la progression humaines de HCC mais reflète également les dispositifs les plus typiques de la maladie humaine comprenant le dysfonctionnement immunisé. Nous avons caractérisé ses caractéristiques biologiques et immunologiques. S'appuyant sur ce nouveau modèle, nous avons exploré diverses stratégies immunothérapeutiques pour traiter HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. Cette plate-forme unique nous permet d'étudier les mécanismes de l'immunotolérance induite par la tumeur et de développer des stratégies thérapeutiques de preuve de concept pour HCC vers la traduction clinique éventuelle.

Protocole

REMARQUE: Toute la procédure, y compris les sujets animaux ont été approuvés par l'IACUC à l'Université du Missouri. Toutes les souris ont reçu des soins humains selon les critères décrits dans le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire». La procédure suivante pour l'isolement cellulaire et l'inoculation doit être effectuée dans une hotte. Tous les artistes interprètes ou exécutants doivent porter l'équipement de protection individuelle standard pour la manipulation des souris et des tissus.

1. Induction de la fibrose hépatique et de la cirrhose avec injection IP de tétrachlorure de carbone (CCl₄)

REMARQUE : Voir la figure 1. (CCl₄ est réactif très dangereux, il doit être manipulé avec soin et avec le port de gants résistants aux produits chimiques)

1. Obtenir des souris mâles C57BL/6J âgées de six à huit semaines (voir Tableau des matériaux).
2. Préparer une solution de 10 % CCl₄ (v/v) dans de l'huile de maïs dans un tube de centrifugeuse. Déterminer le volume total en fonction du nombre de souris à injecter (voir l'étape 1.6).
3. Utilisez la technique de manipulation appropriée des souris pour sélectionner une souris pour l'injection.
4. Retenez manuellement la souris avec son côté dorsale (abdomen) vers le haut.
5. Nettoyer le site d'injection sur la paroi abdominale de la souris en frottant avec 70% d'alcool.
6. Injecter des souris mâles C57BL/6J avec 160 l de 10 % de solution CCl₄ par injection intrapéritonéale (IP) à l'aide d'une aiguille jetable de calibre 25.
7. Assurez-vous que l'aiguille pénètre juste à travers la paroi abdominale (environ 4-5 mm) avec le côté bevel vers le haut et légèrement incliné e à 15-20 degrés.
8. Injectez des souris deux fois par semaine pour un total de quatre semaines - chaque souris recevra un total de huit injections.
   REMARQUE : Deux semaines après la dernière injection, les souris traitées sont prêtes pour l'inoculation d'ISPL des hépatocytes oncogènes des souris de MTD2.

2. Isoler les hépatocytes tagogènes des souris Line MTD2

REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes de solutions.

10x Earle's Balanced Salt Solution sans Ca ou Mg (EBSS sans Ca ou Mg)	4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g de NaH2PO4 H2o 10 g de dextrose Ajouter de l'eau à 1 litre, pH à 4,32 Passer par le filtre
Solution 1	20 mL 10x EBSS sans Ca ou Mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1,5 M d'hélice 10 ml de 10 ml EGTA Ajouter de l'eau à 200 ml
Solution 2	100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Ajouter de l'eau à 1 litre
Solution de collagène de 0,75 %	15 mg de collagène de type 1 20 ml de solution 2
Moyen complet	2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x Pénicilline-Streptomycine

Tableau 1 : Recettes de solution.

1. Obtenir des souris MTD2³⁸ pour servir de source d'hépatocytes oncogènes.
2. Anesthésiez les souris MTD2 de 5 semaines à l'aide d'isoflurane de 2,5 %.
   REMARQUE : Une bonne anesthésiation sera vérifiée par la méthode de pincement des orteils. En bref, à l'aide de deux doigts, donner à l'orteil de la souris / pied une bonne pression. S'il n'y a pas de réaction de sevrage, l'animal est jugé assez profond pour commencer la chirurgie.
3. Lorsqu'ils sont suffisamment sédatifs, placez les souris en position de supine et fixez les extrémités avec du ruban adhésif pour fournir une exposition adéquate de la surface abdominale.
4. Effectuer une incision laparotomie midline à l'aide de ciseaux le long de la ligne alba assez grand pour fournir une exposition adéquate du foie.
5. Déplacer les intestins vers la gauche pour fournir une meilleure exposition du foie et triade portail.
6. Disséquer au-dessus du foie pour exposer le cava de veine inférieur (IVC).
7. Ligate l'IVC au-dessus du foie à l'aide d'une pince à artère.
8. Pour en revenir à la bordure inférieure du foie, utilisez une aiguille de papillon (voir les matériaux) pour accéder IV à la veine du portail. Fixer le cathéter à la main.
9. Perfil le foie de souris successivement à l'aide d'une seringue d'injection à 8,9 ml/min avec 15 ml de solution 1, 15 ml de solution de collagène de 0,75% 2, et 15 ml de solution 2 via le cathéter.
10. Récoltez le foie perfusé en coupant et en prenant la masse tumorale des souris de MTD2 dans un tube conique de 50 ml avec 10-15 ml de PBS.
11. Retirez PBS et lavez un temps supplémentaire avec PBS; ne pas centrifuger à cette étape.
12. Couper le foie en petits morceaux à l'aide de ciseaux, puis laver à nouveau avec PBS 2x pour enlever le sang restant.
13. Ajouter 5 ml de milieu COMPLET de RPMI au tube conique et hacher continuellement le foie avec des ciseaux en petits morceaux (lt;3 mm)-tissu devrait passer en douceur par une pipette de 5 ml.
14. Ajouter RPMI complet à un volume final de 30 ml et suspendre le foie à l'aide d'une pipette de 5 ml.
15. Filtrer la solution mixte à l'utilisation d'une passoire de 70 m dans un tube conique de 50 ml.
16. Laver la passoire plusieurs fois avec RPMI complet et ajuster le volume final à 50 ml en ajoutant un support RPMI supplémentaire.
17. Faire tourner rapidement la suspension par centrifugeuse jusqu'à un maximum de 500 tr/min; une fois que la vitesse est accélérée à 50 x g,la centrifugeuse doit être arrêtée.
18. Décant le supernatant et suspendez les granulés dans 20 ml de PBS.
19. Compter les cellules à l'aide de l'exclusion bleue Trypan et un hémocytomètre, puis ajuster la concentration cellulaire à 2,5 x 10⁶/mL pour l'inoculation cellulaire suivante.
    REMARQUE: Le rendement attendu de 5 grammes de tissu tumoral est de 80 millions d'hépatocytes avec la viabilité de 'gt;95%.

3. Inoculation des hépatocytes des souris MTD2 au foie des souris sauvages de type C57BL/6J par injection d'ISPL

1. La technique aseptique doit être utilisée dans toutes les procédures
2. Anesthésier les souris C57BL/6J mâles traitées cCl₄avec 2,5% d'isoflurane, les souris doivent être traitées avec du lubrifiant pour les yeux pour empêcher les yeux de se dessécher.
3. Préparer des seringues avec 200 l d'hépatocytes pour l'injection.
4. Lorsqu'il est suffisamment sédatif, placez les souris avec le côté gauche vers le haut.
5. Raser tout le flanc gauche des souris, puis frotter la zone, en alternant entre 70% d'alcool et de bêtadine trois fois.
6. Administrer 5 mg/kg de carprofène sous-cutané ouly avant l'incision chirurgicale.
7. Faire une incision de 1 cm sur le flanc gauche parallèle à la côte 13^e de l'extrême dorsal début juste en dessous du muscle de la colonne vertébrale.
8. Identifiez la rate, puis extériez-la à l'aide de forceps à pointe émoussée.
9. Clip la rate avec deux clips de titane de taille moyenne. Placez les deux clips entre l'artère splénique et la veine, laissez de la place entre les clips pour couper plus tard après l'inoculation.
   REMARQUE : L'objectif est d'isoler le pôle inférieur de la rate afin de réduire le risque d'ensemencement.
10. Injecter 200 L (0,5 million) d'hépatocytes préparés dans le pôle inférieur de la rate à l'aide d'une aiguille de 27 G.
11. Clip la branche inférieure du pédicle (navires à pôles spléniques inférieurs) avec un clip de taille moyenne.
12. Couper la rate entre les deux clips initialement placés.
13. Enlever le poteau inférieur de la rate qui a été directement injecté avec des cellules tumorales.
14. Utilisez 3-0 polyglactin 910 interrompu suturing pour fermer la couche musculaire interne.
15. Utilisez des pinces à plaies en acier stérilisées pour fermer la couche externe de la peau.
    REMARQUE : Les clips en acier sont préférés aux sutures pour éviter que les animaux ne mâchent des sutures, laissant une plaie béante.
16. Administrer 5 mg/kg de carprofène sous-cutané après la suture.
17. Placez tous les animaux en convalescence sur un coussin chauffant à température contrôlée et surveillez de près jusqu'à ce qu'ils soient complètement remis de l'anesthésie.
18. Donnez aux souris un accès gratuit à l'eau après la chirurgie. Si la souris se déshydrate pendant la chirurgie, administrez des liquides sous-cutanés (1 ml).
19. Enlever les pinces de peau à 7-10 jours postopératoirement.

Résultats

Des hépatocytes oncogéniques isolés chez des souris transgéniques TAg (figure 2) ont été ensemencés dans le foie de souris de type sauvage par injection intra-splénique (figure 3). Les hépatocytes transplantés avec succès et fiable augmenté tumeurs orthotopiques HCC (Figure 4) avec la tumeur spécifique antigène SV40 TAg (Figure 5) dans le cadre de l'inflammation hépatique et la fibrose ( Figure1).

Discussion

Avec ce protocole, nous avons établi un modèle murine fiable et reproductible de HCC qui imite l'initiation et la progression humaines de HCC. Cliniquement, de nombreux facteurs de risque induisent successivement des lésions hépatiques, la fibrose hépatique, la cirrhose et l'étape finale de HCC. Dans notre protocole, l'injection IP de CCl₄ est utilisée pour produire d'abord la fibrose hépatique chez les souris de type sauvage, ce qui permet aux hépatocytes oncogènes suivants de former les tumeurs dan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close