Une stratégie convergente pour la génération d'une bibliothèque d'ADNc pratiquement séquencée à partir d'huîtres du Pacifique non référencées

Résumé

Nous décrivons une stratégie pour l'utilisation d'échantillons d'ARN à partir de spécimens d'huîtres du Pacifique non référencés, et évaluons le matériel génétique par comparaison avec les données génomiques accessibles au public pour générer une bibliothèque d'ADNc pratiquement séquencée.

Résumé

L'accès au matériel biologique des espèces de référence, qui ont été utilisés précédemment dans des expériences clés telles que dans le développement de nouvelles lignées cellulaires ou de projets de séquençage du génome, est souvent difficile à prévoir pour d'autres études ou des tiers en raison de la nature consommatrice des échantillons. Bien qu'ils soient maintenant largement répartis sur les côtes du Pacifique de l'Asie, de l'Australie et de l'Amérique du Nord, les spécimens individuels d'huîtres du Pacifique sont génétiquement très diversifiés et ne conviennent donc pas directement comme matériau de départ pour les bibliothèques de gènes. Dans cet article, nous démontrons l'utilisation de spécimens d'huîtres du Pacifique non référencés obtenus sur les marchés régionaux des fruits de mer pour générer des bibliothèques d'ADNc. Ces bibliothèques ont ensuite été comparées au génome d'huîtres accessible au public, et la bibliothèque connexe la plus proche a été sélectionnée à l'aide des gènes de référence mitochondriaux Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) et NADH Dehydrogenase (ND). La pertinence de la bibliothèque d'ADNc générée est également démontrée par le clonage et l'expression de deux gènes codant les enzymes UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) et UDP-xylose synthase (UXS), qui sont responsables de la biosynthèse de UDP-xylose de UDP-glucose.

Introduction

L'acquisition de matériel biologique référencé vivant peut être difficile en raison des longs délais de livraison, du raisonnement entrepreneurial ou de la réglementation douanière par pays. Comme alternative, le matériel biologique requis peut également être recueilli à partir de spécimens phénotypiquement identiques. Cependant, ces échantillons peuvent varier considérablement au niveau du génotype, et donc les comparaisons avec les génomes de référence stockés numériquement de la même espèce sont souvent rendues difficiles, voire futiles en raison de l'incompatibilité du matériel nouvellement méthodes d'amplification de l'ADN existantes. Le séquençage des gènes hautement conservés d'échantillons individuels est un outil largement utilisé et puissant pour identifier les espèces¹, telles que les gènes mitochondriaux conservés qui sont fréquemment utilisés comme gènes de référence pour l'évaluation de la qualité des bibliothèques d'ADNc^{2 ,3,4,5,6}. La raison sous-jacente de la méthode présentée dans le présent est que la conservation élevée des séquences de gènes mitochondriaux dans des échantillons d'huîtres anonymes individuels par rapport aux séquences correspondantes du génome de référence indique que d'autres gènes peuvent également montrer un faible niveau de divergence, étant donné le taux généralement plus rapide d'évolution de l'ADN mitochondrial par rapport à l'ADN nucléaire⁷, permettant l'amplification et l'isolement d'un large éventail de gènes scientifiquement et industriellement pertinents en utilisant simplement publiquement données de séquençage disponibles à titre de référence.

L'objectif global de la méthode décrite ci-dessus est de présenter un flux de travail optimisé pour générer une bibliothèque d'ADNc d'huîtres pratiquement séquencée qui peut être utilisée comme modèle d'ADN pour le clonage des gènes de l'huître. Dans le séquençage virtuel, le séquençage du génome de novo est contourné; au lieu de cela, une séquence de référence connue et stockée numériquement est utilisée directement pour utiliser ou concevoir des amorces pour la production de cDNA qui finiront par constituer une bibliothèque (ou être ajoutées à une bibliothèque préexistante). L'objectif est de produire une bibliothèque convergente d'ADNc, ce qui signifie que les similitudes entre les séquences d'ADNc générées et la séquence de référence peuvent être classées de faible à haute divergence. Un avantage clé de l'utilisation de Cytochrome C Oxidase subunit 1 (COX1) et NADH Dehydrogenase (ND) comme gènes de référence est que même les spécimens d'huîtres très disjonctées géographiquement peuvent être profilés en raison de la haute conservation de ces gènes mitochondriaux. Après avoir prouvé l'approche avec ces marqueurs bien établis, nous démontrons alors son application à deux candidats enzymatiques qui sont impliqués dans la biosynthèse des nucléotides de sucre et peuvent être d'une pertinence industrielle^{8,9, 10}. Le potentiel biotechnologique de l'huître du Pacifique est encore inexploré. Ainsi, nous croyons que cette méthode convergente pour la préparation d'une bibliothèque d'ADNc pratiquement séquencée sera également appropriée pour les chercheurs non-spécialistes qui veulent générer de l'ADNc à partir de ce matériel biologique pertinent.

Protocole

REMARQUE : Un aperçu schématique est affiché à la figure 1.

1. Collecte d'échantillons

1. Obtenir des spécimens d'huîtres. Conserver les huîtres sur la glace pendant la période post-récolte, le transport et avant l'utilisation et le traitement en laboratoire dans les 4 à 7 jours suivant l'achat.
   REMARQUE : Pour ce protocole, des huîtres ont été achetées au marché de gros de Zhong Cai à Nanjing (provenant de Ningde, Fujian, Chine et Lianyungang, Jiangsu, Chine), Haijie Aquatic Product Company à Qingdao (originaire de Qingdao, Shandong, Chine), Jucheng Aquatic Product Company à Yantai (originaire de Yantai, Shandong, Chine) et Jinxiu Aquatic Product Company à Qingdao (originaire de Qingdao, Shandong, Chine).).

2. Isolement d'ARN par extraction de piocyanate-phénol de guanidinium

1. Préparation de l'échantillon de tissu d'huître
   1. Découper environ 100 mg de tissu mou homogène du centre géométrique approximatif de chaque spécimen d'huître avec un scalpel stérilisé, et transférer les échantillons en azote liquide.
   2. Euthanasier la partie restante des huîtres en congelant à -80 oC pendant 1 h et jeter comme déchets biologiques.
   3. Broyer le tissu d'huîtres congelé saxède dans une poudre fine dans un mortier (200 ml) rempli de 50 ml d'azote liquide.
   4. Peser 75 mg du tissu congelé de chaque spécimen dans un tube stérile de centrifugeuse de 1,5 ml et mélanger avec 1 ml de réagent d'extraction de piocyanate-phénol de guanidinium. Centrifuger l'échantillon à 14 000 x g à 4 oC pendant 15 min.
2. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 ml, ajouter 200 l de chloroforme et bien mélanger à l'aide d'un mélangeur à vortex pendant 10-15 s jusqu'à ce que le mélange devienne blanc laiteux.
3. Centrifugeuse à 14 000 x g à 4 oC pendant 15 min, et transférer soigneusement la couche supérieure aqueuse à l''eau d'une pipette de 200 l sans perturber l'interphase dans un nouveau tube centrifugeur de 1,5 mL.
4. Ajouter 500 l d'alcool isopropyl et mélanger les échantillons doucement par inversion, puis laisser les échantillons pendant 20 min sur la glace. Centrifugeuse à 14 000 x g à 4 oC pendant 8 min et retirer le supernatant.
5. Suspendre chacune des granulés dans 1 ml de 75 % et centrifugeuse à 14 000 x g à 4 oC pendant 5 min. Retirez tout le supernatant.
6. Répétez l'étape 2.5 une fois. Sécher les granulés pendant 6 min à température ambiante. Ne pas sécher plus longtemps; sinon, il peut être difficile de dissoudre la pastille d'ARN à l'étape suivante.
7. Dissoudre la pastille d'ARN séchée dans 25 'L d'eau traitée par DEPC (diethylpyrocarbonate) et garder le tube sur la glace. Utilisez des échantillons d'ARN dans les 24 h.

3. génération de bibliothèque de cDNA par transcription inversée

1. Pour chaque échantillon d'ARN, préparer un mélange de réaction à l'aide d'un système de transcription inverse commercial à l'aide d'une pipette de 10 l : Ajouter 4 l de solution MgCl 2, 2 l de 10x Reaction Buffer, 2 'L de solution dNTP, 0,5 'L d'inhibiteur de rNase, 0,7 'L de AMV Reverse Transcriptase, 0,5 L d'Oligo (dT) 15 apprêt, 1 L de l'échantillon d'ARN extrait et 9,3 L de H₂O dans un tube PCR de 300 l.
2. Incuber le mélange dans un thermocycler PCR pendant 60 min à 42 oC, puis augmenter la température à 95 oC pendant 5 min.
3. Entreposez la bibliothèque d'ADNc générée jusqu'à 12 mois à -20 oC.

4. Amplification et purification des gènes mitochondriaux

1. Préparer le mélange de PCR à l'aide d'une pipette de 10 l. Ajouter 0,25 L (1,25 U) de polymérase d'ADN haute fidélité, 2 l de solution dNTP (2,5 ml de chaque dNTP), 0,5 l de l'amorce avant COX1 ou ND (100 M), 0,5 l de l'amorce inverse COX1 ou ND correspondante (100 M), 1 l de la bibliothèque de l'ADNC , 5 L de solution tampon 5x et 16 oL de H₂O distillé dans un tube PCR de 300 l.
2. Effectuer l'amplification du PCR en utilisant les paramètres suivants : Après une première étape de dénaturation à 95 oC (durée 5 min), 35 cycles de réaction PCR consistant en une étape d'annealing à 55 oC (30 s), une étape d'allongement à 72 oC (2 min) et une étape de dénaturation à 95 oC (30 s) , effectuer une étape d'allongement finalisant pendant 5 min à 72 oC.
3. Utilisez 5 L du produit PCR pour vérifier par électrophoresis gel d'agarose la qualité du produit PCR obtenu. Observez le gène amplifié COX1 ou ND en une seule bande à 759 ou 748 paires de base, respectivement.
4. Purifie le reste du produit PCR avec un kit de nettoyage PCR.
   1. Ajouter 100 l de solution 'PCR-A' (tampon de liaison d'ADN qui contient des concentrations élevées de sels chaotropes¹¹) à l'échantillon. Vortex brièvement pour mélanger le contenu.
   2. Placer la colonne de purification dans un tube centrifugeur de 2 ml. Pipette le mélange de réaction de 4.4.1. dans la colonne. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
   3. Jeter le filtrate du tube de centrifugeuse. Remettre la colonne dans le tube de centrifugeuse de 2 ml, ajouter 700 l de solution ' W2' dans la colonne et centrifugeuse à 14 000 x g pendant 1 min à température ambiante (« W2 » est une solution de lavage qui contient de fortes concentrations d'éthanol pour l'élimination des chaotropes résiduelles sels de la colonne de purification).
   4. Jeter le filtrate et remettre la colonne dans le tube de centrifugeuse de 2 ml. Ajouter 400 oL de solution ' W2' à la colonne et à la centrifugeuse à 14 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
   5. Préchauffer 1 ml d'eau déionisée à 65 oC dans un chauffe-blocs métalliques. Transférer la colonne dans un nouveau tube centrifugeur de 1,5 mL. Pipette 25 'L de l'eau désionisée préchauffée à la chaleur de 65 oC au centre de la membrane de la colonne blanche. Laisser tremper la membrane pendant 1 min à température ambiante.
   6. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 1 min à température ambiante et jetez la colonne.
5. Entreposez le produit PCR purifié jusqu'à 12 mois à -20 oC.

5. Séquençage et comparaison de gènes mitochondriaux

1. Envoyez les échantillons de PCR purifiés de l'étape 4.5 pour le séquençage De Sanger à l'aide des amorces avant COX1 ou ND pertinentes comme amorces de séquençage. En option, les amorces inverses COX1 ou ND peuvent également être utilisées pour le séquençage bidirectionnel.
2. Après avoir récupéré les résultats du séquençage, comparez les séquences avec la séquence génomique de la souche de référence des huîtres du Pacifique (ID de taxonomie NCBI : 29159) à l'aide de l'outil en ligne NCBI Nucleotide BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov) (figure2 et figure 3 ).

6. Application de la bibliothèque d'ADNc pour le clonage des gènes MgUGD et MgUXS

1. Amplifiez et purifionz les gènes MgUGD et MgUXS à l'aide des amorces avant et inverses respectives de MgUGD et MgUXS par PCR suivant les étapes 4.1. à 4,4.
2. Transférer 2 ll de tampon de digestion (10x concentré) et 6 l d'eau déionisée dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL. Ajoutez 10 L des produits purifiés MgUGD ou MgUXS PCR ainsi que la restriction endonucleases Nde I et Xho I (1 l chacun, 20 U). Incuber à 37 oC pendant 3 h.
3. Préparer le vecteur pET-30a prédigéré : Transférer 500 ng du vecteur pET-30a dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 mL et recharger le volume à 16 L à l'aide d'eau désionisée. Ajouter 2 ll de tampon de digestion (10x concentré) avec la restriction endonucleases Nde I et Xho I (1 L chacun, 20 U).
   1. Après avoir incubé le mélange à 37 oC pendant 3 h, ajouter 1 l de phosphatase alcaline (1 U) et couver à 37 oC pendant une heure supplémentaire. Inactiver la phosphatase alcaline en chauffant à 75 oC pendant 10 min dans un chauffe-blocs métalliques préchauffé.
4. Transférer 4 ll des produits d'ADN MgUGD ou MgUXS digérés dans des tubes frais de centrifugeuse de 1,5 ml et ajouter 4 l l du vecteur pET-30a digéré. Ajouter 1 l de tampon de ligation (10x), 1 l de ligase T4 (3 U) et incuber le mélange de réaction à 22 oC pendant 3 h.
5. Transformez les cellules electrocompétentes E. coli Mach1 Competent Cells par électroporation à l'aide des produits de ligature. Étendre les cellules transformées sur des plaques d'agar LB contenant 50 og/mL de kanamycine. Incuber les cellules à 37 oC pendant 16 h.
6. Vérifier les colonies pour l'insertion souhaitée par le séquençage Sanger à l'aide du plasmide spécifique T7 promoteur et amorces terminator. Préparer les plasmides à partir des clones bactériens validés.

7. Tests d'expression et d'activité de MgUGD et MgUXS

1. Transformez E. coli BL21 (DE3) Cellules compétentes avec des plasmides portant les gènes MgUGD et MgUXS et propagez les cellules transformées sur des plaques d'agar LB contenant 50 g/mL de kanamycine. Incuber les cellules à 37 oC pendant 16 h.
2. Cultiver une seule colonie dans un milieu lb de 5 ml avec 50 g/mL de kanamycine pendant la nuit. Transférer la culture dans un milieu LB de 400 ml et secouer continuellement à 200 tr/min à une température de 37 oC jusqu'à ce que la densité optique à une longueur d'onde de 600 nm (OD₆₀₀) atteigne une absorption d'environ 0,5.
   1. Réduire la température d'incubation à 20 oC et ajouter 400 oL d'isopropyl-D-thiogalactopyranoside (concentration de 1 M). Induire l'expression des protéines recombinantes pendant 3 h.
3. Récolter les cellules par centrifugation à 4 500 x g pendant 15 min à 4 oC. Suspendre les granulés dans 10 ml de tampon de lyse (100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 1 % Triton X-100, 1 mM de phénylmethylsulfonyl- fluorure (PMSF), pH 8,0).
4. Perturber les cellules par sonication pendant 20 min (40 cycles d'on/off avec une amplitude de 20 m pour 15 s à 4 oC). Centrifugeuse à 14 000 x g à 4 oC pendant 20 min et collecte le supernatant pour le test d'activité.
5. Effectuer l'exemple d'activité de MgUGD en couvant 2 l de lysate cellulaire avec 2 l d'UDP-glucose (10 mM), 4 L de NAD (10 mM), 4 oL de MgCl₂ (10 mM), 2 l de tampon Tris/HCl (500 mM, pH 7,5), et 6 l de H₂Deionized tube de centrifugeuse mL et incuber à 37 oC pendant 30 min.
6. Effectuer l'essai d'activité de MgUXS en couvant 2 l l de lysate cellulaire avec 2 L d'acide UDP-glucuronique (10 mM), 2 l de tampon Tris/HCl (500 mM, pH 7,5), et 14 l de H₂O déionisé dans une nouvelle tube de centrifugeuse de 1,5 mL et incubée à 37 m.
7. Étancher les réactions à l'étape 7.5 et 7.6 en ajoutant 20 l de méthanol et 40 l de chloroforme à chaque mélange. Après le vortex des mélanges d'échantillon, centrifugeuse à 14.000 x g pendant 6 min à 4 oC et de recueillir la couche supérieure aqueuse de chaque tube.
8. Analyser les produits de réaction à l'aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF en mode ionisation négative dans la gamme m/z de 500 à 700. Mélanger 1 ll de mélange d'échantillon avec 1 'L de matrice d'échantillon d'acide dihydroxybenzoïque de 2,5 -dihydroxybenzoic (1% w/V dans 50% acetonitrile aqueuse). Observez les valeurs m/z attendues à 579 et 535 pour l'acide UDP-glucuronique et l'UDP-xylose, respectivement (figure 4).

Résultats

La figure 1 montre un aperçu schématique de la méthode de préparation décrite de la bibliothèque convergente de l'ADNc dérivée d'individus d'huîtres du Pacifique. La figure 2 montre les séquences des gènes COX1 et ND d'un spécimen d'huîtres apparenté éloigné avec une forte divergence des séquences de gènes COX1 et ND du matériau de référence. La figure 3 montre les séquences des gènes COX1 et ND d'un spécimen...

Discussion

Le protocole présenté permet l'identification génétique de spécimens d'huîtres non référencés avec un phénotype similaire provenant des marchés régionaux des fruits de mer en comparant les gènes COX1 et ND avec une base de données du génome de l'ADN des huîtres accessible au public. L'importance de cette méthode réside dans sa simplicité, car une seule réaction PCR est nécessaire pour l'évaluation de la bibliothèque d'ADNc virtuelle. Les deux gènes mitochondriaux conservés de COX1 et de ND ont é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
1% Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	*Alternative distributors possible
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Alfa Aesar	490-79-9	*Alternative distributors possible
Acetonitrile	Merck	75-05-8	*Alternative distributors possible
Agarose for molecular biology	Biowest Chemicals	111860	*Alternative distributors possible
Ampicilin	Solarbio	69-52-3	*Alternative distributors possible
Chloroform	Lingfeng, Shanghai	67-66-3	*Alternative distributors possible
DEPC water	Thermo Scientific	R0601
Ethanol	Jinhuada, Guangzhou	64-17-5	*Alternative distributors possible
Guanidinium thiocyanate-phenol reagent	Invitrogen	15596018	TRIzol reagent
Imidazole	Energy Chemical	288-32-4	*Alternative distributors possible
Isopropyl alcohol	Nanjing Chemical Reagent	67-63-0	*Alternative distributors possible
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside	Solarbio	367-93-1	*Alternative distributors possible
Kanamycin	Solarbio	25389-94-0	*Alternative distributors possible
LB Agar	Thermo Fisher	22700025	*Alternative distributors possible
LB Broth	Thermo Fisher	10855021	*Alternative distributors possible
Methanol	Jinhuada, Guangzhou	67-56-1	*Alternative distributors possible
MgCl2 hexahydrate	Xilong Huagong	7791-18-6	*Alternative distributors possible
NaCl	Xilong Huagong	7647-14-5	*Alternative distributors possible
NAD+	Duly Biotech	53-84-9	*Alternative distributors possible
Phenyl-methylsulfonyl fluoride	Macklin	329-98-6	*Alternative distributors possible
Tris	Solarbio	77-86-1	*Alternative distributors possible
UDP-glucose	Wuhu Nuowei Chemicals	28053-08-9	*Alternative distributors possible
UDP-glucuronic acid	SIGMA	63700-19-6	*Alternative distributors possible
Tools/Instruments:
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex	*Alternative distributors possible
Metal block heater	Long Yang Scientific Instruments	Thermoshaker HB20	*Alternative distributors possible
PCR thermocycler	Hema	9600	*Alternative distributors possible
Enzyme and Kits:
10×Ligation buffer	Thermo Scientific	B69	*Alternative distributors possible
5×PrimeSTAR buffer	Takara	9158A
Alkaline phosphatase	ThermoFisher FastAP	EF0654	*Alternative distributors possible
COX forward primer	Genscript	ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG
COX reverse primer	Genscript	ACTTGACCAAAAACATAAGACATG
Cutsmart Buffer	NEB	B7204S	*Alternative distributors possible
dNTP mix	Invitrogen	18427088
MgUGD forward primer	Genscript	ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT
MgUGD reverse primer	Genscript	ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG
MgUXS forward primer	Genscript	CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC
MgUXS reverse primer	Genscript	ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT
ND forward primer	Genscript	ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT
ND reverse primer	Genscript	ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC
PCR Cleanup Kit	AxyGen	AP-PCR-250	*Alternative distributors possible
pET-30a(+) vector	Merck Millipore	69909