Génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce

Résumé

Le but de ce protocole est de génotype de l'anémone de mer Nematostella vectensis pendant la gastrulation sans sacrifier l'embryon.

Résumé

Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotype l'embryon de stade de gastrula du vectensis cnidaire anthozoan nematostella sans sacrifier la vie de l'animal. Après la fécondation in vitro et la dégelée, les zygotes sont autorisés à se développer pendant 24 h à température ambiante pour atteindre le stade précoce à moyen-gastrula. Les embryons de gastrula sont ensuite placés sur un lit de gel d'agarose dans un plat Petri contenant de l'eau de mer. Sous le microscope disséquant, une aiguille de tungstène est utilisée pour séparer chirurgicalement un fragment de tissu aboral de chaque embryon. Les embryons post-chirurgical sont ensuite autorisés à guérir et à poursuivre leur développement. L'ADN génomique est extrait du fragment de tissu isolé et utilisé comme modèle pour le PCR spécifique au locus. Le génotype peut être déterminé en fonction de la taille des produits PCR ou de la présence ou de l'absence de produits PCR spécifiques à l'allèle. Les embryons post-chirurgical sont ensuite triés en fonction du génotype. La durée de l'ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d'embryons à dépister, mais il faut au minimum 4 à 5 h. Cette méthode peut être utilisée pour identifier les mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'embryons et permet d'analyser les phénotypes au cours du développement.

Introduction

Les Cnidariens représentent un groupe diversifié d'animaux qui comprennent les méduses, les coraux et les anémones de mer. Ce sont des diploblastes, composés d'ectoderm et d'endoderm qui sont séparés par une matrice extracellulaire (mesoglea). Cnidaria est un groupe sœur pour spécifier Bilateria, à laquelle les modèles animaux traditionnels tels que Drosophila et Mus appartiennent¹. En outre, on pense que la divergence Cnidaria-Bilateria s'est produite dans la période précambrienne². En tant que tel, les études comparatives des cnidaires et des bilateriens sont essentielles pour obtenir des perspicacités dans la biologie de leur ancêtre commun le plus récent. Récemment, la génomique comparative a révélé que les cnidaires et les bilateriens partagent de nombreux gènes de boîte à outils de développement tels que l'encoche et la bHLH, ce qui implique que leur ancêtre commun avait déjà ces gènes³. Cependant, le rôle de ces gènes de boîte à outils développementales dans le dernier ancêtre commun de Cnidaria et De Bilateria est comparativement moins bien compris. Pour résoudre ce problème, il est essentiel d'étudier comment ces gènes profondément conservés fonctionnent chez les cnidaires.

L'un des nouveaux modèles génétiques cnidaires est l'anthozoan Nematostella vectensis. Son génome a été séquencé³, et une variété d'outils génétiques, y compris le knockdown de gène morpholino-négocié, la transgenèse meganuclease-négociée, et LES knockins et knockouts de gène CRISPR-Cas9-négociés, sont maintenant disponibles pour l'usage dans cet animal. En outre, le développement de Nematostella est relativement bien compris. Pendant l'embryogenèse, la gastrulation se produit par invagination⁴, et l'embryon se développe en une larve de planula de nage libre. La planule se transforme ensuite en polype sessile avec une bouche et des tentacules circonraux. Le polype grandit alors et atteint la maturité sexuelle.

CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis ciblé est maintenant couramment utilisé pour étudier la fonction génique dans Nematostella vectensis^5,6,7,8,9. Pour générer des mutants knock-out dans Nematostella, un cocktail contenant locus-spécifique RNA mono-guide et la protéine Cas9 endodocléuale est d'abord injecté dans les œufs non fécondés ou fécondés pour produire des animaux fondateurs F0 qui montrent généralement mosaïsme. Les animaux F0 sont ensuite élevés à maturité sexuelle et croisés les uns avec les autres pour produire une population de F1, dont un sous-ensemble peut être ko en état de mutation⁶. Alternativement, les animaux F0 sexuellement matures peuvent être croisés avec des animaux de type sauvage pour générer des animaux hétérozygotes F1, et les hétérozygotes F1 qui portent un allèle knock-out dans le lieu d'intérêt peuvent alors être croisés les uns avec les autres pour produire la progéniture F2, un quart dont on s'attend à ce qu'il s'agit de mutants knock-out⁵. Les deux approches nécessitent une méthode pour identifier les mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène. Les tentacules de polype peuvent être employéspour extraire l'ADN génomique pour le génotypage 6,⁷. Cependant, dans les cas où la fonction développementale du gène d'intérêt est étudiée et où les embryons mutants n'atteignent pas le stade du polype (c.-à-d. en raison de la létalité larvaire associée à la mutation), les mutants knock-out doivent être identifiés tôt dans l'ontogéne. Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotyper des animaux individuels au stade de gastrula sans sacrifier l'animal, qui permet d'identifier des mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'embryons. La durée de l'ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d'embryons à dépister, mais il nécessite un minimum de 4-5 h.

Protocole

1. Induction du frai, de la fécondation in vitro et de la dégelée

1. Maintenir Nematostella vectensis dans l'eau de mer avec une salinité de 12 parties par millier (ppt) dans l'obscurité à 16 oC, alimentant Artemia tous les jours.
2. La veille de l'induction du frai, placez les animaux dans un incubateur à température et à lumière. Programmez l'incubateur de sorte que les animaux soient exposés à 8 h de lumière à 25 oC. Facultatif : Nourrissez un petit morceaud'huître (1 mm 3) d'huîtres à des animaux individuels avant de les placer dans l'incubateur pour améliorer le frai.
3. Laisser les animaux dans l'incubateur pendant 1 h à 16 oC.
4. Retirez les animaux de l'incubateur et laissez-les sur un banc avec de la lumière à température ambiante (RT) pour permettre le frai. Le frai se produit habituellement dans les 1,5 à 2 h suivants.
5. Si les mâles et les femelles sont dans des contenants séparés, placez les paquets d'œufs du contenant femelle dans un contenant mâle contenant des spermatozoïdes à l'aide d'une pipette de transfert dont la pointe est coupée pour agrandir l'ouverture afin que les œufs ne soient pas endommagés par un stress mécanique pendant transférer. Laisser les œufs être fécondés en les laissant dans le récipient mâle pendant au moins 15 min.
6. Dégelée les paquets d'œufs dans l'eau de mer contenant 3% de cystéine (pH 7.4) sur un plat Petri ou dans un tube de 15 ml. Agiter doucement sur un shaker pendant 12 min.
7. Utilisez une pipette en plastique pour briser les touffes et continuer à agiter pendant un autre 2-3 min jusqu'à ce que complètement déjellied.
8. Enlever la cystéine en remplaçant les médias par de l'eau de mer fraîche pendant au moins 5 x.
9. Gardez les œufs fécondés sur un plat Petri en verre à 16 oC ou RT.

2. Enlèvement chirurgical d'un tissu aboral d'un embryon de gastrula

1. Préparer un tampon d'extraction d'ADN composé de 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3 % Tween20, 0,3 % NP40 et 1 mg/mL de protéinase K. Utilisez 20 mL de tampon d'extraction par embryon. Bien mélanger en vortexant et aliquot le tampon dans les tubes PCR.
2. Dissoudre 1% d'agarose dans l'eau de mer et verser dans un plat Petri pour couvrir le fond. Refroidir sur un banc pour faire un lit en gel. Verser l'eau de mer fraîche pour couvrir le lit de gel dans le plat Petri.
3. Transférer 24 h d'embryons post-fertilisation (hpf) (stade précoce à mi-gastrula) dans le plat Petri contenant un lit de gel agarose.
4. Insérez une aiguille de tungstène dans un porte-aiguille et stérilisez en trempant la pointe de l'aiguille dans de l'alcool (70 % ou plus) et en la mettant en flammes pour brûler l'alcool.
5. Sous un microscope à disséquer (à 20x à 40x grossissement), utiliser l'aiguille de tungstène pour faire une dépression sur le lit agarose en enlevant un morceau d'agarose de surface de la taille d'un embryon à manipuler, et placez l'embryon sur la dépression avec son latéral côté vers le bas afin de restreindre le mouvement de l'embryon pour la microchirurgie.
6. Utilisez l'aiguille de tungstène pour exciser chirurgicalement un morceau de tissu aboral situé en face de l'ouverture blastorale orale. Un tiers à un quart du tissu embryonnaire le long de l'axe oral-aboral est généralement suffisant.
7. Utilisez une pipette P20 pour transférer le tissu aboral isolé (en lt;2 ml) dans un tube PCR contenant 20 ml de tampon d'extraction d'ADN.
8. Transférer l'embryon post-chirurgical dans un puits contenant au moins 500 ml d'eau de mer fraîche dans une assiette de 24 ou 96 puits.
9. Répétez les étapes 2.4-2.8 pour le nombre d'embryons au besoin.
10. Placez la plaque de puits contenant des embryons post-chirurgical dans un incubateur à 16 oC ou RT jusqu'à ce que le génotypage soit terminé.

3. Extraction et génotypage génomique de l'ADN PCR

1. Faites brièvement tourner les tubes PCR contenant le tampon d'extraction d'ADN et les tissus embryonnaires isolés à l'aide d'une mini-centrifugeuse (p. ex. à 2 680 x g pour 10 s).
2. Pour extraire l'ADN génomique d'embryons uniques, incubez les tubes PCR à 55 oC pendant 3 h. Vortex pendant 30 s toutes les 30 min afin d'assurer la rupture des amas cellulaires et d'améliorer la lyse cellulaire.
3. Incuber les tubes PCR à 95 oC pendant 5 min pour inactiver la protéase K.
4. Gardez les extraits d'ADNc à 4 oC ou sur la glace, et passez immédiatement à PCR.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici en plaçant des extraits d'aDNc dans un congélateur de -20 oC.
5. Configurez une réaction PCR à l'aide de l'ADN g extrait comme modèle pour amplifier le locus génomique d'intérêt.
   1. Si différents allèles au lieu d'intérêt diffèrent en taille de sorte que la différence de taille peut être détectée par électrophoresis gel agarose, concevoir un seul ensemble d'amorces pour amplifier l'ensemble du locus.
   2. Alternativement, utilisez des amorces spécifiques à l'allèle qui génèrent des produits PCR uniquement en présence de l'allèle spécifique; par exemple, en concevant l'amorce qui se lie à une région contenant des mutations d'insertion/suppression.
   3. Utilisez un mélange de réaction PCR typique de 20 mL comme suit : 5 ml d'extraits d'adnas, 8 ml d'eau sans nucléane, 4 ml de tampon PCR, 0,2 mL de 10 mMd, 0,6 mL de DMSO, 1 ml d'apprêt avant de 10 mmm, 1 ml d'amorce inverse de 10 mM , et 0,2 ml de polymérase d'ADN (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Plusieurs amorces peuvent être utilisées dans une réaction PCR. Par exemple, une amorce avant universelle et deux amorces inversées spécifiques à l'allèle peuvent être combinées, tant que les deux amorces inversées sont conçues pour générer des produits PCR de tailles distinctes afin que la présence/absence des deux allèles puisse être sans ambiguïté par électrophoresis de gel (voir la section des résultats représentatifs).
6. Exécuter l'électrophorèse gel agarose pour déterminer la taille et la présence / absence des produits PCR. Ajuster l'état de l'électrophorèse de gel d'agarose (p. ex., pourcentage de gel d'agarose, V/cm, et durée) selon la taille prévue des produits DE PCR.
7. Utilisez les résultats de PCR concernant la taille et la présence/absence des produits PCR pour attribuer un génotype à chaque embryon post-chirurgical. Par exemple, si différents allèles sont censés générer des produits PCR de différentes tailles, utilisez les informations de taille pour attribuer le génotype pour chaque embryon. Si des amorces spécifiques à l'allèle sont utilisées, les données sur la présence ou l'absence de produits PCR devraient être utilisées pour attribuer un génotype à chaque embryon.
8. Trier les embryons selon le génotype.

Résultats

Le génome de Nematostella a un locus unique qui code une protéine précurseur pour le gLWamide neuropeptide. Trois alleles mutants knock-out à ce locus (glw^-a, glw^-b, et glw^-c) ont été précédemment signalés⁵. Quatre mâles hétérozygotes portant un allèle de type sauvage (en) et allèle à élimination bée-c-cau locus gLWamide (génotype : ' ' '^'' ' ' ' ' ...

Discussion

Décrit ici un protocole basé sur PCR pour génotyper un seul embryon d'anémone de mer sans sacrifier l'animal. Après le frai et la dégelée, les œufs fécondés sont autorisés à se développer en gastrulae. La région aboral de chaque embryon de gastrula est enlevée chirurgicalement, et le tissu aboral isolé est employé pour l'extraction génomique suivante d'ADN, tandis que les embryons post-chirurgicaux restants guérissent et continuent le développement. Les extraits de gDNA sont ensuite utilisés pour un ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’