Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.

Résumé

La neuroscience est l’étude de la façon dont les cellules du cerveau médient diverses fonctions. La mesure de l’expression des protéines dans les neurones et la Glia est essentielle pour l’étude des neurosciences car la fonction cellulaire est déterminée par la composition et l’activité des protéines cellulaires. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie peut être combinée avec l’analyse à haute résolution proche infrarouge pour fournir une mesure semi-quantitative de l’expression des protéines dans les régions cérébrales distinctes. Cette technique peut être utilisée pour une expression de protéine simple ou double dans la même région cérébrale. Les protéines de mesure de cette façon peuvent être utilisées pour obtenir un changement relatif dans l’expression des protéines avec une manipulation expérimentale, la signature moléculaire de l’apprentissage et de la mémoire, l’activité dans les voies moléculaires, et l’activité neuronale dans plusieurs régions cérébrales. En utilisant les bonnes protéines et l’analyse statistique, la connectivité fonctionnelle entre les régions cérébrales peut également être déterminée. Étant donné la facilité de mise en œuvre de l’immunocytochimie dans un laboratoire, l’utilisation de l’immunocytochimie avec un balayage à haute résolution à infrarouge proche peut élargir la capacité du neuroscientifique à examiner les processus neurobiologiques au niveau des systèmes.

Introduction

L’étude des neurosciences concerne une enquête sur la façon dont les cellules du cerveau médient les fonctions spécifiques¹. Ceux-ci peuvent être cellulaires dans la nature comme la façon dont les cellules gliales confèrent l’immunité dans le système nerveux central ou peuvent impliquer des expériences qui visent à expliquer comment l’activité des neurones dans l’hippocampe dorsal conduit à la navigation spatiale. Dans un sens large, la fonction cellulaire est déterminée par les protéines qui sont exprimées dans une cellule et l’activité de ces protéines². En conséquence, la mesure de l’expression et/ou de l’activité des protéines dans les cellules cérébrales est essentielle pour l’étude des neurosciences.

Un certain nombre de techniques sont disponibles pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau. Il s’agit notamment de méthodes in vivo telles que la topographie des émissions de positrons pour les densités des récepteurs³ et la micro-dialyse pour les petits peptides⁴. Plus communément, les méthodes ex vivo sont utilisées pour examiner la fonction et l’expression des protéines. Il s’agit notamment de techniques de spectrométrie de masse⁵, de Western Blot et d’immunosorbant enzymatique (ELISA)⁶, et d’immunocytochimie⁷. L’immunocytochimie est largement utilisée dans le domaine des neurosciences. Cette technique implique l’utilisation d’un anticorps primaire pour détecter une protéine (ou un antigène) d’intérêt (p. ex. c-fos) et un anticorps secondaire conjugué pour détecter le complexe d’anticorps protéine-primaire (figure 1). Pour permettre la détection du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine, les anticorps secondaires ont des agents oxydants tels que la peroxydase de raifort (HRP) conjugués à eux. Cela permet la formation de précipités dans les cellules qui peuvent être détectées à l’aide de la microscopie photonique⁷. Les anticorps secondaires peuvent également avoir des substances chimiques fluorescentes conjuguées à elles (c.-à-d. fluorophores). Lorsqu’ils sont stimulés, ces produits chimiques émettent de la lumière, qui peut être utilisé pour détecter les complexes d’anticorps secondaires de protéine-primaire⁷. Enfin, parfois, les anticorps primaires ont des agents réducteurs et des produits chimiques de fluorescence attachés directement à la nécessité d’anticorps secondaires⁷ (figure 1).

Fait intéressant, de nombreuses méthodes d’immunocytochimie permettent la visualisation des protéines dans les cellules du cerveau, mais pas la capacité de quantifier la quantité de protéines dans une cellule spécifique ou une région du cerveau. L’utilisation de la microscopie photonique pour détecter les précipités des réactions de réduction permet de visualiser les neurones et les gliales, mais cette méthode ne peut pas être utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans les cellules ou dans une région cérébrale spécifique. En théorie, la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour cela, parce que la lumière émise par l’anticorps secondaire fluorescent est une mesure du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine. Cependant, l’autofluorescence dans le tissu cérébral peut rendre difficile l’utilisation de la microscopie de fluorescence pour quantifier l’expression des protéines dans le tissu cérébral⁸. Par conséquent, la lumière émise par les images fluorescentes du tissu cérébral est rarement utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans le cerveau.

Beaucoup de ces questions peuvent être abordées en utilisant l’immunocytochimie proche infrarouge en conjonction avec la numérisation à haute résolution^9,10. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie couplée avec les fluorophores dans les spectres d’émission proche infrarouge peut être combinée avec une numérisation à haute résolution (par exemple, 10 – 21 μM) pour obtenir des images nettes qui permettent une quantification semi-quantitative des protéines dans des régions du cerveau.

Protocole

Le protocole suivant a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware. Des rats mâles Sprague Dawley âgés de 55 à 75 jours environ ont été utilisés pour ce protocole.

1. extraction du cerveau et préparation tissulaire

1. Anesthésier le rat avec l’isoflurane dans la chambre d’induction d’anesthésie jusqu’à ce que le rat ne montre plus une réponse au pincement de pied.
2. Sacrifiez les rats par décapitation rapide à l’aide d’une guillotine.
3. Coupez la peau sur le crâne postérieur à antérieur et clair du haut du crâne.
4. Utilisez pinces-gouges pour retirer délicatement la partie arrière du crâne, puis en utilisant de petits ciseaux de dissection coupés vers le bas de la ligne médiane du crâne, poussant vers le haut contre le dessus du crâne en tout temps pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
5. Utilisez pinces-gouges pour décoller à droite et à gauche de la moitié du crâne pour exposer le cerveau.
6. Utilisez une petite spatule pour ramasser sous le cerveau et rompre les nerfs, élever soigneusement le cerveau et geler les cerveaux dans l’isopentane réfrigérée sur de la glace carbonique (au moins-20 ° c). Après cela, rangez les cerveaux dans un congélateur de-80 ° c jusqu’à ce que le tranchage.
7. Couper les cerveaux dans les régions d’intérêt à 30 – 50 μM dans un cryostat maintenu entre-9 ° c et-12 ° c. Montez directement les tranches sur des lames de verre et rangez-les dans un congélateur de-80 ° c jusqu’au moment de l’immunocytochimie.
   Remarque: Dans ce protocole, les régions du cerveau d’intérêt étaient l’hippocampe et l’amygdala.

2. réaction immunohistochimique unique

Remarque: Pour la double réaction immunohistochimique, le protocole est le même que la réaction immunohistochimique unique, sauf que cette réaction a deux anticorps primaires de différents hôtes (par exemple, le lapin et la souris) et deux anticorps secondaires pour les primaires doivent être d’un seul hôte (p. ex., antilapin de chèvre et antisouris de chèvre). Les anticorps secondaires doivent également être de deux spectres différents qui sont disponibles dans les scanners haute résolution. Par exemple, un anticorps secondaire avec un pic de spectre d’émission à 680 nm et un anticorps secondaire 800CW (pic de spectre d’émission à 780 nm).

1. Retirer les lames de verre du congélateur et laisser s’équilibrer à température ambiante pendant 30 min.
2. Sous une hotte, fixer le tissu cérébral dans du paraformaldéhyde à 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M pour 1 − 2 h à température ambiante.
3. Rincer les lames dans une solution saline tamponnée de 0,1 M (TBS) trois fois pendant 10 min chacune. Perméabilize membranes cellulaires en incubant les lames dans un détergent doux (p. ex., 0,01% de détergent) pendant 30 − 60 min.
4. Rincer les lames au TBS trois fois pendant 15 min chacune.
5. Diluer l’anticorps primaire pour la protéine d’intérêt dans le PBS dans la concentration correcte. Par exemple, pour détecter le gène précoce immédiat c-fos, préparez un anticorps anti-c-fos primaire de lapin dans une concentration de 1:500.
6. Pipetter la solution d’anticorps primaire directement sur le tissu cérébral (environ 200 μL par glissière de 3 pouces x 1 pouce).
7. Utiliser des lamelles pour Incuber le tissu cérébral sur des lames de verre dans la dilution primaire d’anticorps pour 1 − 2 h à la température ambiante ou pendant la nuit (~ 17 h) à 4 ° c.
8. Enlevez les lamelles et les lames de lavage dans le SCT qui contient une petite quantité de détergent (p. ex., 0,01% de détergent, «TBS-T») quatre fois pendant 15 min chacune.
9. Utiliser des lamelles pour Incuber les sections cérébrales dans un anticorps secondaire à température ambiante pendant 2 h.
   Remarque: L’anticorps secondaire doit être à la dilution correcte et dans un diluant contenant du SCT, du détergent et 1,5% du sérum hôte. Par exemple, un anticorps secondaire de chèvre dans une dilution de 1:2000 contiendrait 1,5% de sérum de chèvre et 0,05% de détergent.
10. Rincez les lames en TBS-T quatre fois pendant 20 min chacune, puis dans TBS quatre fois pendant 20 min chacune.
11. Lames sèches à température ambiante dans l’obscurité pendant la nuit. Lorsque les diapositives sont sèches, elles sont prêtes pour l’imagerie.

3. l’imagerie

1. Placez les diapositives sur l’interface de balayage proche infrarouge avec le tissu orienté vers le bas. Soit image une diapositive de verre ou plusieurs diapositives à la fois à l’aide d’un outil de sélection.
2. Diapositives d’image utilisant le réglage de la plus haute qualité avec un décalage de 0 nm et une résolution de 21 μm. La numérisation prendra généralement 13 − 19 h en fonction de l’équipement de numérisation utilisé.
3. Importez des images dans le logiciel d’analyse d’image (par exemple, ImageStudio) pour afficher et marquer pour l’analyse des protéines semi-quantitatives.

4. analyse de l’expression protéique

1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’image et sélectionnez la zone de travail dans laquelle l’image a été numérisée.
2. Ouvrez l’image numérisée dans le logiciel d’analyse d’image pour afficher l’analyse et ajustez les longueurs d’onde affichées, ainsi que le contraste, la luminosité et le grossissement affichés sans altérer l’image brute ou l’émission quantifiée totale.
3. Identifiez les régions clés pour la quantification et sélectionnez l’onglet analyse en haut de la page, puis sélectionnez dessiner un rectangle (ou dessiner ellipse/dessiner à main levée) pour tracer un rectangle sur la zone qui sera quantifiée.
4. Pour afficher la taille du rectangle, sélectionnez formes dans le coin inférieur gauche de l’écran, puis sélectionnez colonnes en bas à droite. Ajouter des colonnes Height et Width pour identifier la taille de la forme.
   Remarque: Il est important de contrôler la taille de la forme lors de la comparaison de la quantification. Il est recommandé d’utiliser des formes identiques placées dans l’emplacement de quantification désiré, afin d’obtenir un échantillonnage précis des émissions pour cette région.
5. Nommez ensuite la forme et répétez. Une fois que toutes les régions sont échantillonnées, les données disponibles à partir de l’onglet colonnes peuvent être agrégées et analysées.

Résultats

Avant d’utiliser l’analyse à haute résolution pour l’immunohistochimie, il faut vérifier que le protocole fonctionne. Cela peut être accompli à l’aide d’un test de validation où les sections cérébrales du même animal sont incubées avec des anticorps primaires et secondaires, des anticorps secondaires seuls, ou ni des anticorps primaires ni secondaires. Les résultats d’un tel test de validation sont illustrés à la figure 2. Dans cette ...

Discussion

Les résultats présentés dans cet article montrent que la quasi-infrarouge immunocytochimie en combinaison avec la numérisation à haute résolution peut être utilisé pour obtenir des mesures semi-quantitatives de l’expression des protéines dans le tissu cérébral. Il peut également être utilisé pour étiqueter deux protéines simultanément dans la même région du cerveau. Nous avons déjà utilisé l’immunohistochimie près de l’infrarouge pour mesurer l’expression précoce immédiate des gènes dans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine	Harvard Apparatus	73-1920
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors	Fischer Scientific	08-951-5	used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula	Fischer Scientific	21-401-5	used to scoop out brain
Glass Microscope Slides	Fischer Scientific	12-549-6
Immunohistochemical Reaction
Triton X-100			Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody
Tween-20			Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner	Licor Biotechnology Inc.
Image Studio	Licor Biotechnology Inc.