Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension

Résumé

Nous introduisons une méthode d'enregistrement optique reproductible et stable pour les tranches de cerveau à l'aide de colorant sensible à la tension. L'article décrit la coloration de colorant tension-sensible et l'enregistrement des signaux optiques utilisant les préparations conventionnelles de tranche hippocampal.

Résumé

L'imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau est un outil utile pour évaluer la connectivité fonctionnelle dans les circuits neuronaux. En raison du changement fractionnaire dans le signal lumineux, il a été difficile d'utiliser cette méthode comme un essai quantitatif. Cet article décrit des systèmes spéciaux d'optique et de manipulation de tranches, qui rendent cette technique stable et fiable. Le présent article montre la manipulation de la tranche, la coloration et l'enregistrement des tranches hippocampales tachées de VSD en détail. Le système maintient des conditions physiologiques pendant une longue période, avec une bonne coloration, et empêche les mouvements mécaniques de la tranche pendant les enregistrements. En outre, il permet la coloration des tranches avec une petite quantité de colorant. L'optique atteint une ouverture numérique élevée à faible grossissement, ce qui permet l'enregistrement du signal VSD à la vitesse maximale de 10 kHz, avec une résolution spatiale de 100 pixels x 100 pixels. En raison de la fréquence de trame élevée et de la résolution spatiale, cette technique permet l'application des filtres post-enregistrement qui fournissent un rapport signal-bruit suffisant pour évaluer les changements dans les circuits neuronaux.

Introduction

L'imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau tachées en vrac est devenue un outil quantitatif utile pour évaluer la dynamique des circuits neuronaux^1,2,3^,3 . Après l'analyse des changements dans les propriétés optiques dues à l'excitation de membrane^5,6,7, l'imagerie VSD a été décrite pour la première fois au début des années 1970 par Cohen et d'autres^{6,8, 9}. .; il s'agit d'une méthode appropriée pour surveiller les fonctions cérébrales en temps réel, car le colorant sonde directement les changements potentiels de la membrane (c.-à-d., le signal principal des neurones).

Les premiers VSD possédaient les caractéristiques souhaitables pour comprendre le système cérébral, comme un temps-constant rapide pour suivre la cinétique rapide des événements potentiels de membrane neuronale, et la linéarité avec le changement dans le potentiel de membrane^{9, 10} Ans et plus ^{, 11} Ans, états-unis ( ^{, 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15}. Semblable à d'autres expériences d'imagerie, cette technique nécessite un large éventail de accords spécifiques, tels que les caméras, l'optique, le logiciel et la physiologie des tranches, pour obtenir les résultats souhaités. En raison de ces écueils techniques, les avantages attendus au cours des efforts initiaux ne se sont pas nécessairement matérialisés pour la plupart des laboratoires qui ne se spécialisaient pas dans cette technique.

La cause première de la difficulté technique était la faible sensibilité du VSD vers le changement potentiel de membrane une fois appliqué à la coloration en vrac des préparations de tranche. L'ampleur du signal optique (c.-à-d. le changement fractionnaire de la fluorescence) est habituellement de 10^-4-10^-3 du signal de contrôle (F0) dans des conditions physiologiques. L'échelle temporelle du changement potentiel de membrane dans un neurone est d'environ millisecondes à quelques centaines de millisecondes. Pour mesurer les changements dans le potentiel membranaire du neurone, la caméra utilisée pour l'enregistrement devrait être en mesure d'acquérir des images à grande vitesse (10 kHz à 100 Hz). La faible sensibilité de VSD et la vitesse nécessaire pour suivre le signal neuronal nécessite une grande quantité de lumière à recueillir à la caméra à grande vitesse, avec un rapport signal-bruit élevé (S/N)^2,16.

L'optique du système d'enregistrement est également un élément essentiel pour assurer la collecte de suffisamment de lumière et pour améliorer S /N. Le grossissement réalisé par l'optique est souvent excessivement faible, comme 1X à 10X, pour visualiser un circuit neuronal fonctionnel local. Par exemple, pour visualiser la dynamique du circuit hippocampique, un grossissement d'environ 5 serait approprié. Un tel grossissement faible a une faible efficacité de fluorescence; par conséquent, l'optique avancée serait bénéfique pour un tel enregistrement.

En outre, la physiologie de tranche est également essentielle. Étant donné que l'analyse d'imagerie exige que les tranches soient intactes, une manipulation soigneuse des tranches est nécessaire¹⁷. En outre, les mesures prises pour maintenir la viabilité de la tranche pour une plus longue période sont importantes¹⁸.

Le présent article décrit le protocole pour la préparation des tranches, la coloration VSD, et les mesures. L'article décrit également les améliorations apportées aux VSD, aux appareils d'imagerie et à l'optique, ainsi que d'autres améliorations supplémentaires au système expérimental qui ont permis d'utiliser cette méthode comme un test simple, puissant et quantitatif pour visualiser le modification des fonctions cérébrales^{19,20,21,22,23,24,25}. La technique peut également être largement utilisée pour la potentialisation à long terme dans la zone CA1 des tranches hippocampal¹. En outre, cette technique est également utile dans l'enregistrement optique des potentiels membranaires dans une seule cellule nerveuse²⁶.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Tokushima Bunri. Le protocole suivant pour la préparation des tranches est presque une procédure standard²⁷ , mais les modifications ont été les protocoles de coloration et d'enregistrement avec VSD.

1. Préparation avant le jour de l'expérience

1. Préparer le stock A (tableau 1), stock B (tableau 2), et le stock C ( tableau3) solutions et stocker dans un réfrigérateur.
2. Préparer 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (tableau4, voir l'étape 3) et le conserver au réfrigérateur.
3. Préparer 1 L d'ACSF modifié (tableau 5) et le conserver au réfrigérateur.
4. Distribuer 500 aliquots de sérum bovin fœtal (FBS) dans des flacons de 2 ml et conserver au congélateur.
5. Dissoudre 4 % de la poudre d'agar dans l'ACSF (environ 120 ml) dans un four à micro-ondes et la verser dans un plat De 90 mm jetable Petri. La plaque d'agar doit être réfrigérée avant d'être utilisée.
6. Placer les articles suivants dans un congélateur la veille de l'expérience : un plateau chirurgical, un récipient de trancheur et un bloc de refroidissement en aluminium (120 x 120 x 20 mm³).
7. Assurez-vous qu'il y a suffisamment d'anneaux en plexiglas avec filtres à membrane pour le système de manipulation des tranches^17,28 (voir l'étape 6.12).
8. Dissoudre 2 % de poudre d'agar dans 50 ml de 3 M KCl au micro-ondes. Prenez environ 85 l de la dissoute chaude d'agar-KCl dans 200 pointes de L utilisant une micropipette pour l'électrode d'échouement. Détachez la pointe dans le gel d'agar 3 M KCl encore chaud. Répétez l'étape pour remplir environ 20-40 conseils avec 2% d'agar.

2. Préparation de vsD (di-4-ANEPPS) Solution d'actions

1. Préparer 1 ml de 10% d'huile de ricin polyéthylique à l'eau ultra-pure.
2. Ajouter 1 mL d'éthanol à un flacon de di-4-ANEPPS (5 mg flacon), vortex et sonicate pendant 10 min. La solution se transformera en une couleur rouge foncé avec de petits résidus possibles des cristaux di-4-ANEPPS.
   REMARQUE: L'éthanol utilisé dans cette étape doit être fraîchement ouvert.
3. Transférer la solution sur un microtube de 2 ml avec un anneau O. Faites tourner la solution et ajoutez 500 l de 10 % de solution d'huile de ricin polyéthylilate d'une valeur de 10 %.
   REMARQUE: Le colorant est très lipophile. DMSO et poloxamer peuvent également être utilisés pour dissoudre di-4-ANEPPS, mais en termes de signal optique lors du changement dans le potentiel membranaire, nous avons constaté que l'utilisation de l'éthanol -huile de ricin polyéthyoxylé donne un meilleur rapport signal/bruit. Cela pourrait être lié au taux de transfert de solvant à la membrane cellulaire.
4. Vortex et sonicate jusqu'à ce que le colorant soit complètement dissous.
5. Évitez l'exposition à la lumière et conservez-la au réfrigérateur. Ne pas conserver au congélateur. Le stock peut durer quelques mois.
   REMARQUE: Le jour de l'expérience, suivez les étapes 3-9.

3. Préparation quotidienne de l'ACSF (1 L) (tableau 4)

1. Peser NaCl, NaHCO₃, et le glucose dans un flacon.
2. Ajouter 950 ml d'eau distillée dans le flaconet commencer à bouillonner avec 95 % de gaz co 2 /5 % de CO_2.
3. Ajouter 2,5 ml de bouillon Une solution au flacon et incuber pendant environ 10 min à température ambiante.
4. Ajouter 2,5 ml de résilique C à la fiole.
5. Ajouter de l'eau distillée pour faire la solution à 1 L.

4. Préparation quotidienne de la ssolution VsD Detaining

1. Sonicate une fiole de 500 ll de FBS et VSD stock solution (étape 2) dans un ultra-sonicator pour 5 min.
2. Ajouter 500 l d'ACSF fraîchement préparé dans le flacon de FBS.
3. Ajouter 20 (en cas de souris) ou 40 (en cas de rats) ll de solution de stock VSD au flacon.
4. Ultra-soniéetale et vortex le flacon jusqu'à ce que la solution devienne orange pâle.

5. Préparation pour la chirurgie

1. Prenez 100 ml d'ACSF réfrigéré séparément dans un contenant en acier inoxydable de 300 ml, un bécher de 300 ml et un contenant en plastique, et placez-les dans un congélateur. Verser 150 ml d'ACSF modifié réfrigéré (tableau2) dans un autre bécher et le placer au congélateur. Attendez que les solutions soient refroidies; le temps pris doit être mesuré et déterminé à l'avance.
2. Pliez pour casser une lame de rasoir (acier de carbone, qualité industrielle 0,13 mm d'épaisseur, lame des deux côtés) en deux pour la trancheuse.
   REMARQUE: L'autre moitié peut être utilisée pour la dissection avec un porte-lame approprié.
3. Préparer un bloc de la plaque d'agar ACSF 4% avec un gabarit d'ajustement (Figure 1).
4. Préparer une chambre d'incubation humide (une chambre de type interface; une boîte scellée serrée de 1,2 L modifiée avec un emballage en silicone) pour maintenir les tranches de cerveau physiologiquement vivantes (figure2); ajouter l'ACSF dans un petit récipientet le carbonate avec 95 % de gaz co₂ /5 % et remplir un plat Petri de 90 mm x 20 mm avec de l'ACSF vers le haut.
   REMARQUE: Un plat Petri plus petit (60 mm x 20 mm) doit être placé au centre du plat de 90 mm pour soutenir un papier filtre sur le plat.
5. Placez la boîte sur un appareil chauffant et attendez 20 min pour la réchauffer jusqu'à 28 oC.
6. Ajouter la glace concassée dans le récipient de la trancheuse. Placez les instruments suivants dans une cuve en acier inoxydable (petite) sur la glace : scalpel, porte-lame, pince à épiler, bloc d'agar et stade de trancheur. Gardez l'ACSF congelé et l'ACSF modifié sur la glace et la bulle avec 95% O₂/5% CO₂ gaz (aka. carbogen).
7. Placer les instruments suivants dans une cuve (grande) : ciseaux (grands, petits), pinces, spatule, cuillère et pinces diagonales.

6. Chirurgie (Mice)

1. Anesthésiez la souris à l'aide d'isoflurane dans une hotte à fumée. Évaluer le niveau de l'anesthésie en vérifiant le réflexe de pédale de l'animal sur le pincement des orteils.
2. Décapiter la souris et immerger la tête dans un ACSF glacé dans un plateau chirurgical en acier inoxydable.
3. Extraire le cerveau en 1 min et le placer dans un bécher contenant de l'ACSF réfrigéré pendant 5 min.
4. Sortez le cerveau du bécher et, à l'aide d'un scalpel, coupez le bloc cérébral (Figure 3A).
5. Placez le bloc cérébral sur un bloc d'agar de 4 % (étape 5.3, Figure 3B). Les deux hémisphères peuvent être montés sur un bloc d'agar. Essuyez l'excès d'ACSF du bloc avec un papier filtre.
6. Appliquer un adhésif mince (super colle) sur la table de trancheur. Placez le bloc d'agar sur elle et essuyez l'adhésif excédentaire à l'aide d'un papier filtre.
7. Appliquer délicatement une petite quantité d'ACSF glacé (5 ml) à l'aide d'une pipette du haut du bloc cerveau-agar. Cela aidera à solidifier l'excès de colle super et d'empêcher la colle de couvrir le cerveau et de perturber le tranchage.
8. Fixez la table de trancheur au plateau de trancheur (figure 3C) et versez l'ACSF modifié.
9. Régler la trancheuse à une vitesse lente, avec la fréquence de la lame au maximum.
10. Définir l'épaisseur de la tranche à 350-400 m et commencer à trancher (Figure 3C). Placer les tranches sur le coin du plateau de tranche dans une séquence, de sorte que la profondeur des tranches peut être facilement distinguée. Habituellement, trois à cinq tranches peuvent être obtenues à partir d'un hémisphère.
11. Couper la partie du tronc cérébral à l'aide d'une aiguille de 30 G (Figure 3D).
    REMARQUE: La microchirurgie sur la tranche de cerveau telle qu'une coupure entre la frontière DE CA3-CA1 devrait être faite à ce stade sous un microscope binoculaire, si nécessaire.
12. À l'aide d'un petit pinceau à pointes, placez la tranche au centre du filtre à membrane (0,45 m pores, PTFE-membrane, 13 mm de diamètre) avec l'anneau de plexiglas¹⁷ (15 mm de diamètre extérieur, 11 mm de diamètre intérieur, 1 mm d'épaisseur, Figure 3E). Placez l'anneau dans la chambre de récupération humide (figure 2) et fixez le couvercle pour maintenir la pression intérieure élevée.
    REMARQUE: Les tranches colleront à la membrane dans un délai de 30 minutes et peuvent être manipulées avec les anneaux dans les étapes suivantes dans la chambre d'enregistrement. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des poids ou d'autres mesures pour maintenir la tranche en place.
13. Ajuster la direction et la position de la tranche dans l'anneau pour s'assurer qu'elle est bien centrée et qu'elle a une direction cohérente (voir l'étape 9.3).
14. Laisser le spécimen à 28 oC pendant 30 min, puis à température ambiante pendant au moins 10 à 30 min pour la récupération des tranches.
    REMARQUE: Les tranches peuvent maintenant conserver un bon état physiologique au moins pendant 15 h.

7. Coloration et rinçant des tranches (Mice)

1. Appliquer délicatement 100-110 l de la solution de coloration (étape 4) sur chaque tranche sur l'anneau à l'aide d'une micropipette. Huit à neuf tranches peuvent être tachées avec une solution de coloration préparée à l'étape 4. Laisser les tranches pendant 20 min pour la coloration.
2. Préparer 50-100 ml d'ACSF dans un récipient et y mettre l'anneau avec un spécimen tranché pour rincer la solution de coloration.
3. Conserver la tranche rincée dans une autre chambre d'incubation. Attendez plus de 1 h avant l'expérience.
   REMARQUE: La chambre d'incubation peut être détachée du gaz et déplacée au lieu de l'enregistrement dans un état étanche serré. La tranche peut rester en vie pendant au moins 20 min sans approvisionnement en gaz. Ceci est utile dans le cas où vous avez besoin de déplacer la tranche à un autre endroit pour l'enregistrement.

8. Préparation quotidienne de l'apparatus expérimental

1. Allumez l'amplificateur, l'ordinateur et le système de caméra, et vérifiez que le logiciel est en cours d'exécution.
2. Placer l'ACSF dans un tube de 50 ml et la bulle avec le carbogen.
3. Utilisez une pompe péristtaltique pour faire circuler l'ACSF. Ajuster le débit à environ 1 ml/min.
4. Ajustez la hauteur de la pipette d'aspiration de sorte que le niveau de liquide à l'intérieur de la chambre d'expérience soit toujours constant.
   REMARQUE: Le niveau de la solution est important pour obtenir un enregistrement stable, par conséquent, l'ajustement doit être fait à l'aide d'un micromanipulateur.
5. Installer l'électrode de sol composée de puce jaune remplie de 3 M KCl agar (2%) (étape 1.8) dans un support avec un fil Ag-AgCl avec une petite quantité de 3 M KCl solution.
6. Remplissez une petite quantité d'ACSF (environ deux tiers du volume) dans l'électrode de verre (1 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm de diamètre intérieur tiré avec une pulleuse micropipette) à l'aide d'une pointe jaune tube mince et effilée et placez-la dans le porte-électrode.
7. Fixez le support à la tige installée dans le manipulateur. Assurez-vous à l'aide d'un amplificateur que la résistance à l'électrode est d'environ 1 M.
   REMARQUE: L'électrode large d'ouverture à longue tige (4-8 m d'ouverture) de type patch devrait être bonne pour l'enregistrement sur le terrain et comme une électrode stimulante.

9. Démarrage d'une session d'enregistrement

1. Prendre une tranche de préparation de la chambre humide avec des forceps.
2. Placez rapidement la tranche sur une chambre expérimentale sous le microscope (Figure 4).
3. Poussez fermement le bord de l'anneau dans l'anneau O en silicone. Veillez à ne pas casser la membrane ou le fond de la chambre d'expérience.
   REMARQUE: La direction de la tranche doit être prise en considération en ce qui concerne la direction des électrodes stimulantes et d'enregistrement dans le champ de vision. La tranche saine doit coller au filtre à membrane de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser d'autres dispositifs pour fixer les tranches telles que les poids et les mailles de nylon.
4. Placez la pointe de l'électrode stimulante et l'électrode d'enregistrement potentielle sur le champ sur la tranche sous le microscope avec la lumière transmise.
5. Utilisez le système d'enregistrement électrophysiologique pour vérifier la réponse. Confirmer l'enregistrement électrophysiologique habituel (non taché) avec une configuration donnée.
   REMARQUE: L'électrode d'enregistrement peut être omise mais est utile pour vérifier la physiologie de la tranche.
6. Ajustez l'intensité lumineuse d'excitation à environ 70-80% de la capacité maximale à la caméra qui correspond à 13-15 mW/cm² au spécimen lors de l'échantillonnage à 10 kHz avec la lentille objective d'immersion d'eau 5x et la lentille de tube aPO 1x PLAN. La longueur d'onde de lumière d'excitation est 530 nm, et le filtre d'émission doit être 'gt; 590 nm.
   REMARQUE: Utilisez un obturateur pour minimiser la quantité de lumière d'excitation. L'exposition continue à la lumière peut détériorer la physiologie de la tranche. L'effet nocif possible de la lumière dépend de l'intensité et de la durée de la lumière. Utilisez l'enregistrement électrophysiologique pour juger de l'effet de la lumière. Dans le cas de la force de 13-15 mW/cm^2,environ 1 s l'exposition devrait être la limite supérieure de la tolérance.
7. Ajuster la mise au point avec le système d'acquisition en utilisant la source de lumière fluorescente parce que la mise au point peut être différente en fonction de la longueur d'onde et commencer l'acquisition.
8. Examinez les données dans un logiciel d'acquisition d'images.
   REMARQUE: Nous avons utilisé un ensemble original de microprogrammation de logiciels d'analyse numérique pour une analyse détaillée.

Résultats

La figure 5 montre le signal optique représentatif lors de la stimulation électrique de la garantie Schaffer dans la zone CA1 d'une tranche hippocampal de souris. Les images consécutives de la figure 5A montrent le signal optique avant l'application de filtres spatiaux et temporels, tandis que la figure 5B montre les mêmes données après l'application d'un filtre cubique 5 x 5 x 5 (une convoluti...

Discussion

La physiologie de la tranche est essentielle pour recueillir le bon signal. L'utilisation du système de filtre à membrane d'anneau dans ce protocole garantit que la tranche reste saine et non déformée tout au long de la procédure^2,16,17. D'autres systèmes peuvent être utilisés pour conserver la physiologie des tranches pendant l'enregistrement, mais la tranche ne doit pas se déformer à tout moment que l'imagerie a beso...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
High speed image acquisition system	Brainvision co. Ltd.	MiCAM - Ultima	Imaging system
High speed image acquisition system	Brainvision co. Ltd.	MiCAM 02	Imaging system
Macroscepe for wide field imaging	Brainvision co. Ltd.	THT macroscope	macroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer	Brainvision co. Ltd.	LEX-2G	LED illumination
Image acquisition software	Brainvision co. Ltd.	BV-ana	image acquisition software
Multifunctional electric stimulator	Brainvision co. Ltd.	ESTM-8	Stimulus isolator+AD/DA converter
Slicer	Leica	VT-1200S	slicer
Slicer	Leica	VT-1000	slicer
Blade for slicer	Feather Safety Razor Co., Ltd.	#99027	carbon steel razor blade
Membrane filter for slice support	Merk Millipore Ltd., MA, USA	Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,	membrane filter/0.45 13
Numerical analysis software	Wavemetrics Inc., OR, USA	IgorPro	analysing software
Stimulation isolator	WPI Inc.	A395	Stimulus isolator
AD/DA converter	Instrutech	ITC-18	AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	catalog number: D-1199	VSD: Di-4-ANEPPS
Poloxamer	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Pluronic F-127 P30000MP	poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oil	Sigma-Aldrich	Cremophor EL C5135	polyethoxylated castor oil