Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

Résumé

Les expériences de microréseau de liaison protéique (PBM) combinées à des essais biochimiques relient les propriétés de liaison et catalytiques de la primase de l'ADN, une enzyme qui synthétise les amorces d'ARN sur l'ADN modèle. Cette méthode, désignée comme profilage primase à haut débit (HTPP), peut être utilisée pour révéler les modèles de liaison de l'ADN d'une variété d'enzymes.

Résumé

La primase d'ADN synthétise les amorces courtes d'ARN qui initient la synthèse d'ADN des fragments d'Okazaki sur le brin lanel par la polymérase d'ADN pendant la réplication d'ADN. La liaison des primases procaryotes de DnaG-comme à l'ADN se produit à une séquence spécifique de reconnaissance de trinucleotide. C'est une étape charnière dans la formation des fragments d'Okazaki. Les outils biochimiques conventionnels qui sont utilisés pour déterminer la séquence de reconnaissance de l'ADN de la primase de l'ADN ne fournissent que des informations limitées. À l'aide d'un test de liaison à haut débit à base de microarray et d'analyses biochimiques consécutives, il a été démontré que 1) le contexte de liaison spécifique (séquences de liaison du site de reconnaissance) influence la force de liaison de la primase de l'ADN à son modèle L'ADN, et 2) la liaison plus forte de primase à l'ADN donne des amorces plus longues d'ARN, indiquant une plus grande processivité de l'enzyme. Cette méthode combine PBM et primase activity test et est désigné comme profilage primase à haut débit (HTPP), et il permet la caractérisation de la reconnaissance de séquence spécifique par primase de l'ADN dans un temps et une évolutivité sans précédent.

Introduction

Le HTPP utilise la technologie de microréseau de liaison de l'ADN combinée à l'analyse biochimique (Figure 1) pour identifier statistiquement les caractéristiques spécifiques des modèles d'ADN qui affectent l'activité enzymatique de la primase de l'ADN. Par conséquent, HTPP fournit une plate-forme technologique qui facilite un saut de connaissances dans le domaine. Les outils classiques utilisés pour déterminer les sites de reconnaissance primase n'ont pas la capacité de produire une quantité massive de données, alors que le PTDH le fait.

LE PBM est une technique couramment utilisée pour déterminer les préférences de liaison des facteurs de transcription à l'ADN^1,2; cependant, il n'est pas approprié pour la détection de la liaison faible/transitoire des protéines à l'ADN. Contrairement au PBM universel qui fournit des informations sur la spécificité moyenne de liaison des protéines à toutes les séquences possibles composées de huit paires de base, HTPP est basé sur la bibliothèque de modèles d'ADN à brin unique comprenant des éléments de séquence uniques. Ces éléments de séquence d'ADN impliquent des dizaines de milliers de séquences génomiques courtes (quelques dizaines de bp), ainsi que des séquences d'ADN conçues par calcul enrichies dans certains éléments de séquence répétitive d'ADN présents dans le génome, qui possèdent un contenu moyen différent de GC . Une telle approche à haut débit permet de déterminer, de manière systématique, quantitative et hypothétique, les propriétés liées à la séquence qui sont importantes pour la liaison primase et son activité enzymatique³. En particulier, le lien important entre les préférences de liaison primase-ADN (modulées par des séquences d'ADN flanquant des sites de liaison trinucléotides spécifiques) et la processivité primase a été identifiée pour ce système enzymatique⁴.

La nouvelle technologie a été appliquée pour revoir notre compréhension des sites de reconnaissance primase, même pour la primase de l'ADN T7 qui a fait l'objet d'études approfondies⁵. Plus précisément, le réexamen de concepts classiques, tels que les sites de reconnaissance de l'ADN de primase de l'ADN T7 (qui ont été déterminés il y a près de quatre décennies ⁶) à l'aide d'un microréseau liant protéine-ADN (PBM) a permis d'obtenir un aperçu sans précédent des caractéristiques liées aux la séquence de flanc de ces sites de reconnaissance³. On s'attendait à ce que les séquences flanquant le site de reconnaissance trinucléotide de la primase d'ADN T7 (5'-GTC-3') soient aléatoires. Au lieu de cela, nous avons constaté que les séquences de flanc TG-riches augmentent les chances de primase d'ADN de T7 pour synthétiser des amorces plus longues d'ARN indiquant une augmentation de processivity.

D'autres méthodes qui peuvent être utilisées pour étudier les propriétés de liaison de l'ADN des protéines in vitro comprennent l'analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA)⁷, DNase I empreinte⁸, résonance de surface-plasmon (SPR)⁹, et le sud-ouest ballonnement ¹⁰. Il s'agit toutefois de méthodes à faible débit qui ne s'appliquent qu'à l'étude d'un petit nombre de séquences d'ADN. De plus, la précision et la sensibilité de certaines de ces techniques (p. ex., EMSA) sont faibles. D'autre part, la sélection in vitro¹¹ est une technique qui, tout comme PBM, peut être utilisée pour l'identification de nombreuses séquences de liaison. Cependant, les séquences de faible affinité sont généralement exclues dans la plupart des applications de la sélection in vitro; par conséquent, cette approche n'est pas adaptée pour obtenir des données comparatives de liaison pour toutes les séquences disponibles. Le PBM^1,2 universel est principalement utilisé pour caractériser les spécificités de liaison des facteurs de transcription des procaryotes et des eucaryotes ainsi que des facteurs spécifiques (par exemple, la présence de certains ligands, cofacteurs, etc.) qui peuvent affecter cette interaction¹².

HTPP étend l'application PBM aux enzymes de traitement de l'ADN en combinant une puissance statistique à haut débit sans précédent avec une grande précision pour fournir des informations sur le contexte de séquence de liaison. Ces données n'ont pas encore été obtenues pour les primases et les enzymes connexes (qui ont une liaison faible/transitoire à l'ADN) en raison des limitations techniques susmentionnées d'autres techniques disponibles.

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Protocole

1. Conception du microarray

REMARQUE : Les sondes d'ADN représentent des séquences personnalisées de 36 nucléotides, composées du site de reconnaissance de la primase de l'ADN T7 (GTC) situé entre deux régions à flanc variable, suivie d'une séquence constante de 24 nucléotides attachée à une diapositive de verre³. Nous avons utilisé un format de microarray de 4 x 180 000, qui permettait de repérer chaque séquence d'ADN en six répliques, distribuées au hasard sur la diapositive.

1. Conception de la bibliothèque d'ADN pour primases avec des séquences de reconnaissance connues
   1. Assurez-vous que chaque séquence est composée de 60 nucléotides. Gardez les 24 premiers nucléotides constants (à attacher à la glissière de verre). Les régions variables devraient avoir la forme générale suivante : (N)₁₆GTC(N)₁₇; où N représente n'importe quel nucléotide désiré.
   2. Concevoir la région de flanc pour répondre à une question scientifique spécifique (un exemple de la conception est présenté dans le texte suivant). Les régions de flanc peuvent être conçues pour contenir des caractéristiques spécifiques telles que les éléments répétitifs ou la symétrie spécifique.
      REMARQUE : Nous avons créé huit catégories de séquences de flancs différentes composées de deux ou trois nucléotides spécifiques : T et G (groupe 1); T et C (groupe 2); C et A (groupe 3); A et G (groupe 4); G, C et T (groupe 5); C, T et A (groupe 6); G, A et T (groupe 7); G, A et C (groupe 8). 2 000 séquences différentes ont été conçues pour chaque groupe. Chaque groupe avait des sous-groupes de séquences avec différents types et différents nombres de répétitions de séquences.
   3. Inclure un ensemble de séquences de contrôle négatives (sans le site de liaison spécifique)⁴. La présence de telles séquences permet de valider l'occurrence d'une liaison spécifique dans l'expérience.
2. Conception de la bibliothèque d'ADN pour primases avec des séquences de reconnaissance inconnues
   1. Si la séquence de reconnaissance est inconnue, créez la bibliothèque d'ADN en sélectionnant les séquences (avec ou sans caractéristiques spécifiques mentionnées précédemment) à partir du génome de l'organisme désiré (bactéries, champignons, etc.).
3. Conception de la diapositive de microarray
   1. Achetez des diapositives personnalisées (p. ex., 4x180K, AMADID #78366) auprès d'un fournisseur commercial (pour plus de détails voir Tableau des matériaux). Commandez chaque séquence en six répliques, où chaque réplique doit être fixée à un endroit choisi au hasard sur la diapositive.

2. Expérience de liaison d'ADN Primase

REMARQUE : La veille (ou au moins 2 h avant) le PBM, préparez la solution de blocage [2 % de lait écrémé w/v en tampon de phosphate saline (PBS)] et remuez-le sur un agitateur magnétique. Avant d'utiliser, filtrez la solution à l'utilisation d'un filtre de 0,45 M. Pour détecter la liaison primase aux brins d'ADN, plusieurs étapes doivent être effectuées dans l'ordre suivant.

1. Procédure de blocage
   1. Prémouiller la diapositive microarray dans un bocal Coplin avec 0,01% v/v Triton X-100 en PBS (5 min à 125 tr/min sur un rotateur de laboratoire).
   2. Laver brièvement la glissière du joint (aussi appelée lame de couverture) avec de l'eau et de l'éthanol et sécher à l'air comprimé.
   3. Assembler la partie inférieure de la chambre d'hybridation en acier (chambre PBM) avec la glissière du joint vers le haut (étiquette commerciale face vers le haut). Pour plus de détails concernant l'assemblage, consultez la Table des Matériaux.
   4. Solution de blocage de pipet (2% w/v lait écrémé en PBS) dans chaque chambre.
   5. Retirez la diapositive de microarray du pot De Coplin, puis séchez le côté non-ADN (l'ADN doit être du même côté que l'étiquette de l'entreprise) et les bords à l'aide d'une lingette fine. Placez lentement le microarray sur la glissière du joint, en évitant les bulles (étiquette de l'entreprise vers le bas). Assembler et resserrer immédiatement l'appareil de chambre de chambre d'hybridation en acier. Incuber pendant 1 h à température ambiante (RT).
   6. Remplir un plat de coloration (le plat "PBS") avec 800 ml de PBS frais. Remplir un deuxième plat de coloration (le plat "WASH") de 800 ml de 0,5% v/v Tween-20 en PBS.
   7. Dévisser la chambre PBM et enlever le microarray slide-coverslip "sandwich", en prenant soin de ne pas casser le joint. Démontez-le sous l'eau dans le plat WASH en plaçant des forceps entre la glissière et la glissière.
   8. Secouez la glissière de microarray sous l'eau et transférez rapidement dans un bocal Coplin.
   9. Laver une fois avec 0,1% v/v Tween-20 en PBS (5 min à 125 tr/min sur un rotateur de laboratoire).
   10. Laver une fois avec 0,01% v/v Triton X-100 en PBS (2 min à 125 tr/min sur un rotateur de laboratoire).
   11. Transférez rapidement la diapositive dans un bocal Coplin contenant du PBS.
2. Liaison protéinée
   1. Assembler la chambre PBM telle qu'elle a été décrite précédemment (étapes 2.1.2-2.1.3).
   2. Mélange de liaison de protéine de Pipette contenant 5 Primase d'ADN T7 de M, 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl₂, 30 mM K-glutamate, 6 mM dithiothreitol (DTT), 65 M ribonucleoside triphosphate (rNTP), 2% w/v lait écrémé, 100 ng/L album de sérum bovin (BSA), 50 ng/L le saumon teste l'ADN, et 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) dans chaque chambre de la glissière du joint (sans toucher les côtés en caoutchouc et sans introduire de bulles).
   3. Rincer brièvement la glissière microarray en la trempant dans le plat PBS, qui élimine l'excès de détergent de la surface des glissières. Essuyez les surfaces non-ADN de la glissière avec une lingette fine.
   4. Abaissez lentement la glissière de microarray (face vers le bas) sur la glissière de joint, en prenant soin d'éviter les fuites d'une chambre à l'autre. Assembler et serrer immédiatement l'appareil de chambre PBM sans introduire de bulles. Si des bulles se forment, elles peuvent être enlevées en tapant doucement la chambre en acier contre une surface dure.
   5. Incuber 30 min à température ambiante (RT).
3. Attachement fluorescent d'anticorps
   1. Dévisser la chambre PBM et enlever le microarray slide-coverslip "sandwich", en prenant soin de ne pas casser le joint. Démontez sous l'eau dans le plat WASH à l'aide de forceps. Secouez la glissière sous l'eau et transférez rapidement dans un bocal Coplin contenant du PBS.
   2. Assembler la chambre PBM avec la glissière de joint comme décrit précédemment (étapes 2.1.2-2.1.3).
   3. Ajouter l'anticorps anti-son conjugué Alexa 488 (10 ng/L dans un tampon de liaison) à la glissière du joint.
   4. Rincez brièvement la diapositive en la trempant dans le plat PBS comme avant, puis retirez la diapositive de PBS lentement, essuyez la surface non-ADN et placez-la vers le bas sur la glissière de joint.
   5. Incuber 30 min à RT dans l'obscurité (la sonde de fluorescence est sensible à la lumière) pour réduire le blanchiment photo.
   6. Démonter la chambre PBM et le bordereau comme avant, en enlevant la couverture sous l'eau dans le plat WASH.
   7. Rincer brièvement les diapositives en les trempant dans le plat PBS. Séchez les glissières avec de l'air comprimé. Conserver dans l'obscurité dans une boîte à diapositives jusqu'à ce qu'il soit prêt à scanner.
4. Numérisation de la diapositive microarray
   1. Scanner la puce à l'aide d'un scanner à microréseau (voir Table of Materials)avec une excitation de 495 nm et une émission de 519 nm et recueillir l'intensité médiane de la fluorescence.

3. Analyse des données microarray

REMARQUE : Tout le traitement des données a été effectué à l'aide de scripts écrits personnalisés dans MATLAB.

1. Effectuer le traitement initial des données PBM à l'aide de wilcoxon rank sum test p-value tel que décrit précédemment⁴.
2. Utilisez la valeur médiane de l'intensité de liaison pour chaque séquence d'ADN pour une analyse plus approfondie.
3. Ensuite, à l'aide des p-values ANOVA à sens unique, comparez la signification statistique des différences observées dans les intensités de liaison primase-ADN obtenues pour différents groupes de sondes d'ADN, comme expliqué ci-dessus dans la section de conception de la bibliothèque d'ADN³.

4. La synthèse d'ARN dirigée par template catalysée par la primase d'ADN de T7

1. Préparation du gel polyacrylamide dénaturant
   1. Pour préparer 100 ml de mélange de gel, mélanger 62,5 ml d'acrylamide-bisacrylamide (19:1), 42 g d'urée, 1,1 g de base De Tris (2-Amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol), 0,55 g d'acide borique, et 0,4 mL de 0,5 M d'acide éthylènetetacetic (EDTA).
   2. Diviser le mélange en aliquots de 14 ml (la quantité nécessaire pour un gel de 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) et les protéger de la lumière à 4 oC pendant un mois maximum.
   3. Pour préparer un gel polyacrylamide dénaturant, ajoutez 4 L de TEMED et 40 L de 10% w/v ammonium persulfate à 14 ml du mélange préalablement préparé, jetez-le, et laissez-le polymériser pendant au moins 2 h à RT. Le gel peut être conservé pendant une journée à 4 oC.
2. Préparation de l'échantillon
   REMARQUE : Conservez les réactifs, le mélange de réaction et les échantillons sur la glace.
   1. Pour préparer le mélange de réaction requis pour dix réactions, combinez 11 l de tampon d'activité 5x (200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM de glutamate de potassium, 50 mMg MgCl₂), 5,5 mL de mélange de 2,5 mM de tri-phosphate nucléotide (NTP), et 5,5 ML de ribonucleotide radiolabelté [p. ex., ATP, (-32P) 3000 Ci/mmol].
      REMARQUE : Tous les montants ont été augmentés de 10 % en raison d'éventuelles erreurs de tuyauterie. Les ribonucléotides radio-étiquetés doivent être dilués en fonction de la force du signal radioactif (la dilution initiale est habituellement de 1:10 ou plus).
   2. Transférer 2 ll du mélange de réaction dans dix tubes PCR.
   3. Ajouter 1 l de 100 M de modèle d'ADN au tube PCR correspondant et faire tourner vers le bas.
   4. Ajouter 2 'L de 16 'M T7 ADN primase, spin down, mélanger doucement, et spin vers le bas à nouveau.
   5. Incuber la réaction à RT pendant 20 min.
   6. Arrêtez la réaction en ajoutant 5 ll de solution d'étanchéité (95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% w/v xylene cyanol et bleu bromophenol), mélanger, et spin vers le bas.
3. Séparation des produits à ARN par électrophorèse par dénaturation du gel polyacrylamide et détection subséquente du signal
   1. Pré-exécuter le gel pendant 1 h (10 mA, 600 V) en tampon 1x TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).
   2. Chargez jusqu'à 2 L de chaque échantillon et effectuez une électrophorèse (20 mA, 1100 V) dans un tampon 1x TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).
   3. Sécher le gel pendant 2 h à 80 oC sous vide.
   4. Exposez la plaque d'imagerie au phosphore au gel radioactif pendant quelques heures jusqu'à la nuit, selon la force du signal radioactif.
   5. Enregistrez le signal (luminescence photostimulée) à l'aide de phosphorimager (voir Tableau des matériaux).

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Résultats

Cette avancée technologique pour cartographier les sites de liaison primase permet d'obtenir des propriétés de liaison d'ADN difficiles, voire impossibles, à observer à l'aide d'outils classiques. Plus important encore, hTPP permet de revisiter la compréhension traditionnelle des sites de liaison primase. Plus précisément, hTPP révèle des spécificités contraignantes en plus des séquences de reconnaissance connues de 5'-GTC-3', ce qui conduit à des changements dans les activi...

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Discussion

La méthode PBM a été largement utilisée pour étudier les propriétés de liaison des facteurs de transcription et peut également être appliquée aux enzymes de traitement de l'ADN, telles que la primase de l'ADN, qui se lient à l'ADN avec une faible affinité. Cependant, certaines modifications des procédures expérimentales sont nécessaires. L'expérience de microarray comporte plusieurs étapes : conception de la bibliothèque d'ADN, préparation de la puce, liaison de la cible protéique, étiquetage fluores...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution	Merck	1006401000
95% formamide	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody	Qiagen	35310
Ammonuium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
Boric acid, granular	Glentham Life Sciences	GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA)	Roche	10735094001
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA microarray	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	If several slides are used
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63064-500G
Microarray Hybridization Chamber	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A)	Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Potassium glutamate	Alfa Aesar	A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S
Salmon testes DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Skim milk powder	Sigma-Aldrich	70166-500G
Staining dish	Thermo Scientific	12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Urea	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Xylene cyanol	Alfa Aesar	B21530